二十碳五烯酸對高果糖誘導的胰島素抵抗大鼠骨骼肌GLUT4和p-Akt表達的影響

斯日古楞 郝丹丹 李天柱 烏英嘎 田慧敏 張鳳寧 白春英 瑞云

摘 要：目的：探討二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid， EPA）對高果糖誘導的胰島素抵抗大鼠中骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transporter 4， GLUT4）和蛋白激酶B（protein kinaze B， Akt）表達的作用。方法：將大鼠隨機分為對照組（CON）、高果糖組（HF）和高果糖+EPA組（HF+EPA）。EPA組為高果糖飼料添加6%的EPA。EPA攝入4周后，分別檢測各組大鼠空腹血糖（FBG）、空腹血清胰島素（FIns）及計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），研究EPA對胰島素敏感性的作用。采用Western Blot方法檢測骨骼肌GLUT4和p-Akt的表達。結果：與CON組比較，HF組睪丸周圍脂肪濕重顯著升高（P<0.05）;與HF組比較，HF+EPA組睪丸周圍脂肪濕重顯著降低（P<0.05）。與CON組比較，HF組FBG、FIns、HOMA-IR均顯著升高（P<0.05）;與HF組比較，HF+EPA組FBG、FIns、HOMA-IR均顯著降低（P<0.05）。與CON組比較，HF組骨骼肌GLUT4和p-Akt表達顯著減少（P<0.05）;與HF組比較，HF+EPA組骨骼肌GLUT4和p-Akt表達顯著增加（P<0.05）。結論：EPA能夠顯著改善高果糖誘導的骨骼肌胰島素抵抗，機制涉及EPA能上調(diào)骨骼肌GLUT4和p-Akt的表達，調(diào)控胰島素信號分子蛋白表達，從而改善骨骼肌胰島素抵抗。

關鍵詞：二十碳五烯酸;胰島素抵抗;GLUT4;Akt

中圖分類號：R587.1? 文獻標識碼：A? 文章編號：1673-260X（2022）03-0028-03

胰島素抵抗（Insulin resistance， IR）是指機體靶器官、靶組織對生理濃度的胰島素生物效應的反應性下降或喪失而產(chǎn)生的病理狀態(tài)[1]。骨骼肌是利用葡萄糖和維持血糖平衡的重要組織，發(fā)生胰島素抵抗的主要部位。在骨骼肌細胞中，在胰島素的信號刺激下，骨骼肌中的葡萄糖攝取主要葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transporter 4， GLUT4）的介導，胰島素與其受體結合，激活蛋白激酶B（protein kinaze B， Akt）分子，從而改變GLUT4的轉(zhuǎn)位和利用，促進骨骼肌的葡萄糖攝取[2]。胰島素信號轉(zhuǎn)導障礙是IR發(fā)生的主要機制之一。二十碳五烯酸（又稱十二碳五烯酸，eicosapentaenoic acid，EPA）是一種n-3系列多不飽和脂肪酸（n-3 PUFAs），具有降低心血管疾病風險、減少血中中性脂肪值、緩和炎癥性疾病的癥狀等作用[3-5]。由胰島素抵抗的改善是n-3 PUFAs的生物效應引起的疾病預防主要機制之一。目前未報到EPA攝入對高果糖誘導大鼠骨骼肌胰島素抵抗的作用。本研究選擇胰島素抵抗大鼠，觀察EPA對其骨骼肌組織中GLUT4和p-Akt表達的影響及其作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

Wistar大鼠24只（雄性，體重220～230g）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。將大鼠在恒溫（23±2℃）的實驗室飼養(yǎng)，自由飲食、飲水，明暗交替時間12h/12h。

1.1.2 主要試劑

二十碳五烯酸（純度98%）購自上海源葉生物科技有限公司;D-果糖購自上海生工生物工程有限公司;胰島素放射免疫試劑盒購自上海滬峰生物科技有限公司;GLUT4抗體、Akt抗體購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組和模型制造

適應飼養(yǎng)1周，將大鼠隨機分為3組，即對照組（CON）、高果糖組（HF）和高果糖+EPA組（HF+EPA），每組8只。對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，HF組給予高果糖飼料喂養(yǎng)，HF+EPA組給予高果糖飼料添加6%的EPA喂養(yǎng)。每周稱體重1次。4周高果糖飼料喂養(yǎng)建立胰島素抵抗模型[6]。

1.2.2 標本采集

EPA攝入4周后，將各組大鼠放入代謝籠禁食、禁水12h，尾靜脈取血待測;腹主動脈取血，以3000r/min離心20min，分離血清，-20℃保存待測。斷頸處死大鼠，解剖取骨骼肌樣本，-80℃凍存待測;同時取睪丸周圍脂肪組織，測量濕重。

1.2.3 測定空腹血糖、血清胰島素

EPA攝入4周后，將各組大鼠放入代謝籠禁食、禁水12h，血清標本采集，次日采用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖（FBG）、放免法測定血液中胰島素（FIns）的濃度。具體按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 計算胰島素抵抗指數(shù)

使用穩(wěn)態(tài)模型（HOMA）評估胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）[7]。HOMA-IR模型公式為HOMA-IR =FBG（mg/dl）×FIns（ng/ml）/22.5。

1.2.5 檢測GLUT4和p-Akt表達

采用Western blot檢測GLUT4、Akt1/2和p-Akt，方法進行[8]。使用SDS-PAGE分離了10μg來自肌肉的蛋白質(zhì)提取物，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉鹽緩沖液（TBS）封閉1h后，將膜與1：1000稀釋的一抗在4°C振蕩孵育過夜。然后TBS-T洗三次，并與1：1000加入辣根過氧化物標記相應的二抗在室溫下震蕩孵育1h，TBS洗三次。使用ECL試劑盒進行熒光顯示反應。暗室中曝光，顯影，使用Image-J軟件進行分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）的形式表示。應用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較單因素方差分析，P<0.05為有顯著差異。

2 結果

2.1 各組大鼠體重、睪丸脂肪組織濕重比較

EPA攝入4周后，各組之間體重無明顯差異（P>0.05）。與CON組比較，HF組睪丸周圍脂肪組織濕重顯著升高（P<0.05）;與HF組比較，HF+EPA組睪丸周圍脂肪組織濕重顯著降低（P<0.05），如表1所示。

2.2 各組大鼠空腹血糖（FBG）、胰島素（FIns）、胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）的比較

EPA攝入4周后，與CON組比較，HF組FBG、FIns均顯著增加（P<0.05）;與HF組比較，HF+EPA組FBG、FIns均顯著減少（P<0.05）。與CON組比較，HF組HOMA-IR顯著升高（P<0.05）;與HF組比較，HF+EPA組HOMA-IR顯著降低（P<0.05），如表2所示。

2.3 各組大鼠GLUT4和p-Akt表達的比較

EPA攝入4周后，各組之間Akt1/2蛋白表達無明顯差異。與CON組比較，HF組骨骼肌組織中GLUT4、p-Akt的表達量顯著減少（P<0.05）。與HF組比較，HF+EPA組骨骼肌組織中GLUT4、p-Akt的表達量顯著增加（P<0.05），如表3和圖1所示。

3 討論

目前，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，生活方式的改變，尤其是果糖大量攝入導致肥胖、2型糖尿病等疾病已成為全球人們的健康問題。這些疾病的最主要病理生理機制是胰島素抵抗（IR）。如果機體胰島素分泌障礙，胰島素信號通路異常，會導致葡萄糖轉(zhuǎn)運和利用降低，誘導IR的發(fā)生[9]。胰島素的主要信號通路是PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導途徑。研究表明，IR使胰島素刺激引起的PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導途徑發(fā)生障礙，骨骼肌對血糖的吸收減弱[10]。GLUT4能在胰島素刺激下使骨骼肌攝取葡萄糖。PI3K激活Akt后，通過GLUT4分子促進葡萄糖的利用，從而發(fā)揮胰島素代謝調(diào)節(jié)作用。在胰島素和運動的刺激下，GLUT4從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)位至細胞膜上，膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運中起到作用[11，12]。因此，GLUT4和p-Akt表達是改善IR的關鍵環(huán)節(jié)之一。

近期研究發(fā)現(xiàn)，高果糖誘導的動物模型中n-3 PUFAs防止高果糖引起的胰島素敏感組織的脂肪酸譜變化，從而改善IR[13]。糖尿病模型中，n-3 PUFAs之一的EPA可改變胰島素信號轉(zhuǎn)導通路，使骨骼肌中GLUT4的表達增加[14]。但EPA對高果糖引起的IR大鼠骨骼肌中GLUT4和p-Akt的作用仍未報道。本研究用高果糖喂養(yǎng)的大鼠建立胰島素抵抗模型，并進行EPA攝入方式。研究結果表明，各組大鼠體重無顯著差異，但HF組睪丸周圍脂肪濕重、FGB、FIns、HOMA-IR均升高，表明高果糖誘導的IR模型建立成功;EPA攝入后，睪丸周圍脂肪濕重、FGB、FIns、HOMA-IR均降低。這些結果表明EPA能改善高果糖誘導的IR。Western Blot結果顯示，HF組中骨骼肌GLUT4表達水平減少，表明高果糖攝入使葡萄糖轉(zhuǎn)運和利用下降;EPA攝入后，骨骼肌GLUT4表達水平顯著增加，表明EPA明顯改善葡萄糖轉(zhuǎn)運和利用。為了進一步觀察EPA改善IR大鼠骨骼肌GLUT4的表達，是否與胰島素信號傳導通路相關。檢測胰島素信號中的分子p-Akt的表達水平。與GLUT4的結果一致，IR大鼠EPA攝入后骨骼肌p-Akt明顯上調(diào)。提示EPA可上調(diào)PI3K/Akt信號通路，通過GLUT4分子促進葡萄糖的轉(zhuǎn)運和利用，改善胰島素抵抗。

綜上所述，高果糖誘導的大鼠產(chǎn)生IR，并存在骨骼肌組織胰島素信號通路異常。EPA可能上調(diào)骨骼肌GLUT4和p-Akt的表達，調(diào)控胰島素信號分子蛋白表達，從而改善骨骼肌胰島素抵抗。

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