蜂毒肽與CT?DNA的相互作用

張文龍 胡穎媛 王穎莉 李 睿 李建麗 楊斌盛

(1山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，晉中 030619)

(2山西大學(xué)分子科學(xué)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030006)

蜂毒肽(Mel)是蜂毒的主要活性成分，包含26個(gè)氨基酸殘基(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ)，具有兩親性[1?2]，氨基端主要由疏水氨基酸殘基(resi?dues 1?20)組成，而羧基端則由大部分親水氨基酸殘基(residues 21?26)構(gòu)成。在生理pH條件下，羧基端4個(gè)正電殘基(KRKR)及Lys7使得Mel帶5個(gè)正電荷。在水溶液中，低濃度(μmol·L?1)的Mel作為單體以無規(guī)卷曲狀態(tài)存在[3]；高濃度(mmol·L?1)或在高鹽溶液中，Mel形成四聚體以α?helix狀態(tài)存在[3]；在磷脂雙分子層中，Mel作為單體以α?helix狀態(tài)存在[4]。其α?helix結(jié)構(gòu)如圖1所示。Mel通過各種構(gòu)象以不同方式調(diào)節(jié)其活性，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞。

圖1 Mel(PDB∶2MLT)的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of Mel(PDB∶2MLT)

作為抗菌肽，Mel由于可以與細(xì)胞內(nèi)多種成分反應(yīng)，故而常作為模型肽來了解細(xì)胞內(nèi)過程。例如，其可以與磷脂結(jié)合，引起膜融合[4]；與核苷酸結(jié)合，調(diào)控基因表達(dá)[5]；作為鈣調(diào)蛋白的抑制劑，研究鈣調(diào)蛋白的性質(zhì)[6]；可以作為藥物傳遞肽；另外，Mel對(duì)革蘭氏陰/陽(yáng)性菌及真菌表現(xiàn)出顯著的抗菌活性[7?8]；具有顯著的抗過敏和抗炎癥特性[9]；可以抑制某些癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[10]；誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞的凋亡[11]；并表現(xiàn)出顯著的抗病毒活性[12]。多項(xiàng)報(bào)告還表明，Mel對(duì)于糖尿病及動(dòng)脈粥樣硬化也有一定的治療作用[13]?？傊琈el具有廣泛的生物學(xué)及藥理學(xué)效應(yīng)[14]。

Mel與核酸的反應(yīng)研究主要集中在Mel對(duì)DNA的損傷及所選基因的表達(dá)[15?16]。對(duì)于DNA與Mel的結(jié)合過程以及結(jié)合后構(gòu)象改變?nèi)匀皇俏粗?。我們采用多種光譜方法以及量熱法研究了小牛胸腺DNA(CT?DNA)與Mel的相互作用，為今后研究抗菌肽的藥理作用、了解抗菌肽與核酸的結(jié)合機(jī)制以及設(shè)計(jì)新型高效藥物分子提供了依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

N?2?羥乙基派嗪?N′?乙磺酸(HEPES，AR)購(gòu)于Sigma公司。CT?DNA(純度98%)、溴化乙錠(EB)購(gòu)于索萊寶。Mel(純度達(dá)到98%)由中國(guó)武漢Fine peptide公司合成，其它試劑均為分析純。

主要儀器：Biologie Mos 450型圓二色譜儀(法國(guó)Bio?logic公司)、F?2500型熒光光譜儀(日本Hitachi公司)、Cary 50 Bio UV?Visible型紫外吸收光譜儀(美國(guó)Varian公司)、ITC200型等溫滴定量熱儀(英國(guó)Malvern 公司)、Edinburgh Analytical Instrument type nF?900熒光光譜儀(英國(guó)愛丁堡公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制

Mel溶液：取少量Mel固體，溶解于 10 mmol·L?1pH=7.4的HEPES緩沖液，測(cè)量其在280 nm處的吸光度，確定其濃度(ε=5 500 L·mol?1·cm?1[17])。

CT?DNA溶液：參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行配制。

1.2.2 光譜測(cè)試

所有實(shí)驗(yàn)均在10 mmol·L?1pH=7.4的HEPES緩沖溶液中進(jìn)行，光譜數(shù)據(jù)均為3次掃描的平均值。

UV?Vis吸收光譜：T=25℃，使用1 cm比色皿測(cè)定不同溶液在200～800 nm范圍的光譜。

CT?DNA解鏈溫度(Tm)的測(cè)量:樣品以5℃的升溫間隔從15℃連續(xù)加熱至90℃，使用1 cm比色皿，監(jiān)測(cè)不同溶液在不同溫度下260 nm處吸光度。

圓二色光譜(CD)：T=25℃，步長(zhǎng)0.2 nm，帶寬1 nm，使用1 mm比色皿記錄不同溶液在190～320 nm范圍的光譜。

熒光壽命：T=25℃，用Ludox HS?30硅膠溶液作為空白，使用280 nm的激光器作為激發(fā)光源，測(cè)定不同溶液的熒光壽命，熒光衰減曲線參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行擬合。

熒光光譜的測(cè)定：T=25℃，使用1 cm比色皿。其中在紅邊激發(fā)熒光位移法(REES)實(shí)驗(yàn)中，激發(fā)波長(zhǎng)以5 nm的波長(zhǎng)間隔從280 nm逐漸增加至305 nm，記錄不同激發(fā)波長(zhǎng)下樣品的發(fā)射波長(zhǎng)；在丙烯酰胺熒光猝滅實(shí)驗(yàn)中，激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，逐步加入丙烯酰胺溶液(5 mmol·L?1)到樣品中，記錄不同溶液最大發(fā)射波長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度；對(duì)于穩(wěn)態(tài)熒光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，狹縫為5 nm，掃描速度為100 nm·min?1，逐漸滴加CT?DNA到Mel溶液中，收集300～550 nm的發(fā)射光譜；對(duì)于EB熒光競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，記錄500～750 nm范圍的發(fā)射光譜。

1.2.3 等溫滴定量熱法

T=25℃，采用MicraoCal ITC200進(jìn)行等溫滴定量熱測(cè)試。將 3.0 mmol·L?1CT?DNA 和 0.08 mmol·L?1Mel分別放置于注射池與樣品池中，進(jìn)行滴定。第一次滴加0.4 μL，以后每次滴加1 μL CT?DNA到樣品池中，反應(yīng)時(shí)間為3 min，共滴加31次，攪拌速度為750 r·min?1。數(shù)據(jù)處理時(shí)去除第一滴，扣除稀釋熱，利用儀器自帶的軟件來擬合，得到結(jié)合常數(shù)(Ka)及結(jié)合焓變(ΔH)，ΔG與ΔS參考文獻(xiàn)[19]得到。

2 結(jié)果與討論

2.1 CD光譜

圖2為室溫下10 mmol·L?1pH=7.4的HEPES 緩沖溶液中，Mel與CT?DNA混合前后的CD光譜。由圖可見，Mel在203 nm有一較強(qiáng)負(fù)信號(hào)，同時(shí)在222 nm處有一弱的肩峰(圖2A)，表明在緩沖溶液中Mel基本以無規(guī)卷曲的狀態(tài)存在。這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[20]。CT?DNA由于堿基堆積在275 nm出現(xiàn)一個(gè)正峰，由于右手螺旋在245 nm出現(xiàn)負(fù)峰(圖2B)，這是B型DNA的特征峰[21]。為了更好的觀察Mel與CT?DNA混合后構(gòu)象的變化，用混合物的光譜數(shù)據(jù)減去單一成分的光譜數(shù)據(jù)，分別得到反應(yīng)后的Mel與CT?DNA的光譜。從圖中可以看到，Mel與CT?DNA反應(yīng)后，在208與222 nm分別出現(xiàn)了負(fù)峰(圖 2A)，這是典型的α?helix特征峰[20,22]，表明 Mel與CT?DNA反應(yīng)后以α?helix狀態(tài)存在，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致，即Mel遇到疏水模擬物，如膠束、膜環(huán)境或者脂質(zhì)體，會(huì)采用α?helix[23]。與Mel反應(yīng)后，CT?DNA位于275 nm處的正峰及245 nm處的負(fù)峰強(qiáng)度與位置均發(fā)生變化(圖2B)，表明CT?DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[21]。

圖2 (A)Mel與(B)CT?DNA的CD光譜Fig.2 CD spectra of(A)Mel and(B)CT?DNA

2.2 紫外光譜

圖3為Mel與CT?DNA反應(yīng)后的紫外可見吸收光譜。由于Mel的19位含有色氨酸殘基，其最大吸收峰位于280 nm處。CT?DNA的最大吸收峰位于258 nm，將CT?DNA與Mel混合后，最大吸收峰位于267 nm處，而將CT?DNA與Mel的光譜加和所產(chǎn)生的最大吸收峰位于261 nm。紫外光譜的變化表明Mel與CT?DNA形成了復(fù)合物，Mel中色氨酸的環(huán)境可能發(fā)生了變化[24]。同時(shí)推測(cè)可能由于與Mel作用，使得CT?DNA雙鏈間的氫鍵斷裂，雙螺旋解開[25]。

圖 3 Mel(a)、CT?DNA(b)、CT?DNA?Mel(c)以及 Mel與CT?DNA光譜加和的(d)UV?Vis光譜Fig.3 UV?Vis absorption spectra of Mel(a),CT?DNA(b),CT?DNA?Mel(c)and calculated sum spectrum of Mel with CT?DNA(d)

2.3 色氨酸殘基微環(huán)境的變化

2.3.1 熒光壽命

色氨酸的熒光壽命對(duì)于所處微環(huán)境極為敏感[26]。圖4A為Mel在不同溶液中的熒光壽命。如圖所示，CT?DNA的加入改變了Mel的熒光壽命。其中Mel在緩沖溶液中的平均壽命為3.77 ns，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[27]，表明色氨酸殘基暴露在溶劑中。當(dāng)Mel與CT?DNA結(jié)合后，平均壽命減少了68%，變?yōu)?.22 ns，色氨酸殘基微環(huán)境的極性降低，進(jìn)入疏水環(huán)境，這可能對(duì)應(yīng)了Mel的構(gòu)象由無規(guī)卷曲向α?helix的轉(zhuǎn)變，與CD測(cè)得的結(jié)果一致。

2.3.2 丙烯酰胺猝滅實(shí)驗(yàn)

使用丙烯酰胺來進(jìn)一步探究Mel的構(gòu)象變化，尤其是色氨酸微環(huán)境的變化。丙烯酰胺作為中性猝滅劑，既能猝滅位于蛋白質(zhì)表面的熒光基團(tuán)的熒光，也能猝滅位于蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水腔的熒光基團(tuán)的熒光，因此常用來分析蛋白質(zhì)熒光基團(tuán)的微環(huán)境[28]。丙烯酰胺猝滅實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,采用Stern?Volmer方程[28](式1)進(jìn)行擬合分析：

其中F0、F是丙烯酰胺不存在或存在時(shí)溶液的熒光強(qiáng)度，Ksv是Stern?Volmer猝滅常數(shù)，cQ是丙烯酰胺的濃度。圖4B即為丙烯酰胺猝滅不同溶液所產(chǎn)生的光譜圖，由斜率測(cè)得Ksv，其中Mel在緩沖溶液中的Ksv為 17.30 L·mol?1，表明 Mel在緩沖溶液中經(jīng)歷了較大的猝滅，色氨酸殘基暴露在溶劑中[28]。當(dāng)Mel與CT?DNA結(jié)合后，Ksv減少為4.87 L·mol?1。Ksv的減少表明，一旦Mel與CT?DNA形成配合物，Mel中色氨酸殘基對(duì)溶劑中丙烯酰胺的可接近性減少，色氨酸殘基處于更疏水的內(nèi)部環(huán)境[28]，這與熒光壽命得到的結(jié)果一致。

圖4 Mel及其與CT?DNA混合物的熒光分析:(A)熒光衰減曲線;(B)丙烯酰胺猝滅實(shí)驗(yàn)的Stern?Volmer分析;(C)激發(fā)波長(zhǎng)的變化對(duì)最大發(fā)射波長(zhǎng)的影響Fig.4 Fluorescence analysis for Mel and the mixture of Mel with CT?DNA:(A)fluorescence decay curves;(B)representative data for Stern?Volmer analysis of acrylamide quenching;(C)effect of changing the excitation wavelength on the maximum emission wavelength

2.3.3 REES法

采用REES法來進(jìn)一步檢測(cè)CT?DNA對(duì)Mel中色氨酸殘基微環(huán)境的影響[29]。REES是指由于激發(fā)波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)而導(dǎo)致熒光基團(tuán)的最大發(fā)射波長(zhǎng)也向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。REES上升是由熒光基團(tuán)激發(fā)態(tài)周圍溶劑的弛豫速率較慢引起。圖4C為CT?DNA對(duì)Mel的紅邊激發(fā)熒光位移影響。由圖中可以看到，隨著激發(fā)波長(zhǎng)的逐漸增加，從280 nm增加到305 nm，處于緩沖液中的Mel最大發(fā)射波長(zhǎng)幾乎沒有變化，表明緩沖溶液中Mel的色氨酸基團(tuán)處于一個(gè)可移動(dòng)的水環(huán)境中。當(dāng)Mel與CT?DNA結(jié)合后，最大發(fā)射波長(zhǎng)值隨著激發(fā)波長(zhǎng)的增加而發(fā)生紅移，從 340 nm(λex=280 nm)移到 348 nm(λex=305 nm)，位移8 nm。REES研究表明，Mel與CT?DNA形成復(fù)合物后，使得Mel中的色氨酸殘基活動(dòng)受到限制，這與熒光壽命及熒光猝滅實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果一致，Mel與CT?DNA的結(jié)合使得Mel的色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生變化，由親水區(qū)進(jìn)入更疏水的內(nèi)部。

2.4 CT?DNA構(gòu)象的變化

2.4.1 EB熒光

EB在水溶液中熒光較弱，通過內(nèi)插結(jié)合到CT?DNA的堿基對(duì)中后熒光顯著增強(qiáng)，故而可以作為監(jiān)測(cè)CT?DNA構(gòu)象變化的熒光探針[30]。如圖5所示，EB在緩沖溶液中或者M(jìn)el溶液中的熒光很弱，最大發(fā)射波長(zhǎng)位于612 nm，當(dāng)EB插入到CT?DNA分子中，熒光顯著增強(qiáng)，最大發(fā)射波長(zhǎng)移至599 nm，當(dāng)向EB?CT?DNA溶液中逐漸加入Mel后，EB熒光強(qiáng)度逐漸減弱，最終熒光強(qiáng)度(曲線g)強(qiáng)于EB在緩沖溶液中的強(qiáng)度(曲線 a)，而弱于 EB?CT?DNA的熒光強(qiáng)度(曲線c)，推測(cè)Mel與CT?DNA的作用使得CT?DNA的構(gòu)象發(fā)生變化，EB的結(jié)合位點(diǎn)減少，部分EB分子被釋放，這與紫外光譜及CD光譜得到的結(jié)果一致。

圖5 EB?CT?DNA在加入Mel前后的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of EB?CT?DNA before and after the addition of Mel

2.4.2Tm測(cè)定

Tm是指50%的雙鏈DNA變成單鏈的溫度[31]。圖6為CT?DNA在不同溶液中的熱變性曲線，經(jīng)擬合得到Tm，其中緩沖溶液中CT?DNA的Tm值為64.3℃。而與Mel結(jié)合后，CT?DNA的Tm值為66.2℃。Tm升高可能是由于Mel中的帶正電荷的氨基酸殘基與CT?DNA反應(yīng)，改變了CT?DNA的電荷排列，從而起到穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的作用[31]，此外，氨基酸疏水側(cè)鏈與CT?DNA的疏水部分接觸，也可能使復(fù)合物更穩(wěn)定[31]。

圖6 CT?DNA(a)和CT?DNA?Mel(b)的熱變性曲線Fig.6 Thermal denaturation curves of CT?DNA(a)and CT?DNA?Mel(b)

2.5 結(jié)合常數(shù)

2.5.1 熒光光譜

Mel與CT?DNA親和力通過CT?DNA滴定Mel實(shí)驗(yàn)來測(cè)定。圖7A是CT?DNA滴定Mel的熒光光譜，從圖中可以看出，Mel由于含有色氨酸，最大熒光發(fā)射峰位于357 nm，表明色氨酸殘基暴露在緩沖溶液中。隨著CT?DNA逐漸滴加到Mel中，Mel的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，減弱約53%，最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生藍(lán)移，由357 nm藍(lán)移到342 nm，Mel與CT?DNA形成復(fù)合物，Mel的構(gòu)象發(fā)生變化，色氨酸殘基進(jìn)入更加疏水的內(nèi)部，這可能對(duì)應(yīng)了Mel由無規(guī)卷曲向α?helix的轉(zhuǎn)變。熒光猝滅可能是由于Mel所帶的正電荷與CT?DNA磷酸骨架所帶的負(fù)電荷的靜電作用使得Mel的表面電荷發(fā)生重排[32]，另外CT?DNA與色氨酸殘基吲哚基附近氨基的氫鍵形成也可能會(huì)引起Mel熒光的猝滅[33]。

圖7 (A)CT?DNA的加入對(duì)Mel(1.2 μmol·L?1)熒光光譜的影響;(B)隨cCT?DNA/cMel變化的熒光強(qiáng)度滴定曲線Fig.7 (A)Effect of adding CT?DNA on fluorescence spectrum of Mel(1.2 μmol·L?1);(B)Titration curve for fluorescence intensity as a function of cCT?DNA/cMel

將 Mel在 357 nm 處的熒光強(qiáng)度對(duì)cCT?DNA/cMel作圖，得到圖7B。從圖7B可以看出，Mel在357 nm處的熒光強(qiáng)度隨著cCT?DNA/cMel的增大而逐漸減小。Mel與CT?DNA的結(jié)合常數(shù)可由式2得到：

其中F0為CT?DNA不存在時(shí)，Mel在357 nm處的熒光強(qiáng)度；Fi為任一滴定點(diǎn)的熒光強(qiáng)度；F∞為CT?DNA與Mel完全結(jié)合后Mel在357 nm處的熒光強(qiáng)度；Ka為CT?DNA與Mel結(jié)合的條件結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；cCT?DNA為任一滴定點(diǎn)時(shí)CT?DNA的游離濃度。根據(jù)文獻(xiàn)[19]，使用CT?DNA的總濃度代替CT?DNA的游離濃度，用 lg[(F0?Fi)/(Fi?F∞)]對(duì) lgcCT?DNA作圖可得Ka和n，數(shù)據(jù)處理過程中扣除滴定過程中產(chǎn)生的稀釋效應(yīng)。如圖7B插圖，得到CT?DNA與Mel的結(jié)合常數(shù)為(5.39±0.04)×105L·mol?1。

當(dāng)CT?DNA與Mel反應(yīng)的緩沖液中NaCl濃度達(dá)到 500 mmol·L?1時(shí)(圖 8)，Mel與 CT?DNA 混合物的最大熒光發(fā)射峰從342 nm移回357 nm(曲線b到曲線c)，表明Mel與CT?DNA的結(jié)合高度依賴靜電作用。

圖8 (a)Mel在HEPES中、(b)CT?DNA?Mel在HEPES中、(c)CT?DNA?Mel在500 mmol·L?1NaCl中和(d)ssDNA?Mel在HEPES中的熒光光譜Fig.8 Fluorescence spectra of(a)Mel in HEPES buffer,(b)CT?DNA?Mel in HEPES buffer,(c)CT?DNA?Mel in 500 mmol·L?1NaCl,and(d)ssDNA?Mel in HEPES buffer

此外，我們還觀察了單鏈DNA(ssDNA)對(duì)Mel熒光的影響，ssDNA包含磷酸骨架，可以為反應(yīng)提供靜電作用。CT?DNA于100℃孵化30 min，再快速轉(zhuǎn)移至冰水浴中冷卻30 min，得到ssDNA。將ssDNA加入到Mel中，熒光僅僅發(fā)生猝滅(曲線a～d)，表明CT?DNA與Mel的反應(yīng)過程中除靜電作用外，還存在疏水作用，CT?DNA雙螺旋中的疏水成分可能在這個(gè)過程中起到了作用。

2.5.2 等溫滴定量熱法

為了進(jìn)一步研究Mel與CT?DNA之間的相互作用，我們選用等溫滴定量熱法進(jìn)行分析。圖9為CT?DNA滴定Mel所得到的代表性熱譜圖和相應(yīng)的滴定曲線。由圖可知，Mel和CT?DNA之間的反應(yīng)是吸熱反應(yīng)。采用“one set of sites”模型進(jìn)行擬合，得到Ka為(4.44±0.12)×105L·mol?1，與熒光光譜得到的結(jié)合常數(shù)接近。所有的熱力學(xué)參數(shù)列于表1。由表可知，焓變對(duì)自由能的貢獻(xiàn)較小，Mel與CT?DNA的相互作用是熵驅(qū)動(dòng)的，表明靜電作用與疏水作用在復(fù)合物形成的過程中都起作用，靜電作用來源于CT?DNA磷酸骨架與Mel帶正電的氨基酸殘基之間的作用，疏水作用可能來源于CT?DNA雙螺旋與Mel的疏水氨基酸殘基[34]。

表1 在25℃時(shí)通過熒光光譜和ITC測(cè)量CT?DNA?Mel復(fù)合物的熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Thermodynamic parameters of CT?DNA?Mel complex by spectrofluorimetric methods and ITC at 25 ℃

圖9 在25 ℃時(shí)CT?DNA(3.0 mmol·L?1)滴定Mel(0.08 mmol·L?1)的等溫量熱滴定曲線Fig.9 Calorimetric titration of CT?DNA(3.0 mmol·L?1)to Mel(0.08 mmol·L?1)at 25 ℃

綜上所述，Mel與CT?DNA可以形成復(fù)合物，這與文獻(xiàn)中報(bào)道的具有多個(gè)疏水氨基酸殘基的陽(yáng)離子肽可與核酸形成復(fù)合物類似[34?35]。復(fù)合物的形成存在多種相互作用，Mel中帶正電荷的氨基酸殘基與CT?DNA帶負(fù)電荷的磷酸骨架之間存在靜電作用；CT?DNA雙螺旋能與Mel中的疏水氨基酸殘基之間發(fā)生疏水作用，尤其是纈氨酸與亮氨酸，它們還有與CT?DNA雙螺旋配位的趨勢(shì)[34]；此外，Mel中帶質(zhì)子的氨基和羧基還可能與CT?DNA中腺嘌呤和鳥嘌呤的氮原子之間形成氫鍵。離子強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)表明，Mel在與CT?DNA相互作用的過程中，靜電作用在初始的結(jié)合中占主導(dǎo)地位，類似于Mel與膜的結(jié)合[23]。二者的相互作用會(huì)誘導(dǎo)Mel構(gòu)象發(fā)生變化，由無規(guī)卷曲變?yōu)棣?helix，色氨酸殘基由親水的表面進(jìn)入更疏水的內(nèi)部環(huán)境，CT?DNA結(jié)構(gòu)亦發(fā)生變化。根據(jù)短肽與DNA結(jié)合的互補(bǔ)作用模型[36]以及Wilkins等提出的基于X射線衍射研究的作用模型[35]，結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，推測(cè)Mel可能以α?helix結(jié)合到CT?DNA的溝槽中。這種結(jié)合模型不僅能拓寬雙螺旋的溝槽，而且增加了反應(yīng)物局部的剛性，從而使得CT?DNA更穩(wěn)定，Tm升高。

3 結(jié)論

綜上所述，在 10 mmol·L?1pH 7.4 HEPES 溶液中，Mel可以與CT?DNA形成復(fù)合物，復(fù)合物的形成使得Mel由無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)向α?helix，Mel中的色氨酸殘基由親水環(huán)境向疏水環(huán)境轉(zhuǎn)變，吲哚環(huán)不能獨(dú)立于Mel自由轉(zhuǎn)動(dòng)，并且CT?DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，該研究提供了對(duì)陽(yáng)離子肽在核酸結(jié)合中作用的重要見解，不僅有助于更深入地了解抗菌肽的作用機(jī)制，而且有助于更深入地了解抗菌肽與核酸的作用機(jī)制，也為構(gòu)建具有一定理化特性和生物學(xué)特性的多肽以及潛在藥用制劑的研發(fā)提供了線索。