輔助卵母細(xì)胞激活對經(jīng)睪丸顯微取精術(shù)獲取活動精子患者卵胞漿單精子注射治療結(jié)局的影響

張 希，李 磊，羅 陽，李 莉，張文紅

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科//生殖醫(yī)學(xué)中心//廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//廣東省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510150）

1999 年Schlegel［1］報(bào)道在手術(shù)顯微鏡放大作用下切開睪丸尋找可能具有生精功能的曲細(xì)精管獲取睪丸精子，這是睪丸顯微取精術(shù)（microdissection testicular sperm extraction，micro-TESE）首次應(yīng)用于輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域，為非梗阻性無精子癥（nonobstructive azoospermia，NOA）男性患者帶來了福音。Micro-TESE 以較高的精子獲得率和手術(shù)方式的獨(dú)特優(yōu)勢，逐漸成為NOA 患者獲取精子的主要方式。與精子發(fā)生正常的男性相比［2］，NOA 患者的睪丸精子進(jìn)行ICSI 周期的受精率和妊娠率顯著降低。精子發(fā)生受損的男性的睪丸精子由于精子的成熟度低于精子發(fā)生正常的男性［2］，其ICSI 后的受精率可能會降低，也可能因?yàn)榫硬荒苡|發(fā)卵母細(xì)胞激活而受精失?。?］。含鈣離子載體的人工卵母細(xì)胞激活（assisted oocyte activation，AOA）可以增加細(xì)胞內(nèi)游離鈣［4-6］，從而模仿導(dǎo)致卵母細(xì)胞激活的生理細(xì)胞信號機(jī)制［7］。Nasr-Esfahani［8］等使用AOA 聯(lián)合離子霉素提高了畸形精子癥患者的受精率和卵裂率。也有生殖中心在比較梗阻性無精子癥患者（obstructive azoospermia，OA）和NOA 患者的附睪精子與睪丸精子行ICSI 聯(lián)合AOA 的效果時發(fā)現(xiàn)，AOA 可以改善OA 患者的附睪精子ICSI 后的胚胎質(zhì)量［9］。AOA在國內(nèi)通常用于至少有1次ICSI受精失敗或受精低下（受精率＜30%）的患者，有研究顯示AOA 可以改善射出精精子頭部畸形與可疑ICSI 受精失敗及低下患者的受精率［10-11］。由于可開展micro-TESE 手術(shù)的中心少，且獲得的精子數(shù)量極少，未見AOA 處理micro-TESE 精子ICSI 的報(bào)道。本研究對2018年至2020年間，在我院行micro-TESE 成功獲得活動精子的患者行ICSI 治療過程中，是否行AOA 處理的實(shí)驗(yàn)室和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析，為臨床治療方案的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料

研究對象為2018年至2020年間來廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行輔助生殖治療的夫婦，因男性配偶為非梗阻性無精子癥且常規(guī)睪丸穿刺術(shù)無法獲得精子，在我院生殖中心經(jīng)micro-TESE 已獲取活動精子，并根據(jù)本中心常用方法冷凍保存［12］睪丸精子1管或多管的患者167例。女性配偶通過常規(guī)長方案或拮抗劑方案促排卵［13］獲取卵子，取卵日解凍睪丸精子行ICSI 治療共230 個周期。卵子激活技術(shù)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會討論通過且患者知情同意。

1.2 取卵日解凍睪丸精子

在配偶經(jīng)手術(shù)獲得卵子后，從液氮罐對應(yīng)位置取出至少1 管冷凍睪丸精子，室溫放置10 min 左右，液化完全后將凍存液轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管，緩慢逐滴加入2 mL 精子洗滌液，輕緩混勻，室溫400×g離心5 min；棄上清，用1～2 mL精子洗滌液重懸底部沉淀，室溫400×g離心5 min；棄上清，小心移除上層液體，50～100 μL G-IVF plus 液（Vitrolife公司）重懸精子，CO2培養(yǎng)箱放置待用。

1.3 ICSI方案及分組

取卵當(dāng)天按本實(shí)驗(yàn)室操作常規(guī)準(zhǔn)備顯微注射皿，37 ℃培養(yǎng)箱（無CO2）預(yù)熱不少于30 min。行ICSI 操作前將處理好的睪丸精子加入注射皿的G-MOPS plus 液滴中孵育，同時加入一滴含3.6 mmol/L 己酮可可堿（Pentoxifylline）的精子激動劑［14］。顯微鏡下尋找活動精子轉(zhuǎn)移到PVP液滴中，在獲取到足夠可用精子后，依次制動精子行ICSI。

2018 年1 月 到2020 年12 月間的micro-TESE患者中，共129 個ICSI 治療周期行ICSI 后因精子形態(tài)畸形可疑受精低下即行AOA 處理，再轉(zhuǎn)移至胚胎培養(yǎng)皿液滴中培養(yǎng)，為激活組（G1），101 個ICSI治療周期行ICSI后，直接轉(zhuǎn)移至胚胎培養(yǎng)皿液滴中培養(yǎng)，為未激活組（G2）。

1.4 輔助卵母細(xì)胞激活(AOA)

參照Nasr-Esfahani［8］等方法，完成ICSI 后的所有卵母細(xì)胞即刻轉(zhuǎn)移至離子霉素（Sigma，美國）終濃度為10 μmol/L 的G-IVF plus 培養(yǎng)液中，37 ℃、6%CO2培養(yǎng)箱中靜置作用15 min，再在G-IVF plus培養(yǎng)液中依次洗滌3 次，轉(zhuǎn)移至在胚胎培養(yǎng)箱中平衡過夜的G-1.5 plus（Vitrolife，瑞典）培養(yǎng)液滴中常規(guī)培養(yǎng)。

1.5 結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn)和計(jì)算算式

Day 3可利用胚胎標(biāo)準(zhǔn)參照本中心實(shí)驗(yàn)室操作常規(guī)進(jìn)行，即Day 1 原核（pronucleus，PN）數(shù)目為2，Day 3 胚胎卵裂球數(shù)≥5，卵裂球大小差異≤30%，碎片比例≤20%屬可利用胚胎，其中卵裂球數(shù)為7～9 且大小均勻的可用胚即為優(yōu)胚。受精率為Day 1所有觀察到原核的受精卵與ICSI 注射卵數(shù)間的比值；Day 3 可用胚率為可用胚數(shù)與受精卵數(shù)間的比值，優(yōu)胚率是優(yōu)胚數(shù)與2PN 受精卵數(shù)間的比值，無可用胚周期率為無可用胚ICSI 周期數(shù)與總ICSI 周期數(shù)比，臨床妊娠率為臨床妊娠周期數(shù)與總移植周期數(shù)間的比值，持續(xù)妊娠率是正常妊娠12 周以上周期數(shù)與總移植周期數(shù)的比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析處理采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。連續(xù)性變量使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用t檢驗(yàn)比較兩組間的連續(xù)性變量差異。率的差異性分析則采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NOA患者micro-TESE精子情況

倒置顯微鏡下非梗阻性無精子癥患者micro-TESE 精子的形態(tài)嚴(yán)重畸形（圖1A），常為小頭、梨形頭、錐形頭。經(jīng)睪丸精子抽吸術(shù)可以獲得較多頭部形態(tài)正常精子（圖1B）。

圖1 micro-TESE精子的異常頭部形態(tài)Fig.1 Abnormal head morphology of sperm obtained by micro-TESE

2.2 micro-TESE精子行ICSI聯(lián)合AOA的胚胎情況

觀察micro-TESE 患者使用活動精子行ICSI 聯(lián)合AOA 的原核形成、胚胎發(fā)育情況。Day 1 觀察到2PN 為正常受精（圖2A），偶爾可見1PN 受精（圖2B）及3PN 受精。只有2PN 發(fā)育來的可利用胚胎（圖2C）可用于移植。

圖2 micro-TESE精子注射后的卵子受精及胚胎發(fā)育情況Fig.2 Fertilized ovum and embryo development after micro-TESE sperm injection

2.3 ICSI后是否行AOA的實(shí)驗(yàn)室結(jié)局比較

激活組（G1）和未激活組（G2）女方平均年齡分別為29.96 ± 4.61 和30.59 ± 4.50（P=0.297），此外患者每ICSI 周期的平均MⅡ數(shù)分別為10.85 ±5.91 和10.75 ± 5.44（P=0.469），數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組的1PN 受精率（7.49%vs.5.89%，P=0.117）、多PN 受精率（0.94%vs.1.47%，P=0.218）、D3 可用胚 率（41.29%vs.40.74%，P=0.817）、優(yōu)胚率（13.44%vs.15.44%，P=0.265）和無可用胚周期發(fā)生率（10.85%vs.9.90%，P=0.815）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但G1 組的總受精率（72.77%vs.67.59%，P=0.005）和2PN 受精率高于G2 組（64.33%vs.60.22%，P=0.036），兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳細(xì)結(jié)果見表1。

表1 ICSI后是否行AOA實(shí)驗(yàn)室結(jié)果比較Table 1 Comparison of laboratory results of AOA after ICSI ［］

表1 ICSI后是否行AOA實(shí)驗(yàn)室結(jié)果比較Table 1 Comparison of laboratory results of AOA after ICSI ［］

AOA：assisted oocyte activation；ICSI：intracytoplasmic sperm injection；MⅡ：mature oocyte；2PN：diploid zygote；1PN：monopronucleus zygotes；3PN：triploid zygotes.

2.4 ICSI后是否行AOA的臨床結(jié)局

由于有部分ICSI 周期進(jìn)行了超過1 次的胚胎移植，G1 組共155 個移植周期，移植胚胎總數(shù)為238 個，其中囊胚58 個（24.37%），平均移植胚胎數(shù)為1.51 ± 0.50；G2 組共100 個移植周期，移植胚胎總數(shù)156 個，其中囊胚39 個（25.00%），平均移植胚胎1.56 ± 0.50，兩組間平均移植胚胎數(shù)（P=0.154）及移植囊胚占比（P=0.915）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。G1 組的平均移植周期數(shù)（1.20 ± 0.74vs.0.99 ±0.61，P=0.009）和首次移植成功獲得妊娠的比例（67.09%vs.50.00%，P=0.039）高于G2組。兩組平均移植周期數(shù)及平均移植胚胎數(shù)服從正態(tài)分布。

比較兩組胚胎種植率（34.87%vs.32.05%，P=0.533）、臨床妊娠率（43.87%vs.41.00%，P=0.651）和早期流產(chǎn)率（17.65%vs.2.44%，P=0.018），其中G2 組早期流產(chǎn)率低于G1 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然G2 組持續(xù)妊娠率為40.00%，高于G1 組的36.13%，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.533），詳細(xì)結(jié)果見表2。

表2 ICSI后是否行AOA臨床結(jié)局比較Table 2 Comparison of clinical outcomes of AOA after ICSI ［］

表2 ICSI后是否行AOA臨床結(jié)局比較Table 2 Comparison of clinical outcomes of AOA after ICSI ［］

AOA：assisted oocyte activation；ICSI：intracytoplasmic sperm injection；ET：embryo transfer.

3 討論

輔助卵母細(xì)胞激活在輔助生殖治療中使用的臨床指征主要包括：患者前次ICSI治療完全受精失敗或受精率低于30%［15］，患者精子嚴(yán)重畸形（如圓頭精子癥、頂體缺陷等）［8，10］。AOA 方法有機(jī)械刺激法和化學(xué)激活法，機(jī)械刺激法即在行卵胞漿單精子注射時，利用注射針對卵母細(xì)胞胞漿的抽吸輔助激活卵母細(xì)胞，改善ICSI受精率［16］?；瘜W(xué)激活法主要是使用鈣離子載體輔助激活卵母細(xì)胞，即利用一定濃度鈣離子載體（鈣霉素A23187 或離子霉素）與ICSI后的卵母細(xì)胞共孵育10～15 min［8，17］。這些輔助卵母細(xì)胞激活的研究結(jié)果提示，AOA 能有效改善ICSI 受精率，但Meerschaut 等［17］研究也認(rèn)為并不是所有ICSI 受精率低患者都能從中獲益。Borges 等［9］描述了ICSI 周期中含鈣離子載體的AOA 對注射睪丸或附睪精子的卵母細(xì)胞的影響，他們認(rèn)為AOA 并不能改善OA 或NOA 患者的睪丸精子ICSI結(jié)果；但是當(dāng)注射來自O(shè)A 的附睪精子時，AOA 可以改善優(yōu)質(zhì)胚胎率。

由于絕大多數(shù)NOA 男性患者生精功能很差，通過micro-TESE 手術(shù)獲取的精子往往活動力極弱且存在頂體缺陷及其他形態(tài)畸形，這常導(dǎo)致ICSI后因無法激活卵子啟動第二次減數(shù)分裂使得受精率低下，胚胎發(fā)育質(zhì)量不理想，臨床妊娠率低［18］。為提高這種極端異常精子條件下ICSI 治療的實(shí)驗(yàn)室和臨床結(jié)局，通過醫(yī)院倫理委員會討論且患者知情同意，我們對部分micro-TESE 手術(shù)已獲取活動精子患者行ICSI 后卵母細(xì)胞行AOA 處理，比較分析是否行AOA 處理ICSI 治療的實(shí)驗(yàn)室和臨床結(jié)局差異。

在我院生殖醫(yī)學(xué)中心經(jīng)micro-TESE 術(shù)成功獲取活動睪丸精子的167 例NOA 患者，共進(jìn)行了230個ICSI 治療周期。比較分析發(fā)現(xiàn)，129 個進(jìn)行AOA處理的ICSI 周期總受精率（P=0.005）和正常受精率（P=0.036）均高于101 個未行AOA 處理周期，這與研究認(rèn)為［19］在射出精I(xiàn)CSI 受精異常患者是否行AOA 處理的研究結(jié)論一致，提示AOA 處理可顯著提高micro-TESE 術(shù)獲得活動精子患者ICSI 的受精結(jié)局。但我們的數(shù)據(jù)顯示，AOA 處理未降低無可用胚周期發(fā)生率，對Day3 可利用胚胎率和優(yōu)胚率的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對臨床妊娠率（P=0.651）和種植率（P=0.533）的影響也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且由于AOA 組早期流產(chǎn)率高于未行AOA 組（17.6%vs.2.4%，P=0.018），AOA 組的持續(xù)妊娠率低于未行AOA 組（36.1%vs.40.0%，P=0.533），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與王躍等［10］認(rèn)為圓頭精子癥或受精失敗患者，AOA 處理可以改善ICSI 的受精率及胚胎發(fā)育質(zhì)量的結(jié)果并不一致。因?yàn)槿绻鸌CSI 操作者能找到正常形態(tài)的活動精子進(jìn)行注射，那么不需要AOA 處理仍然可以幫助卵子獲得受精得到可以用于移植的胚胎，而且對受精卵后續(xù)胚胎發(fā)育到優(yōu)胚的影響沒有顯著性，對臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。輔助卵子激活對于有胚胎發(fā)育問題的患者沒有益處［20］，若micro-TESE 患者胚胎質(zhì)量差不存在受精異常，則不需要AOA處理。

我們的結(jié)果顯示AOA 處理可以顯著提高患者的首次移植妊娠率，對患者可移植次數(shù)的增加有顯著性，這可能與激活組患者的可利用胚胎數(shù)有增加的趨勢有關(guān)。AOA 處理的患者首次移植獲得妊娠的比例更高對于減輕患者生育的經(jīng)濟(jì)壓力以及再次生育均有幫助。

利用micro-TESE 術(shù)獲取睪丸精子是男科學(xué)領(lǐng)域?qū)OA 男性患者行輔助生殖治療的方法突破，它幫助眾多通過常規(guī)睪丸穿刺取精術(shù)無法獲得精子的NOA 男性患者獲得了精子，精子的質(zhì)量參差不齊。對于已經(jīng)通過micro-TESE 術(shù)成功獲得活動精子的患者，在行ICSI 治療過程中，AOA 可改善受精情況，但是對臨床結(jié)局的有效性并不確定，因此對于使用活動micro-TESE 精子行ICSI之后的AOA處理應(yīng)僅用在精子形態(tài)畸形可疑受精差的情況，僅有胚胎發(fā)育問題者不建議行AOA。