囊胚培養(yǎng)為主時解凍卵裂期胚胎移植的妊娠結(jié)局分析

張小霞，王輝田，李 濤

（中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖中心，廣東廣州 510630）

近年來囊胚培養(yǎng)已成為各生殖中心的主流，延長胚胎培養(yǎng)至囊胚階段可以更好地評估胚胎的發(fā)育潛能，選擇最優(yōu)的胚胎移植，讓病人更快獲得妊娠，尤其是單囊胚移植，可以在控制多胎妊娠的同時維持高的臨床妊娠率；另一方面，囊胚移植時子宮內(nèi)膜更接近生理狀態(tài)，容受性更好；囊胚比卵裂胚更耐受低溫凍存，具有解凍復(fù)蘇率更高等優(yōu)勢［1-2］。但是，全部卵裂胚行囊胚培養(yǎng)存在一定風(fēng)險，一旦養(yǎng)囊失敗，病人面臨無胚胎移植的風(fēng)險［3］。因此，為最大限度地鼓勵患者接受囊胚培養(yǎng)，保證病人有胚胎移植的機(jī)會，本中心對大部分病人在胚胎發(fā)育第三天冷凍保存1～2 枚胚胎，剩余胚胎全部行囊胚培養(yǎng)。囊胚移植可以獲得相對更高的種植率和妊娠率，因此，在解凍移植周期，通常優(yōu)先選擇移植囊胚，本中心解凍單囊胚移植的總體臨床妊娠率65%左右，與國內(nèi)外報道的囊胚移植的妊娠率近似［4-5］。但在總的解凍胚胎移植周期中，仍有相當(dāng)比例的解凍卵裂期胚胎移植。因此，在以單囊胚移植為主的移植策略下，這些冷凍卵裂期胚胎來自哪些人群、胚胎質(zhì)量如何、妊娠結(jié)局如何？本研究根據(jù)是否行囊胚培養(yǎng)及是否有可用囊胚，將解凍卵裂期胚胎移植分為無養(yǎng)囊組、養(yǎng)囊失敗組、養(yǎng)囊成功組，對近5 年解凍卵裂期胚胎移植結(jié)局進(jìn)行了相應(yīng)的分析。我們納入了本中心2015 年9 月至2020 年6 月共1 607 例卵裂期胚胎解凍周期，分析了不同群體的患者基本特征，妊娠情況，影響妊娠結(jié)局的因素等，評估D3卵裂胚冷凍及移植的臨床價值，為目前以養(yǎng)囊為主的臨床方案提供反饋，為進(jìn)一步優(yōu)化胚胎冷凍及移植策略提供思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究已取得中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意。回顧性分析本中心2015 年9 月至2020 年6 月的解凍卵裂期胚胎移植周期，排除女方伴有子宮內(nèi)膜、宮腔粘連等宮腔疾病，以及解凍胚胎來源于不同取卵周期、凍卵周期、晚補(bǔ)救卵裂胚等特殊情況，共包括1 607例解凍卵裂期胚胎移植。根據(jù)是否在第三天進(jìn)行囊胚培養(yǎng)及是否有可用囊胚，分成無養(yǎng)囊組（1 200例）、養(yǎng)囊失敗組（98 例）和養(yǎng)囊成功組（309 例）三個組。養(yǎng)囊失敗組定義為無可利用囊胚形成，無囊胚移植史；養(yǎng)囊成功組為有可用囊胚，且有移植冷凍囊胚但未能妊娠史。養(yǎng)囊成功組共486 例，但本研究僅納入至少有一次解凍囊胚移植失敗史的病例（309例），本組也不包括D5新鮮移植后無凍存囊胚，或解凍時優(yōu)先解凍卵裂胚，以及解凍囊胚成功妊娠（解凍卵裂胚生育二孩/三孩）的患者。

1.2 方法

1.2.1 體外受精與胚胎培養(yǎng) 當(dāng)2～3 個主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)到18 mm 時，當(dāng)日抽血查性激素促卵泡刺激素（FSH）、促黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P），使用的儀器是羅氏Cobas e602 化學(xué)發(fā)光儀檢測，使用人絨毛膜促性腺激素（HCG）4 000～10 000 U 或者重組hCG 250 μg 進(jìn)行扳機(jī)，注射后36～38 h取卵。根據(jù)常規(guī)體外受精（IVF）和卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）的適應(yīng)癥，結(jié)合男方當(dāng)日精液優(yōu)化處理后情況選擇授精方案。

1.2.2 胚胎評分 根據(jù)胚胎卵裂球數(shù)目，卵裂球大小均一性以及碎片量對胚胎進(jìn)行評分。卵裂球1級：細(xì)胞大小均勻，形態(tài)規(guī)則，胞質(zhì)均勻清晰；2 級：細(xì)胞大小略不均勻，形態(tài)略不規(guī)則；3 級：細(xì)胞大小明顯不均；碎片評分：1分：碎片＜10%；2分：大多數(shù)碎片局部分布，碎片量10%～25%；3 分：碎片量＞25%，≤50%。卵裂球數(shù)目小于四個同時碎片量≥50%時為不可用胚胎。優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎為第三天卵裂球數(shù)目6～10 個，細(xì)胞大小均勻，碎片量＜10%。

1.2.3 胚胎的冷凍及解凍 所有胚胎冷凍、解凍均采用日本加藤商品化試劑套裝。胚胎冷凍時將胚胎放入平衡液（equilibration solution，ES），計時，室溫10 min，接著將胚胎移入玻璃化冷凍液（vitrification solution，VS）60 s，當(dāng)時間還剩10 s 左右時，將胚胎放在載桿尖端處，立即投入液氮中。胚胎解凍時找出患者需要解凍的胚胎，雙人核對載桿標(biāo)簽上胚胎個數(shù)、胚胎階段、冷凍日期，將載桿立即浸入解凍液1（warming solution 1，WS1）中37 ℃，輕輕晃動使胚胎從載桿滑入解凍皿，1 min 后將胚胎轉(zhuǎn)移至WS2 液中，室溫計時3 min，接著轉(zhuǎn)移至WS3，室溫5 min，再移至2 個WS4 中，室溫各3 min，最后轉(zhuǎn)移至3037 移植皿，放入培養(yǎng)箱等待移植，卵裂期胚胎解凍后至少一半及以上卵裂球復(fù)蘇定為胚胎存活。

1.2.4 內(nèi)膜的準(zhǔn)備 主要的內(nèi)膜準(zhǔn)備方案是自然周期和人工周期方案（HRT）。自然周期適合于排卵正常的患者，于月經(jīng)周期第10 天開始B 超監(jiān)測排卵及內(nèi)膜厚度，當(dāng)卵泡直徑＞14 mm 時，每天監(jiān)測尿LH，同時監(jiān)測激素LH、E2、P 水平，當(dāng)血LH 值大于基礎(chǔ)值2倍以上或者＞20 U/L，則認(rèn)為血LH出峰。在尿LH 峰出現(xiàn)當(dāng)天（D0）抽血查激素LH、E2、P，移植時間在LH 峰值后的第三天（D3）或者第五天（D5）。人工周期方案（HRT）主要適用于各種原因?qū)е碌牡痛萍に厮交蛘邿o自然排卵等，從月經(jīng)周期或者撤退性出血的第1～3 天開始，戊酸雌二醇2～8 mg/d，8～14 d后根據(jù)B超監(jiān)測的內(nèi)膜情況，調(diào)整劑量。如果內(nèi)膜厚度小于8 mm，或者E2 水平＜200 pg/mL，添加芬嗎通1～2 mg 陰道給藥。當(dāng)內(nèi)膜達(dá)到8 mm 后，抽血查E2，當(dāng)E2≥200 pg/mL 時每天肌注40～60 mg 黃體酮，黃體酮注射第4 天移植第三天卵裂期胚胎。

1.2.5 妊娠檢查 胚胎移植后14 d，晨尿查hCG 或測定血β-hCG 水平判定是否妊娠。臨床妊娠定義為孕7周B 超探及孕囊，活產(chǎn)為獲得孕28周以上活產(chǎn)胎兒。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計分析軟件分析，定量資料基本服從正態(tài)分布用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，3 組比較采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)和四分位數(shù)M（P25～P75）表示，3組間采用非參數(shù)檢驗。率與構(gòu)成比采用χ2檢驗；有臨床意義的因素采用logistic 回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納入解凍胚胎移植周期的基本情況

本中心2015年9月至2020年6月總共5 327例解凍胚胎移植周期，其中3 378 例解凍囊胚移植周期，解凍卵裂期胚胎移植周期總共1 907例，排除子宮內(nèi)膜因素及特殊情況如積攢胚胎等的卵裂期胚胎移植，本研究共包括1 607 例解凍卵裂期胚胎移植，占總解凍周期的30.2%，本中心近年來高齡病人增加，相應(yīng)增加了解凍卵裂胚移植在總的解凍周期中的比例，以及無養(yǎng)囊組在總研究人群中的占比（表1）。

2.2 三組人群的基本臨床特征及妊娠結(jié)局比較

共納入1 607 個解凍卵裂胚周期，其中未養(yǎng)囊組1 200 例、養(yǎng)囊失敗組98 例（占總養(yǎng)囊周期數(shù)的2.1%）、養(yǎng)囊成功但移植解凍囊胚失敗組共309 例（占總體養(yǎng)囊周期數(shù)的6.6%）。分析3 組人群的年齡、不孕年限、女方BMI、授精方式、不孕類型、獲卵數(shù)、D3優(yōu)胚數(shù)、移植胚胎數(shù)等基本資料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3組間的女方年齡、基礎(chǔ)FSH、BMI、原發(fā)不孕占比、獲卵數(shù)、D3 優(yōu)胚數(shù)均有統(tǒng)計學(xué)差異。未養(yǎng)囊組女方年齡更高，基礎(chǔ)FSH更高，原發(fā)不孕占比更低，獲卵數(shù)，D3優(yōu)胚數(shù)均顯著低于其他兩組。3組人群的不孕年限、IVF受精占比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05（表1）。3 組間移植胚胎數(shù)無明顯差異。至少移植1 枚優(yōu)胚的比例在無養(yǎng)囊組最低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，HRT 的比例在3 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。臨床妊娠率在3組間存在統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.001（表1），養(yǎng)囊成功組即使有移植解凍囊胚失敗史，移植卵裂期胚胎的臨床妊娠率仍然顯著高于其他兩組，即46.9%vs.36.7%（養(yǎng)囊失敗組）vs.32.0%（未養(yǎng)囊組）。但是當(dāng)病人年齡＜35歲時，3組間臨床妊娠率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，病人年齡在35～40 之間時，臨床妊娠率有顯著差異，養(yǎng)囊成功組顯著高于其他兩組，P=0.012，年齡大于40歲時仍然存在此趨勢，由于病例數(shù)較少，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3 組間異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、多胎率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 解凍卵裂期胚胎移植患者基本資料及臨床結(jié)局分析Table 1 Baseline characteristics and clinical outcome of the patients undergoing thawed cleavage-stage embryo transfer

2.3 影響未養(yǎng)囊組妊娠結(jié)局的多因素回歸分析

未養(yǎng)囊組的臨床妊娠率隨年齡增加而明顯降低，＜35 歲臨床妊娠率為49.0%，35～40 歲妊娠率30.4%，＞40歲妊娠率13.1%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與＜35 歲人群相比，＞40 歲人群妊娠率下降明顯，OR 95%CI 為0.143（0.096，0.212），P＜0.001。72.8%患者至少有1 枚優(yōu)胚移植，移植至少一枚優(yōu)胚妊娠率顯著增加，OR 95%CI 為1.565（1.076，2.276），P=0.019。此組病人影響妊娠率的主要因素是病人年齡，及移植胚胎質(zhì)量（是否移植優(yōu)胚）。獲卵數(shù)、D3優(yōu)胚數(shù)、受精方式及內(nèi)膜準(zhǔn)備方案不影響妊娠結(jié)局。此組病人異位妊娠率1.3%，早期流產(chǎn)率24.2%，雙胎率24.2%（表2）。

表2 未養(yǎng)囊患者中影響解凍卵裂胚移植妊娠結(jié)局的logistic分析Table 2 Multiple logistic regression analysis of factors associated with the clinical pregnancy rate of patients without blastocyst culture

2.4 影響?zhàn)B囊失敗組妊娠結(jié)局的多因素回歸分析

養(yǎng)囊失敗組病例數(shù)較少（98 例），臨床妊娠率略高于未養(yǎng)囊組（36.7%vs.32.0%）。75.5%患者至少有1 枚優(yōu)胚移植，臨床妊娠率隨年齡增加有逐漸降低的趨勢，＜35歲妊娠率47.8%，35～40歲妊娠率32.4%，＞40 歲妊娠率16.7%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。移植胚胎質(zhì)量（是否移植優(yōu)質(zhì)胚胎）不影響妊娠率，33.3%vs.37.8%。此外，獲卵數(shù)、D3優(yōu)胚數(shù)、受精方式均不影響該組妊娠率（表3）。

表3 養(yǎng)囊失敗病人中影響卵裂胚凍胚移植妊娠結(jié)局的logistic分析結(jié)果Table 3 Multiple logistic regression analysis of factors affecting the clinical pregnancy rate of patients who had no transferable blastocysts

2.5 影響?zhàn)B囊成功組妊娠結(jié)局的多因素回歸分析

養(yǎng)囊成功組臨床妊娠率最高，46.9%。年齡不影響妊娠結(jié)局，＜35歲妊娠率與35～40歲妊娠率無差異（49.2%vs.47.1%），＞40 歲妊娠率略低（26.1%），但是病人例數(shù)較少，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。獲卵數(shù)、D3 優(yōu)胚數(shù)、可用囊胚數(shù)、移植胚胎質(zhì)量（是否移植優(yōu)胚）均不影響該組妊娠率，P＞0.05。剩余凍存囊胚數(shù)≥1 的妊娠率顯著高于無囊胚剩余組，OR 95%CI 為4.991（2.558，9.739），P＜0.001，此外，ICSI 組臨床妊娠率略高于常規(guī)IVF 組，OR 95%CI為1.78（0.99，3.22），P=0.055（表4）。

表4 養(yǎng)囊成功患者影響解凍卵裂胚移植臨床妊娠率的logistic回歸分析Table 4 Multiple logistic regression analysis of factors affecting the clinical pregnancy rate of patients who had failed pregnancy with frozen blastocyst transfer（s）

3 討論

解凍胚胎移植已經(jīng)有超過30 年的歷史，臨床妊娠率逐年提高，尤其是近年來采用玻璃化冷凍技術(shù)，囊胚復(fù)蘇率超過95%［6］。玻璃化冷凍采用高濃度的冷凍保護(hù)劑，在快速降溫過程中形成玻璃態(tài)，防止冰晶形成導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)損傷［7］。另一方面，隨著胚胎培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，囊胚培養(yǎng)、囊胚移植逐漸常態(tài)化，成為較多IVF 中心的主要移植模式，尤其是解凍單囊胚移植。為鼓勵病人選擇囊胚培養(yǎng)及移植，本中心為養(yǎng)囊病人常規(guī)凍存1 至2 枚卵裂期胚胎（年輕反應(yīng)好，或不適宜雙胎者冷凍1 枚；D3 胚胎質(zhì)量稍差者冷凍2 枚，1 枚優(yōu)胚加1 枚質(zhì)量中等的胚胎），其余胚胎養(yǎng)囊，以防止養(yǎng)囊失敗患者無胚胎移植。高齡或者卵巢儲備差的患者仍然常規(guī)行卵裂期胚胎凍存或移植。因此，本研究的目的是分析在目前以養(yǎng)囊及解凍囊胚移植為主的情況下，解凍卵裂期胚胎移植的妊娠結(jié)局及影響結(jié)局的因素。

本研究將解凍卵裂期胚胎移植周期分為無養(yǎng)囊組、養(yǎng)囊失敗組及養(yǎng)囊成功組，D3 無養(yǎng)囊組主要為高齡患者，以及卵巢儲備差的年輕患者。我們的結(jié)果與既往研究一致，影響妊娠率的主要因素是年齡以及胚胎質(zhì)量（表2）。小于35歲，臨床妊娠率可達(dá)49.0%（222/453）。如果同時移植優(yōu)質(zhì)胚胎，臨床妊娠率可達(dá)54.9%。因此，年輕少卵、胚胎評分高的患者無需養(yǎng)囊，解凍卵裂胚移植可獲得與囊胚移植相似的臨床結(jié)局，而囊胚培養(yǎng)的結(jié)果受體外培養(yǎng)條件的影響，培養(yǎng)液PH、滲透壓、培養(yǎng)環(huán)境的氧濃度、溫度、不同品牌的培養(yǎng)液、不同批號的培養(yǎng)液等均影響胚胎體外發(fā)育，造成一定程度的胚胎損耗［8-9］。因此，對于獲卵數(shù)及D3 胚胎數(shù)有限的患者，卵裂期胚胎冷凍及移植是更安全的選擇。

囊胚培養(yǎng)是通過延長胚胎培養(yǎng)，選擇更有發(fā)育潛能的胚胎，因此囊胚移植周期的種植率和活產(chǎn)率明顯高于卵裂期胚胎移植［10-11］。雖然體外胚胎培養(yǎng)技術(shù)逐年提高，但是目前尚不能完全模擬體內(nèi)環(huán)境，尤其是培養(yǎng)環(huán)境易于波動的實驗室，延長胚胎培養(yǎng)至囊胚階段可能進(jìn)一步影響胚胎發(fā)育潛力。另外部分患者的胚胎對外界環(huán)境可能更加敏感，早期凍存卵裂期胚胎可以保存胚胎的發(fā)育潛能。因此，為防止養(yǎng)囊失敗病人無胚胎移植，同時保證囊胚培養(yǎng)的效果，本中心通常僅冷凍1 枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎或者1 枚優(yōu)胚加1 枚質(zhì)量中等的胚胎，目的是把盡可能多的優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎用于囊胚培養(yǎng)，同時盡量降低解凍移植時的雙胎率。本研究中有98 例養(yǎng)囊失敗，占總養(yǎng)囊周期數(shù)的2.1%。此組病人無可用囊胚形成，提示此組病人總體D3 胚胎質(zhì)量較差，發(fā)育潛能較低，解凍移植后此組病人的臨床妊娠率明顯低于養(yǎng)囊成功組（36.7%vs.46.9%），但是略高于無養(yǎng)囊組，表明即使部分病人的胚胎體外無法發(fā)育到囊胚，早期移植后體內(nèi)可以繼續(xù)發(fā)育并成功種植。此組病人例數(shù)較少，多因素回歸分析顯示年齡、獲卵數(shù)、D3 優(yōu)胚數(shù)、受精方式及移植胚胎質(zhì)量（是否移植優(yōu)胚）不影響妊娠結(jié)局（表3），提示目前的常規(guī)指標(biāo)，尤其是D3 胚胎形態(tài)評分不能預(yù)測胚胎的發(fā)育潛能，以及妊娠結(jié)局。與全部胚胎養(yǎng)囊相比，在D3常規(guī)冷凍1至2枚胚胎可以給部分病人帶來額外的妊娠機(jī)會。

對于養(yǎng)囊成功組的病人，已經(jīng)優(yōu)先移植了1 至多枚囊胚，部分病人已經(jīng)移植完所有囊胚，有一次或者多次囊胚移植失敗史后選擇解凍卵裂胚移植。臨床妊娠共145例，其中99例有一次囊胚移植失敗史，36 例有兩次囊胚移植失敗史，8 例有移植三次囊胚失敗史，2 例有移植四次囊胚失敗史。此組病人，雖然有囊胚移植一次或多次失敗的病史，但總體妊娠率最高，各個年齡階段的妊娠率均高于另外兩組?？赡茉蚴谴私M病人有可用囊胚形成，表明總體胚胎的發(fā)育潛能較高，即使凍存的卵裂期胚胎沒有經(jīng)過囊胚培養(yǎng)篩選［12］。對于這些移植囊胚未能成功妊娠，而移植解凍卵裂期胚胎獲得臨床妊娠的病人，影響妊娠的主要因素可能是子宮內(nèi)膜與胚胎發(fā)育不同步。因此，當(dāng)有反復(fù)囊胚移植失敗時，解凍移植卵裂期胚胎可以增加胚胎種植的機(jī)會。本組病人中，回歸分析顯示年齡、獲卵數(shù)、D3 優(yōu)胚數(shù)、可用囊胚數(shù)及移植胚胎質(zhì)量（是否移植優(yōu)胚）不影響妊娠結(jié)局，而是否有剩余囊胚影響臨床妊娠率（表4）。我們認(rèn)為，在總體胚胎質(zhì)量都很好的情況下，剩余囊胚數(shù)更多提示更少的囊胚移植失敗次數(shù)，內(nèi)膜條件更好，胚胎質(zhì)量可能更好，因此臨床妊娠率更高，尚需在后續(xù)的研究中進(jìn)一步具體分析。另外，ICSI 病人的妊娠率有增加的趨勢，可能在胚胎質(zhì)量較好的情況下，ICSI 病人女方因素更少，內(nèi)膜接受性更好。

輔助生殖技術(shù)的最終目標(biāo)是獲得單胎、足月、健康活產(chǎn)嬰兒。雙胎妊娠屬于高危妊娠，可增加孕產(chǎn)婦妊娠期糖尿病、高血壓等并發(fā)癥，造成新生兒生長受限、早產(chǎn)、低出生體質(zhì)量等風(fēng)險［13-17］。本中心的解凍卵裂胚多胎率為24.6%（139/565），略低于中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會2018 年上報的新鮮與解凍周期雙胎率（新鮮周期28.64%；解凍周期26.9%）［18］，可能與我們選擇凍存的卵裂期胚胎質(zhì)量有關(guān)（1 枚優(yōu)胚+1 枚質(zhì)量中等的胚胎）。雖然現(xiàn)階段單卵裂期胚胎移植在臨床實施上仍有一定阻力［19］，我們已經(jīng)開始在年輕病人中開始行單卵裂期胚胎移植，降低卵裂期胚胎移植的多胎妊娠率，保證母嬰安全。

總之，我們的結(jié)果顯示，D3 冷凍卵裂胚移植的臨床妊娠率顯著低于常規(guī)的解凍單囊胚移植。但是，在養(yǎng)囊的基礎(chǔ)上凍存部分卵裂期胚胎，保證患者有胚胎移植，尤其對于養(yǎng)囊失敗的患者，即使體外培養(yǎng)沒有囊胚形成，移植凍存的卵裂期胚胎也有一定的臨床妊娠機(jī)會。對于反復(fù)解凍囊胚移植失敗的患者，移植卵裂期胚胎也可獲得較高的臨床妊娠率。因此，在目前養(yǎng)囊為主流的情況下，對于不同情況的患者在D3凍存少數(shù)卵裂期胚胎均可增加胚胎移植及妊娠的機(jī)會，是臨床開展囊胚培養(yǎng)、囊胚移植方案的有力補(bǔ)充及保障。