MMS21通過維持MCM2-7復(fù)合物穩(wěn)定性促進(jìn)肝細(xì)胞癌增殖活性

李文佳，朱元昕，胡開順

（中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心//廣東省惡性腫瘤表觀遺傳與基因調(diào)控重點實驗室，廣東廣州 510080）

肝癌是世界第六大常見的惡性腫瘤。在中國，肝癌更是位列腫瘤相關(guān)死亡原因第二位；其中，85%～90%屬于肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。早期診斷率低、有效治療藥物的缺乏、術(shù)后易復(fù)發(fā)等，是導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后差的主要原因［1］。因此，深入研究肝癌形成及進(jìn)展的分子機制，尋找新的診斷及治療靶點，仍然是目前肝癌研究的重要內(nèi)容。SUMO E3連接酶MMS21（NSMCE2），結(jié)構(gòu)上包含兩種染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白（Smc5/6）和一個Siz/PIAS（激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白抑制劑和轉(zhuǎn)錄激活因子）RING 結(jié)構(gòu)域，具有E3 連接酶活性并參與Small Ubiquitin-like Modifier（SUMO）進(jìn)程。當(dāng)E3 連接酶MMS21 的SUMO 活性被破壞時，會導(dǎo)致不同的表型，如DNA 損傷、核仁完整性和端粒聚集缺陷等［2］。MMS21 作為SMC5/6 復(fù)合體的亞基，同時也是停滯叉蛋白質(zhì)組的關(guān)鍵組成部分，能拮抗基因組不穩(wěn)定［3］。Zhao［2］和Branzei 等［4］發(fā)現(xiàn)在芽殖酵母中，MMS21 的缺失是致命的，雖然缺失其部分SUMO活性不完全致死，但造成復(fù)制相關(guān)DNA 修復(fù)缺陷。Richard 等［5］證明MMS21 通過維持DNA 修復(fù)、平衡轉(zhuǎn)錄和基因組穩(wěn)定性等在植物發(fā)育過程起到至關(guān)重要的作用。Kelvin 等［6］發(fā)現(xiàn)MMS21 是復(fù)制應(yīng)激修復(fù)反應(yīng)的基因產(chǎn)物，是細(xì)胞有效拯救折疊的復(fù)制叉以完成DNA 合成所必需的。然而MMS21在肝癌中的功能與作用機制尚未報道，我們將對此問題進(jìn)行全面探討，以期為肝癌的診斷和治療提供新的靶點和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表達(dá)載體pLVX-DsRed-Monomer-N1（Clontech，632152），胎牛血清（LONSERA，S712-012），總RNA 提取試劑盒（ESscience，RN001），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，RR047A-1），SYBR Green qPCRMix（TaKaRa，RR820），ECL 化學(xué)發(fā)光底物（Vazyme，E412-01-AA），高保真酶（TaKa-Ra，R040），限制性內(nèi)切酶BamH1（Thermo Scientific，ER0051），Xho1（Thermo Scientific，ER0691），GeneJET PCR 純化試劑盒（Thermo Scientific，K0702），T4 連接酶（Thermo Scientific，EL0014），粘附載玻片（CITOTEST，80312-3161），顯微鏡蓋玻片（CITOTEST，80340-3610），快速銀染試劑盒（Beyotime，P0017S），RNase（AG，A3A0336），PI（Beyotime，ST511），Lipofectamine?RNAiMAX（Thermo Scientific，13778150），anti-BrdU（ABclonal，A1482），DAPI（Beyotime，C1002），Goat anti-Mouse IgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary Antibody，Alexa Fluor 488（Thermo Scientific，A11001），anti-IdU（Origene，TA190129），anti-BrdU（Abcam，ab6326），Goat anti-Rat IgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary Antibody，Alexa Fluor 555（Thermo Scientific，A-21434），anti-MYC（Servicebio，GB12076），anti-Tubulin（TransGen Biotech，HC101-01），anti-Cyclin A2（CST，4656T），anti-Cyclin B1（CST，4138T），anti-Cyclin D1（PTG，60186-1-Ig），anti-Cyclin D3（CST，2936T），anti-Cyclin E1（PTG，11554-1-AP），anti-MCM2（BD，610700），anti-MCM3（PTG，15597-1-AP），anti-MCM4（PTG，13043-1-AP），anti-MCM5（PTG，11703-1-AP），anti-MCM6（BD，611622），anti-MCM7（PTG，11225-1-AP），anti-NSE2/MMS21（Santa，sc-51747）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SK-hep1、Huh7、HepG2、SNU-182 和LO2 細(xì)胞均來自中科院上海細(xì)胞庫，細(xì)胞在37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中使用含有10%的FBS 高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 PCR擴增MMS21

以SK-hep1 全基因組cDNA 為模板，高保真酶擴增目的基因。反應(yīng)條件為：98 ℃5 min；98 ℃10 s；55 ℃5 s；72 ℃1 min，進(jìn)行35 個循環(huán)。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，取正確大小的膠帶進(jìn)行回收純化。純化后的產(chǎn)物用BamH1 和XhoI 內(nèi)切酶37 ℃反應(yīng)1 h 后，純化片段，并用T4 連接酶將其連接到同樣酶切過后的Plvx表達(dá)載體中，通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化涂板，挑選出單克隆菌落，測序鑒定。MMS21 PCR擴增引物：F（含MYC標(biāo)簽）：CCCTCGAGATGGAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAGGATCTGAT -GCCAGGACGTTCCAGTTC；R：CGGGATCCTCCTA CTCGGAATGACGATGTC。

1.4 免疫沉淀與質(zhì)譜

采用10 cm 大皿擴增Plvx-MYC-MMS21 和Plvx-MYC-Vector 細(xì)胞，待細(xì)胞長到85%，去除上清，用1 mL 含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的NETN buffer（20 mmol/L Tris-HCl［pH 8.0］，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA and 0.5% Nonidet P-40）裂解液將細(xì)胞在冰上裂解30 min 并收集［7］。再用4 ℃15 000×g高速離心機去除細(xì)胞碎片沉淀，收集上清。在上清中加入用NETN buffer 清洗過三次的MYC標(biāo)簽的瓊脂糖珠，置于4 ℃冰箱搖床孵育過夜。將瓊脂糖珠-抗體-蛋白的混合物清洗三次，取90%樣品進(jìn)行銀染及質(zhì)譜分析，10%樣品在98 ℃高溫變性10 min，置于8%SDS-PAEG電泳膠。

1.5 DNA Fiber

在細(xì)胞密度70%～85%時，CIdU（50 μmol/L）處理20 min 后，用PBS 洗兩次，用IdU（500 μmol/L）處理20 min，用胰酶消化細(xì)胞并收集于1.5 mL EP 管中離心，用預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞沉淀，置于冰上30 min，將1 μL 細(xì)胞滴在載玻片靜置片刻，待液滴邊緣干燥時，加入裂解液7 μL并靜置2 min，再將載玻片傾斜（20°～40°角）使液滴緩慢流下，待玻片風(fēng)干后，固定并變性90 min，用PBS 洗3 min，用免疫熒光封閉液封閉30 min，加入一抗BrdU（Rat）/IdU（M）于4 ℃孵育過夜。第二天用PBST 清洗3 次，每次3 min，熒光二抗Goat anti-Rat IgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary Antibody，Alexa Fluor 555 和Goat anti-Mouse IgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary Antibody，Alexa Fluor 488 混合液常溫孵育1 h，用PBST 洗3 次后，載玻片依次用75%、95%和無水乙醇脫水。載玻片用蓋玻片封片后，在具有63倍物鏡的激光共聚焦顯微鏡下成像。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

細(xì)胞用siRNA 處理48 h后，用胰酶將細(xì)胞消化收集在1.5 mL EP 管中，常溫120×g低速離心機離心，細(xì)胞沉淀用預(yù)冷的PBS 清洗1 次后，用1 mL 預(yù)冷的PBS 和75%酒精混合物（1：9）重懸細(xì)胞沉淀。單細(xì)胞懸浮液在4 ℃固定過夜后，離心去上清，避光加入1 mL RNase 和PI 混合液（RNase 工作濃度2 μg/mL，PI 工作濃度50 μg/mL）并避光孵育30 min。處理后的單細(xì)胞懸浮液置流式管中，使用流式細(xì)胞儀測定，數(shù)據(jù)采用ModFit LT 5.0軟件進(jìn)行分析。

1.7 定量PCR

總RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄、qPCR：均使用購自Takara的提取，反轉(zhuǎn)錄、qPCR 試劑盒，參照說明書操作。β-actin 的qPCR 引物F：5’-TCATGAAGTGTGACGTGGACAT-3’，R：5’-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3’；MMS21 的qPCR 引 物F：5-ATGCCAGGACGTTCCAGTTC-3’，R：5’-CCATACCAGA GTTGATACA GGCT-3’。

1.8 細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染

在細(xì)胞密度40%～50% 時，進(jìn)行細(xì)胞siRNA（small interference RNA）干擾。具體實驗步驟如下：分別將5 μL Lipofectamine?RNAiMAX 試劑用150 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋成混合液（1），30 pmol siRNA 用150 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋成混合液（2）。再將混合液（2）加入混合液（1）中，室溫孵育5 min 后，加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中。細(xì)胞在37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。MMS21 siRNA序列如下：siMMS21#1：5’-UUCAACCAUUGCCUUGUCCTT-3’，siMMS21#2：5’-GACUGAAGUGAG UAGUGAAdTdT-3’。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，GraphPad Prism 8.0 軟件作圖。組間數(shù)據(jù)平均值比較采用Student′st-test檢驗。

2 結(jié)果

2.1 MMS21 在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)且與預(yù)后不良相關(guān)

為了闡述MMS21 在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們首先分析了MMS21在HCC 中的mRNA 表達(dá)水平。Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA）（http：//gepia.cancer-pku.cn/）的數(shù)據(jù)顯示，與160 例癌旁組織（N）相比，369 例肝細(xì)胞癌組織（T）中的MMS21 表達(dá)顯著上調(diào)（圖1A）。同時在數(shù)據(jù)庫clinical proteomic tumor analysis consortium（CPTAC）（https：//proteomics.cancer.gov/programs/cptac）中，對比HCC的癌旁組織，MMS21（NSMCE2）在肝癌組織中的蛋白水平也呈現(xiàn)高表達(dá)（圖1B）。值得注意的是，MMS21 的高表達(dá)與肝癌患者的不良預(yù)后相關(guān)（圖1C）。接下來，我們收集了正常肝細(xì)胞系LO2 和4 個肝癌細(xì)胞系（Huh7、SK-hep1、HepG2 和SUN-182）以做進(jìn)一步的證明。通過qPCR 和Western blot 分別檢測mRNA 和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞系中MMS21 的mRNA 和蛋白表達(dá)明顯高于正常肝細(xì)胞系（圖1D）。綜上所述，MMS21與肝癌的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。

圖1 MMS21在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)且與患者預(yù)后不良相關(guān)Fig.1 MMS21 was upregulated in HCC tissues and associated with poor prognosis

2.2 沉默MMS21阻礙肝癌細(xì)胞G1-S期的轉(zhuǎn)換

接下來，為證明MMS21 在肝癌增殖中的重要作用，我們分別敲低肝癌細(xì)胞SK-hep1 和HepG2中的內(nèi)源性MMS21 蛋白表達(dá)來進(jìn)行功能缺失實驗（圖2A）。細(xì)胞周期分析顯示，在MMS21 敲低的SK-hep1 細(xì)胞中G1 期比例增加，S 期比例減少，G2/M 期的比例減少；同樣在HepG2 細(xì)胞中，敲低內(nèi)源性MMS21 后，G1 期細(xì)胞比例增加，S 期細(xì)胞比例減少，G2/M 期細(xì)胞的比例減少（圖2B、2C）。

圖2 沉默MMS21阻礙肝癌細(xì)胞G1-S期的轉(zhuǎn)換Fig.2 MMS21 silence blocks the G1-S phase transition in HCC cells

2.3 沉默MMS21抑制肝癌細(xì)胞的增殖

為進(jìn)一步探討肝細(xì)胞癌中MMS21 的促增殖作用，我們利用BrdU和克隆形成試驗來評估MMS21對肝癌細(xì)胞SK-hep1和HepG2細(xì)胞增殖能力的影響。如 圖3A、3 所 示，在MMS21 敲低的SK-hep1 和HepG2 細(xì)胞中，SK-hep1 細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力顯著降低。在HepG2 細(xì)胞中也得到了一致結(jié)論，敲低內(nèi)源性MMS21后細(xì)胞的增殖能力顯著下降。

圖3 沉默MMS21抑制肝癌細(xì)胞的增殖Fig.3 Depletion of MMS21 inhibits HCC cells proliferation

2.4 沉默MMS21減慢DNA復(fù)制叉的速度

我們進(jìn)行了DNA Fiber 實驗以研究敲低MMS21 后對細(xì)胞復(fù)制叉動力學(xué)的影響，以進(jìn)一步明確MMS21 調(diào)控肝細(xì)胞癌增殖的分子機制。與對照細(xì)胞（～1.154 kb/min）相比，敲低MMS21 的細(xì)胞中表現(xiàn)出平均復(fù)制速度（～0.844 kb/min 和～0.9125 kb/min）顯著降低。這些結(jié)果表明MMS21在肝癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過程中發(fā)揮十分重要作用（圖4）。

圖4 沉默MMS21減慢DNA復(fù)制叉的速度Fig.4 MMS21 knockdown reduces the DNA replication-fork speed

2.5 MMS21互作蛋白組聚類分析

我們以上數(shù)據(jù)表明，MMS21 在肝癌細(xì)胞的增殖中發(fā)揮著重要作用。為了更深入地了解MMS21在HCC 形成中的潛在機制，我們采用質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)來鑒定MMS21的下游靶蛋白。在穩(wěn)定過表達(dá)MMS21 的SK-hep1 細(xì)胞中，Co-IP 后的銀染結(jié)果提示，與對照組相比，有較多差異蛋白存在（圖5A、5B）。進(jìn)一步，我們通過質(zhì)譜鑒定了MMS21的互作蛋白質(zhì)組。對比對照組和實驗組質(zhì)譜數(shù)據(jù)，鑒定出與MMS21 特異結(jié)合的641 個蛋白（圖5C）。通過對641 個互作蛋白進(jìn)行GO（Gene Ontology）分析，顯示MMS21 及其互作蛋白參與蛋白翻譯、定位、折疊，線粒體翻譯以及免疫反應(yīng)等細(xì)胞過程，同時利用3.6.3 Cytoscape 分析軟件，進(jìn)一步對與MMS21 相互作用的蛋白構(gòu)建蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)。值得注意的是，MMS21 的互作蛋白與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)，如Cyclin A2，MCM3/5/6等（圖5D-5F）。

圖5 MMS21互作蛋白組聚類分析Fig.5 Bioinformatic clustering analyses of MMS21 interactome

2.6 MMS21參與調(diào)控肝癌細(xì)胞的周期蛋白

細(xì)胞周期受到細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶等的共同調(diào)節(jié)。如圖6A 所示，在經(jīng)典細(xì)胞周期模型中，G1期細(xì)胞受生長因子刺激會導(dǎo)致D型細(xì)胞周期蛋白（Cyclin D1、D2 和D3）上調(diào)，進(jìn)而激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK4/6，形成的Cyclin D-CDK4/6 復(fù)合物與E 型細(xì)胞周期蛋白（Cyclin E1 和E2）及其相關(guān)激酶（主要是CDK2，但也有CDK1/3）磷酸化并使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白Rb 失活。在協(xié)同作用驅(qū)動下細(xì)胞進(jìn)入S 期，此時細(xì)胞周期蛋白A2（Cyclin A2）上調(diào)并與CDK1/2 結(jié)合促進(jìn)S期進(jìn)展。在第二個間隙階段（G2）之后，細(xì)胞周期蛋白B（Cyclin B）易位到細(xì)胞核，激活CDK1，并推動遺傳物質(zhì)分離到子細(xì)胞。通過質(zhì)譜結(jié)果，提示我們MMS21 可能參與調(diào)控細(xì)胞周期蛋白。為了驗證這一假說，我們進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析，結(jié)果顯示MMS21 敲低后，可以顯著降低S 期和G2/M 期的周期蛋白表達(dá)量，而對G1 期的前期周期蛋白沒有顯著變化，G1 期的后期周期蛋白E1 水平增加（圖6B）。微小染色體維持蛋白家族（minichromosome maintenance proteins，MCMs）是DNA 復(fù)制所必需的蛋白，MCM2-7形成的六聚體具有DNA解旋酶活性是DNA復(fù)制解旋酶的催化核心，在單個細(xì)胞的S期中確?；蚪MDNA 完全準(zhǔn)確的復(fù)制。為了進(jìn)一步證實MMS21 參與細(xì)胞周期的調(diào)控，我們敲低MMS21 蛋白后檢測MCM2-7 復(fù)合物的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)整個復(fù)合物蛋白水平都降低，其中MCM3/6 降低尤其明顯。綜上所述，MMS21 能夠影響細(xì)胞周期蛋白表達(dá)水平進(jìn)而調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖（圖6C）。

圖6 MMS21參與調(diào)控肝癌細(xì)胞的周期相關(guān)蛋白穩(wěn)定性Fig.6 MMS21 maintained the protein stability of several cell cycle regulators in HCC

3 討論

近年來，隨著手術(shù)方案的改進(jìn)以及新的化療方案等的出現(xiàn)，雖然肝癌患者的生存率較前有所提高，但是肝癌患者的預(yù)后仍然較差［8］。因此，深入闡明肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，對于尋找新的診斷及治療靶點、改善肝癌患者的預(yù)后具有十分重要的作用。

在本課題研究中，我們通過GEPIA 和CPTAC數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中MMS21 的mRNA和蛋白水平均呈高表達(dá)，并且其高表達(dá)與肝癌患者不良預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步，通過qPCR 和Western blot檢測LO2（人正常肝細(xì)胞）、Huh7、HepG2、SK-Hep1和SUN-182 等細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞系中MMS21 的mRNA 和蛋白水均顯著上調(diào)。提示，MMS21 在肝癌中可能發(fā)揮促癌的功能。同時在GEPIA 數(shù)據(jù)庫中，我們也發(fā)現(xiàn)MMS21 在膽管癌（CHOL）、彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤（DLBC）、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）、胰腺癌（PAAD）和胸腺癌（THYM）中均呈高表達(dá)，提示MMS21 在多種腫瘤中扮演促癌基因的角色。對于MMS21 在多種腫瘤中高表達(dá)的原因，我們推測可能有以下三個方面的因素：1、在DNA 水平，通過UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/）中的TCGA 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，相比于癌旁組織，在肝癌組織中MMS21 的啟動子甲基化水平更低，提示MMS21 啟動子的去甲基化與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；2、在轉(zhuǎn)錄水平，利用miRDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.mirdb.org/）預(yù)測MMS21 可能相互作用的microRNA，發(fā)現(xiàn)其可作為miR-3143，miR-498-5p，miR-302c-5p，miR-6798-3p，and miR-31-3p 等microRNA 的靶基因。Jing 等［9］發(fā)現(xiàn)在宮頸癌細(xì)胞中miR-31-3p顯著下調(diào)，體外過表達(dá)miR-31-3p能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的惡性行為和EMT，提示我們microRNA 可能參與調(diào)控MMS21 的mRNA 表達(dá)水平；不過我們也不排除還有其他潛在的轉(zhuǎn)錄因子，在轉(zhuǎn)錄水平介導(dǎo)MMS21 的表達(dá)，我們后續(xù)將進(jìn)一步實驗研究證明；3、在蛋白水平，通過分析Co-IP聯(lián)合質(zhì)譜鑒定MMS21 的互作蛋白，我們發(fā)現(xiàn)MMS21 與去泛素化酶（DUB）家族中的USP5/33/37/53 有相互作用，這提示我們?nèi)シ核鼗敢矃⑴cMMS21 的蛋白穩(wěn)定性調(diào)節(jié)，對此我們將在接下來研究中深入探討。Jacome 等［10］在轉(zhuǎn)基因鼠的研究發(fā)現(xiàn)，MMS21 的單拷貝缺失可以增加淋巴瘤等腫瘤的發(fā)生率，而且這種作用并不依賴于其SUMO 化酶活性。Potts 等［11］報道，在骨肉瘤細(xì)胞中，MMS21參與形成的SMC5/6復(fù)合體能夠調(diào)節(jié)端粒結(jié)合蛋白的SUMO 化修飾，介導(dǎo)端粒的同源修復(fù)和延長抑制腫瘤細(xì)胞的衰老。然而，Ni 等［12］發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌MCF-7 細(xì)胞中，MMS21 參與細(xì)胞DNA 損傷修復(fù)和細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程導(dǎo)致細(xì)胞增殖受阻。因此，MMS21 在不同的研究模型或腫瘤中，可能通過不同的機制發(fā)揮著截然不同的作用。然而MMS21 在肝癌中的功能及作用機制目前尚未見報道。在本研究中，我們通過流式細(xì)胞術(shù)、BrdU、DNA Fiber 等多種方法檢測了MMS21 對肝癌細(xì)胞增殖等影響。結(jié)果表明，當(dāng)MMS21 缺陷時能夠明顯抑制肝癌的細(xì)胞周期進(jìn)程，阻礙細(xì)胞由G1 向S 期的轉(zhuǎn)換，從而使其阻滯在G1 期。MMS21 已被證明有助于DSB修復(fù)、暫停復(fù)制叉重啟和HR 的端粒伸長［13］。當(dāng)復(fù)制叉遇到阻力會導(dǎo)致復(fù)制叉停頓，DNA Fiber 技術(shù)已成為直接監(jiān)測DNA 復(fù)制叉動力學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)［14］。DNA Fiber 分析結(jié)果表明，敲低MMS21 能阻礙復(fù)制叉的前進(jìn)，抑制DNA合成速度，這提示MMS21與肝癌細(xì)胞復(fù)制叉進(jìn)程有關(guān)。MMS21作為SMC5/6復(fù)合體的一員，在調(diào)節(jié)DNA 損傷修復(fù)過程中具有重要作用，而DNA 損傷與細(xì)胞周期的有序進(jìn)行密切相關(guān)［15］。為了更直接的闡明MMS21 調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用，我們通過Co-IP 聯(lián)合質(zhì)譜鑒定的方法檢測了MMS21 的互作蛋白組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MMS21 的互作蛋白主要與細(xì)胞周期相關(guān)通路有關(guān)。這提示我們，除了通過調(diào)節(jié)DNA 損傷修復(fù)間接促進(jìn)細(xì)胞周期的正常進(jìn)行，MMS21 還可以通過結(jié)合細(xì)胞周期相關(guān)蛋白直接調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。為了證實這一猜想，我們檢測了MMS21對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)MMS21能夠調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，敲低MMS21 能下調(diào)S 和G2 期周期蛋白Cyclin A2 和Cyclin B1的蛋白水平同時上調(diào)G1后期蛋白Cyclin E1水平，提示MMS21的缺陷導(dǎo)致細(xì)胞阻滯在G1期，抑制G1/S的轉(zhuǎn)變。MCMs蛋白家族在所有真核生物中具有高度保守性［16］。既往研究將MCM 確定為DNA復(fù)制起始的核心參與者［17］。最近的研究表明，MCM 蛋白也在復(fù)制延長中起作用，可能作為DNA解旋酶［16］。MCMs 在整個細(xì)胞周期中組成性地定位于細(xì)胞核中，它們與染色質(zhì)結(jié)合，受細(xì)胞周期蛋白調(diào)控［18-19］，同時MCM 與擴展復(fù)制叉相關(guān)聯(lián)，其動力學(xué)與DNA 合成因子相似，隨著復(fù)制叉的擴展而移開［20-21］。我們在質(zhì)譜蛋白互作數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，MMS21 與MCM2/3/5/6 相互作用，同時敲低MMS21能下調(diào)MCM2-7 復(fù)合物內(nèi)的幾乎所有蛋白的穩(wěn)定性。然而，MMS21 對其結(jié)合的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)是否依賴于其SUMO 化酶活性以及具體的調(diào)節(jié)靶蛋白是什么，以及MMS21 對于MCM2-7 復(fù)合物的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)具體機制，目前尚不清楚。我們將通過后續(xù)研究對此問題進(jìn)行深入闡明。

綜上所述，本研究證實MMS21 在肝癌中高表達(dá)，并促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長，其機制為調(diào)控細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶表達(dá)，同時影響MCM2-7 復(fù)合物的蛋白水平。這些數(shù)據(jù)表明MMS21 可能是肝癌診治的潛在新靶標(biāo)，為肝癌的診斷和治療提供新思路。