人多能干細胞在帕金森綜合癥治療與研究中的作用

陶夢丹，劉 妍

（1.東南大學生物科學與醫(yī)學工程學院，江蘇南京 210096；2.南京醫(yī)科大學藥學院干細胞與神經再生研究所，江蘇南京 211166）

帕金森綜合癥（Parkinson′s disease，PD）又名震顫麻痹，由英國醫(yī)學家兼地質學家James Parkinson 在其個人專著《論震顫麻痹》中首次提出［1-2］，現(xiàn)已成為繼阿爾茲海默病之后，第二常見的慢性中樞神經系統(tǒng)退行性疾病［3］。截至2020年，全球已超過6 百萬帕金森綜合癥患者［4］，且患病率逐年增加［5］，給個人、家庭以及整個社會帶來了沉重的負擔。因此，探究有效的治療方式以及明確發(fā)病機制極具意義。迄今為止，帕金森綜合癥治療方案仍以藥物治療及手術治療法為主。藥物治療的主要機制在于增加腦內的多巴胺遞質。然而藥物治療雖可延緩病程，但無法進行根治。此外，藥物治療具有脫靶效應以及嚴重的不良反應，如“開關”現(xiàn)象等［6］。手術治療以深層腦部刺激（deep brain stimulation，DBS）為主，該法旨在利用電脈沖引起腦內神經元的異常放電來調控患者行為。DBS 常用于治療對于藥物治療或其他治療無效的嚴重患者［7］。然而DBS 具有一定有限性：①極易引起顱內出血，其治療效果也難以控制［8］；②手術治療費用高；③僅適用于PD 晚期且未癡呆患者。近二十年來，隨著研究深入，帕金森綜合癥的治療手段層出不窮。其中，干細胞治療法成為了研究熱點之一［4］。1981年，Evans 和Kaufman 首次將小鼠胚胎干細胞進行分離，并證明小鼠胚胎干細胞不僅可以維持其多能性，還可被誘導分化為心肌細胞、神經細胞、造血細胞等。該分離技術的成功建立為1998 年Thomson等人從胚泡中成功分離人胚胎干細胞（human embryonic stem cell，hESC）提供了前提［9］。雖然研究者運用hESC進行許多人類胚胎發(fā)生以及疾病相關的研究，并取得了巨大的進展，但鑒于人胚胎干細胞來自人類胚胎，其數量有限性以及倫理限制性成為人胚胎干細胞發(fā)展的主要制約因素。而后，2006年，Yamanaka 等［10］利用逆轉錄因子Sox2（sex determining region Y-box2），c-Myc（myelocytomatosis），Oct3/4（octamer-binding transcription factor 3/4）和Klf4（Kruppel-like factor 4）誘導小鼠成纖維細胞產生具備無限增殖且多分化潛能的hiPSC。hiPSC 與hESC 具備相似的分化潛力、形態(tài)、基因等特征。hiPSC不僅可極大地避免hESC引發(fā)的倫理問題，還包含了供體細胞的遺傳基因等背景，理論上更適合于個體化醫(yī)療的研究［11］。干細胞治療機制在于利用外源性多巴胺能神經元替代內源性受損細胞。研究者首先將hPSC 進行定向誘導分化，之后再將所得細胞移植入黑質等特定區(qū)域。干細胞移植治療法為帕金森綜合癥的治愈帶來了希望。除治療外，hPSC 作為生物模型，在帕金森綜合癥機制研究中也發(fā)揮著不可或缺的作用。理想的帕金森綜合癥模型應當可模擬人類疾病表征以及疾病進程。然而化學損傷模型作為常用的帕金森綜合癥模型［12］，雖可以部分模擬帕金森綜合癥患者的臨床癥狀，如運動遲緩，靜止性震顫等，但其無法重現(xiàn)患者腦內的神經變性以及蛋白異常聚集的病變過程。此外，轉基因帕金森綜合癥小鼠模型較少能觀察到黑質區(qū)域的神經損傷［13］。因此，亟須一種可模擬病情進展的疾病模型出現(xiàn)。人多能干細胞衍生而得的帕金森綜合癥中腦類器官模型的發(fā)育過程類似于人類中腦的發(fā)育過程，理論上可模擬不同階段的帕金森綜合癥征。并且，研究表明，該類器官模型可良好地模擬路易小體聚集等病理現(xiàn)象［14］。類器官彌補了細胞簡單模型以及動物復雜模型的不足之處，為帕金森綜合癥等神經退行性疾病的研究提供了重要的實驗平臺（圖1）。

圖1 基于hPSC技術進行疾病模型建立的示意圖Fig.1 Schematic representation of pluripotent stem cell generation and application

1 hPSC 在帕金森綜合癥治療研究中的進展

1980 年，奧爾森等人將腎上腺髓質細胞植入PD 患者的紋狀體內。結果闡明，富含兒茶酚胺的細胞植入物對患有嚴重帕金森綜合癥的患者具有短暫的有益效應［15］。此后，研究者將富含多巴胺能神經祖細胞的胚胎腹側中腦組織移植到帕金森綜合癥患者的殼核中。患者的行為障礙不僅得以顯著改善，患者腦內產生大量的外源性多巴胺神經元并存活24 余年［16］。然而，胚胎腹側中腦組織經移植后，雖可以在體內產生新的多巴胺能神經元，并且該神經元可與宿主內的神經環(huán)路整合，但也僅有3%-5%的外源性神經元存活，遠不足腦內所需量［17］。此外，人胚胎腹側中腦組織的獲取受倫理限制，無法大量運用。這些因素都極大的限制了胚胎組織移植治療的發(fā)展。組織移植治療結果雖良莠不齊，但細胞替代治療法的可行性有目共睹。因此，如何獲得足量且有效的外源性多巴胺神經元成為研究者們關注的焦點之一。

一般而言，多能干細胞具有多向分化潛能，并不適宜直接移植。并且，神經干細胞傾向于分化為星形膠質細胞以及中間神經元［18］，無法在腦內產生足量的多巴胺能神經元。因此，移植多巴胺能前體細胞更具有可行性和安全性。2006 年，Roy 等［19］首次將hESC來源的多巴胺能神經前體細胞移植入小鼠腦內。經檢測，鼠腦內存在大量具有黑質表型的外源性多巴胺能神經元，小鼠行為也得以改善。然而，于鼠腦內，可觀測到大量具有致瘤潛質的處于有絲分裂期的神經上皮細胞。之后，Kirkeby［20］、Kirkes 等［21］將hPSC 誘導方案進行優(yōu)化，他們在分化過程中添加了SMAD 信號雙重抑制劑以及高濃度的Sonic Hedgehog，以促進多巴胺能前體細胞的產生。所得細胞經移植后，鼠腦內未有畸胎瘤產生。此后，hESC 誘導所得的多巴胺能前體細胞移植治療在非人類靈長動物模型中也展現(xiàn)了優(yōu)異的結果［22］，極大的推動了干細胞移植治療帕金森綜合癥的臨床試驗。然而，移植治療實驗中，模型動物需較長時間地被給與免疫抑制劑，如SRL、FTY720、FK506 等。免疫抑制劑雖可以降低患者的免疫排斥反應，但長期使用，會出現(xiàn)腎功能損傷、中性粒細胞減少等不良反應。要在臨床試驗中使用基于多能干細胞的療法，不僅需要克服宿主對外源性細胞的排斥反應，還需減弱甚至避免免疫抑制劑的副作用?？茖W家認為，hiPSC源自患者體細胞，具有與患者相同的遺傳背景。因此在應用理論上，hiPSC可以顯著減少甚至消除免疫反應的產生。將iPSC 誘導分化為神經元，為之后hiPSC 來源的多巴胺能前體細胞移植實驗提供了基礎。2013 年，Morizane［23］將自體移植與異體移植進行對比，研究結果表明自體移植會減少約50%的排斥反應，或將解決免疫排斥問題。2017 年，來自日本京王大學的Kikuchi［24］將人源性多能干細胞誘導產生的多巴胺能前體細胞移植入帕金森綜合癥靈長類動物模型的紋狀體中，并利用MRI以及正電子發(fā)射斷層掃描技術（PET）檢測移植細胞的存活、擴增、整合以及宿主的免疫反應。研究表明，人源性多巴胺能前體細胞移植治療對模型動物的組織學以及行為學均有改善作用。

至此，hPSC 衍生的多巴胺能前體細胞移植試驗均已進入臨床試驗期。2017年5月，我國科學家周琪領先于全球，進行了hESC 源的多巴胺能前體細胞移植治療帕金森綜合癥的臨床試驗。此外，于2018 年，Barker 等［25］首次進行hiPSC 源的多巴胺能前體細胞移植治療帕金森綜合癥的人體實驗。2020 年5 月，Schweitzer 及其同事完成了全球首例帕金森綜合癥人自體誘導的中腦多巴胺能神經元前體細胞移植實驗，實現(xiàn)了帕金森綜合癥人運動功能完全恢復的案例。充分證明了神經前體細胞移植，是重構受損的腦環(huán)路以及治療神經退行性疾病的重要途徑［26］，也是繼藥物治療和手術治療之后的第三大醫(yī)學干預模式。

2 hPSC 在帕金森綜合癥機制研究中的進展

2.1 帕金森綜合癥中腦類器官模型的建立

2008年，Park及其同事首次將病人體細胞誘導轉化為hiPSC，成功構建唐氏綜合征、亨廷頓、帕金森綜合癥患者來源的hiPSC［27-28］。之后，研究人員利用2D 培養(yǎng)體系將hiPSC 誘導分化為神經元，作為體外分化以及發(fā)育調控研究的模型，如對精神分裂癥［29-30］、雙相情感障礙［31-32］、抑郁癥［33］、帕金森綜合癥等［34-35］的研究。然而，盡管2D 培養(yǎng)技術相對成熟及穩(wěn)定且疾病研究也取得了相應的成果，但2D 培養(yǎng)無法良好地模擬腦內三維空間上的結構以及由各種因子和信號所組成的復雜的微環(huán)境，更無法準確概括細胞與細胞/細胞外基質之間的相互作用［36-37］。研究表明，2D所得的多巴胺能神經元雖具備部分病理特征，如上調的氧化應激的敏感性［35］，但分化所得神經元不僅成熟度較低［38］，目前也極少有報道表明該模型可模擬路易小體的異常聚集現(xiàn)象［39］。

為了更好的探究帕金森綜合癥患者腦內細胞的狀態(tài)，研究者采用類器官技術進行探究。類器官是指在體外環(huán)境下產生的具備三維結構的微型模器官，可模擬部分人體組織或器官的生理功能。并且，組成類器官的細胞具有與體內發(fā)育過程相似的定向分化性［40］。研究表明，類器官與腦內器官具有極高的相似度［41］。類器官培養(yǎng)技術最早期運用于小腸類器官的建立［37］，直至2013 年，人腦類器官才得以建立，例如Lancaster［42］建立的皮層類器官、Muguruma［43］建立的小腦類器官等。

中腦是多巴胺能神經元的主富集區(qū)域，該區(qū)域參與控制一系列聽覺、視覺以及運動，是人腦不可或缺的區(qū)域之一。2016 年，新加坡科學家Jo 與其同事建立了模擬人中腦結構的類器官模型［44］，并通過一系列手段證明了該模型的功能活性。此外，研究者在該類器官模型內檢測到多巴胺能神經元的主要標志物神經黑色素。在此基礎上，研究者們也通過自體衍生的iPSC 建立了具有自身遺傳信息的帕金森綜合癥中腦類器官模型［45］。帕金森綜合癥中腦類器官模型的建立為帕金森綜合癥發(fā)病機制的闡明以及分子機制的研究提供了平臺（表1）。

表1 2D多巴胺能神經元及3D中腦類器官分化方法Table 1 Differentiation of 2D dopaminergic neurons and 3D midbrain organoids

2.2 帕金森綜合癥中腦類器官模型的應用與展望

自帕金森綜合癥中腦類器官技術建立以來，已有許多科學家依此進行分子機制等層面的探究且取得了良好的研究成果。如Kim［46］利用患者自體體細胞建立含有自身遺傳信息的hiPSC，并結合中腦類器官分化技術成功模擬了G2019S-LRRK2 散發(fā)性帕金森綜合癥。研究者證明該中腦類器官可呈現(xiàn)與PD 患者相似的病理學特征，如α-突觸核蛋白異常聚集及清除。除此之外，研究者還發(fā)現(xiàn)TXNIP 可以介導G2019S-LRRK2 的病理表型，該發(fā)現(xiàn)不僅為治療該疾病提供了新的藥物作用靶點，也為靶向性藥物的篩選提供了新的方向。

類器官模型除了可應用于細胞水平機制的探究外，或可運用于亞細胞水平機制的研究，如對多巴胺能神經元內遞質釋放等行為的探究。遞質作為生物信息傳遞的要素之一，是細胞維持正常活動的基本元素。單細胞內遞質釋放的準確檢測對探索相關疾病研究具有重要意義。細胞內遞質儲存于囊泡內。囊泡膜由磷脂層、跨膜蛋白以及細胞膜表面的親水化合物組成，其內含物的正常釋放是維持細胞機能的重要機制之一［47］。α-突觸蛋白的異常聚集已被證明與家族型帕金森綜合癥相關。有研究報道表明該蛋白可通過與磷脂的結合發(fā)生作用，并累積于突觸前端，從而造成囊泡釋放障礙［48］。因此，實時準確的檢測囊泡釋放的方法是帕金森綜合癥分子機制研究中不可或缺的一部分。遞質的檢測一般有微量透析法、高效液相法（HPLC）、伏安法等。以往研究中常使用微量透析法和高效液相法，它們雖可以檢測環(huán)境內多巴胺濃度的變化，但無法實現(xiàn)在體的神經遞質檢測。伏安法主要利用了多巴胺具有易氧化的特性，當外界給予700～1200 mV 的電壓刺激時，多巴胺能神經元內囊泡中所含的分子得以釋放并發(fā)生氧化還原反應，之后該分子釋放的電子產生電流信號。該方法優(yōu)勢在于其可進行多巴胺釋放時的實時監(jiān)測與定量分析，為多巴胺的在體檢測提供可能［49］。2014 年，周專課題組［50］將人源性多巴胺能神經前體細胞移植入帕金森綜合癥小鼠內，并通過微透析的高效液相色譜法和電化學碳纖維電極共同測定。結果顯示在體外（腦片）和體內紋狀體中均有出現(xiàn)多巴胺釋放和再攝取的恢復。該實驗表明了電化學碳纖維電極檢測腦內多巴胺的釋放以及再攝取的可行性，但該實驗的檢測仍停留于多細胞水平，普通的微電極用于單突觸及單個囊泡的釋放的檢測依然面臨著巨大的挑戰(zhàn)。隨著研究的不斷深入，納米電極的制備技術使得檢測單個突觸間隙遞質，甚至單個囊泡的釋放成為了現(xiàn)實［51］。然而，如何進行人源性單細胞甚至單囊泡水平的神經遞質多巴胺的檢測尚未見報道。

帕金森綜合癥類器官模型的建立為人源性單細胞的檢測提供了平臺。因此，之后研究中或可將帕金森綜合癥類器官模型與納米電極相結合，應用于單細胞中單個囊泡儲存與釋放行為檢測，并以此探究人類帕金森綜合癥進程中囊泡釋放與重攝取行為的差異以及特異性分子等在神經遞質釋放中的作用，為帕金森綜合癥的病因研究提供支持。

隨著干細胞技術的不斷革新與優(yōu)化，科學家運用hPSC 進行了許多開創(chuàng)性試驗，為帕金森綜合癥等神經退行性疾病的治愈帶來了新的希望。此外，hPSC 衍生所得的中腦類器官也已成為了帕金森綜合癥機制研究中不可或缺的模型之一。然而，目前為止，類器官仍具有一定的局限性，如缺乏血管［52］以及免疫細胞，細胞類型及亞型也有所缺失等［53-54］。但隨著共培養(yǎng)體系等科研手段的不斷突破，類腦器官的功能與性狀正不斷趨向于人類大腦，可更好的模擬神經退行性疾病?？傊?，多能干細胞在組織替代治療，疾病形成的機制、藥物實驗等方面具有極大的探究與應用價值。