PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用與發(fā)展

魏明斌

（黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)職業(yè)學(xué)院食品藥品工程系 黑龍江牡丹江 157041）

食品安全是我國(guó)民生基礎(chǔ)性工程的重要組成部分。當(dāng)前，在社會(huì)經(jīng)濟(jì)生活快速發(fā)展的今天，食品安全已經(jīng)為人們所高度關(guān)注，特別是食品行業(yè)處于快速發(fā)展階段，生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸和銷售等環(huán)節(jié)都有可能遭受來(lái)自各種環(huán)境下的污染，而這之中微生物污染在食品安全中可能尤為嚴(yán)重。食品的微生物污染可能不僅會(huì)導(dǎo)致人的身體受到傷害，嚴(yán)重者甚至可能出現(xiàn)危及生命的情況，因此，對(duì)食品的微生物檢測(cè)工作刻不容緩。有效的PCR技術(shù)可以對(duì)食品中的危害物質(zhì)進(jìn)行詳細(xì)的檢測(cè)，并可以做到及時(shí)發(fā)現(xiàn)、準(zhǔn)確掌握、精準(zhǔn)處理，適時(shí)做好人們的身體保健工作。在檢測(cè)食品的微生物時(shí)，在眾多的檢測(cè)技術(shù)中，PCR 技術(shù)更加快捷、方便、易操作，且在我國(guó)的食品檢測(cè)技術(shù)中占據(jù)了主導(dǎo)地位，成為我國(guó)食品檢測(cè)的關(guān)鍵技術(shù)之一，對(duì)解決好我國(guó)的食品安全起到了重要的作用［1］。

1 PCR技術(shù)的相關(guān)介紹

1.1 PCR技術(shù)的概念

PCR技術(shù)是在20世紀(jì)70年代由Khorana提出的原始的設(shè)想，而這種技術(shù)理論在當(dāng)時(shí)看來(lái)是不太可能實(shí)現(xiàn)的，直到20世紀(jì)80年代才被美國(guó)的科學(xué)家Kary Mullis正式研究出來(lái)［2］。PCR技術(shù)研制成功后，馬上就成為了重要的基因技術(shù)，特別是用于食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域，不僅提高了檢測(cè)效率，還帶來(lái)了檢測(cè)的便捷。PCR 技術(shù)主要一種對(duì)檢測(cè)因子內(nèi)的DNA 的天然復(fù)制的過(guò)程，并可以用于體外復(fù)制增擴(kuò)DNA分子的生物科學(xué)技術(shù)，而此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用還要針對(duì)兩段已知的序列間的DNA 的片段。另外，在PCR 技術(shù)之中，光學(xué)定量檢測(cè)技術(shù)是以熒光能量傳輸為基本理論技術(shù)，結(jié)合PCR 的光學(xué)定量理論，利用其受體散色團(tuán)的偶極性能以傳遞能量轉(zhuǎn)移，而在這個(gè)過(guò)程之中，在受體熒光的散光強(qiáng)度和DNA的數(shù)量之間的關(guān)系是成正比，這樣有利于更好地掌握靶序的列的初始濃度，進(jìn)而得到熒光的實(shí)際濃度。

1.2 PCR技術(shù)的原理

PCR 技術(shù)實(shí)際是一種用于食品微生物的檢測(cè)技術(shù)，它經(jīng)過(guò)了變性、退火、延伸等過(guò)程。PCR 技術(shù)的經(jīng)變階段其實(shí)主要是讓DNA的雙鏈開(kāi)展；PCR技術(shù)的退火階段主要是將DNA的單鏈與特性實(shí)驗(yàn)物進(jìn)行結(jié)合；PCR技術(shù)的延伸階段是以DNA的單鏈為主板，在聚合酶等物質(zhì)的作用下進(jìn)一步合成所需要的DNA。因此，在應(yīng)用PCR 技術(shù)的同時(shí)，可以收獲大量的DNA，從而可以對(duì)這些DNA進(jìn)行有效的科學(xué)分析，通過(guò)對(duì)比DNA的序列和豐度，可以準(zhǔn)確地鑒別出微生物的數(shù)量及種類。并且，對(duì)于即使是少量的微生物，PCR技術(shù)也能夠及時(shí)檢測(cè)，并能夠提升檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。而截至目前，在我國(guó)的食品檢測(cè)領(lǐng)域，學(xué)者把PCR技術(shù)應(yīng)用于日常的食物微生物的檢測(cè)之中［3］。

1.3 PCR技術(shù)所需的原料

PCR技術(shù)需要多種原料互相作用才能完成檢測(cè)，而隨著PCR技術(shù)的進(jìn)步，所需的原料數(shù)量也在逐漸增加。下文結(jié)合PCR技術(shù)的工作實(shí)際，簡(jiǎn)要論述這些原料。

第一，特異性引物。需要事先準(zhǔn)備好一些引物，而這些引物的作用是與微生物發(fā)生關(guān)系，但是，這些引物不可以結(jié)合在食物的其他成分中，并且長(zhǎng)度應(yīng)只有15～20 個(gè)堿基。兩個(gè)引物間是不可以發(fā)生反應(yīng)的，引物對(duì)于PCR 技術(shù)來(lái)說(shuō)是非常重要的，其可以直接影響到PCR技術(shù)上的成功，因此，應(yīng)對(duì)其極為重視。

第二，DNA 聚合酶。它的主要功用是將引物與微生物的DNA進(jìn)行組合搭配。然而，引物一般是選自于特定的一段DNA，如果與微生物自動(dòng)組合會(huì)產(chǎn)生一定的困難，但是，DNA 的聚合酶實(shí)際上還有一個(gè)功能，就是催化，而DNA 的聚合酶又具有一定的耐高溫性，在90℃時(shí)仍然不會(huì)失活，因此，DNA的聚合酶催化引物與之完成組合。

第三，緩沖液。緩沖液主要是用來(lái)保護(hù)DNA的聚合酶，使其發(fā)揮出促進(jìn)引物與微生物結(jié)合的能力，這是因?yàn)榫酆厦傅幕钚员容^差，容易受到外界的干擾和影響。

1.4 PCR技術(shù)檢測(cè)食品微生物的環(huán)節(jié)

PCR技術(shù)檢測(cè)食品微生物的主要環(huán)節(jié)有兩個(gè)。一是引物的設(shè)置。這是因?yàn)橐镌O(shè)置會(huì)關(guān)系到PCR擴(kuò)增的特異性及是否能夠設(shè)置成功，而PCR 引物對(duì)擴(kuò)增的特異性也起到了關(guān)鍵的作用。這是因?yàn)殡S著生物學(xué)分子研究領(lǐng)域的快速發(fā)展，有許多的微生物的基因序列被人們所發(fā)現(xiàn)，這就使得引物的設(shè)計(jì)也變得非常的簡(jiǎn)單。然而，引物設(shè)置的準(zhǔn)確性是對(duì)于所檢測(cè)的對(duì)象的背景和情況的了解。二是制備的模板。目標(biāo)模板的純度和大量的目標(biāo)分子對(duì)于PCR檢測(cè)結(jié)果的可靠性來(lái)說(shuō)具有決定性作用，而大部分的PCR 則必須要選擇于富集步驟。

1.5 PCR技術(shù)檢測(cè)食品微生物的注意事項(xiàng)

PCR 技術(shù)檢測(cè)食品微生物過(guò)程中，有以下兩個(gè)注意事項(xiàng)。一是對(duì)不能對(duì)檢測(cè)對(duì)象的生物活性進(jìn)行系統(tǒng)的分析。DNA 檢測(cè)對(duì)于任何一個(gè)可以提供核酸物質(zhì)的樣品都可以適用，然而，PCR的擴(kuò)增并不是只針對(duì)活細(xì)胞，因此，對(duì)于PCR 技術(shù)來(lái)說(shuō)，不能對(duì)生物的活性進(jìn)行檢測(cè)和鑒別。二是對(duì)PCR模板的設(shè)置。對(duì)食品的微生物檢測(cè)時(shí)，因?yàn)槭称分写嬖谥鳳CR的抑制因子，會(huì)干擾和影響到檢測(cè)的結(jié)果，因此，要將食品中的PCR的抑制因子用特定的方法進(jìn)行消除。所以，PCR 模板的設(shè)置對(duì)微生物核酸的提取和食品樣品的處理都是非常的關(guān)鍵和重要的，特別是在直接處理食物的樣品時(shí)，必須要制備出合格的PCR模板［4］。

2 PCR 技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用的重要意義

人類離不開(kāi)對(duì)食品的攝取，然而，由于近些年出現(xiàn)的各類污染問(wèn)題，食品安全日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，與人們的生命、身體健康和生活品質(zhì)息息相關(guān)，并且，在某些地區(qū)，食品安全問(wèn)題現(xiàn)在呈現(xiàn)出日益惡化的趨勢(shì)。因此，不斷強(qiáng)化食品安全意識(shí)，對(duì)推動(dòng)人類社會(huì)可持續(xù)發(fā)展具有至關(guān)重要的意義。截至目前，有許多的食品企業(yè)在生產(chǎn)和銷售的過(guò)程中仍然會(huì)受到微生物的侵染，進(jìn)而對(duì)人們的身體健康和生活質(zhì)量造成不必要的影響和傷害。那么，為了盡可能消除食品的微生物污染源，利用PCR 技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，起到了非常重要的意義。

2.1 PCR技術(shù)檢測(cè)食品微生物操作方便、簡(jiǎn)單、實(shí)用

相對(duì)于傳統(tǒng)的自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)而言，PCR 技術(shù)對(duì)食品微生物檢測(cè)具備著耗費(fèi)時(shí)間較短、消耗比較小和工作效率較高的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)，因此，PCR技術(shù)對(duì)食品微生物檢測(cè)具有很高的效率性影響。對(duì)傳統(tǒng)的自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行分析研究，會(huì)發(fā)現(xiàn)在食品微生物的檢測(cè)過(guò)程中，傳統(tǒng)技術(shù)需要對(duì)食品微生物的許多方面進(jìn)行系統(tǒng)的檢測(cè)，如對(duì)微生物的生長(zhǎng)溫度、環(huán)境與培養(yǎng)基等，這些都需要增加傳統(tǒng)檢測(cè)的時(shí)間，耗費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力去完成，并且，傳統(tǒng)檢測(cè)的流程相對(duì)比較麻煩，即便花費(fèi)許多的人工及時(shí)間，仍可能達(dá)不到食品微生物檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)和效益。PCR技術(shù)檢測(cè)食品微生物會(huì)顯得更加方便與快捷，這是因?yàn)镻CR 技術(shù)檢測(cè)食品微生物應(yīng)用到了人機(jī)一體化技術(shù)，對(duì)所有的檢測(cè)程序進(jìn)行控制，極大地提升了食品微生物檢測(cè)的工作效率和檢測(cè)效果，對(duì)于我國(guó)的食品行業(yè)安全發(fā)展起到了良好的技術(shù)應(yīng)用和支撐。

2.2 PCR技術(shù)檢測(cè)食品微生物準(zhǔn)確率更高

當(dāng)前，生物科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展較快，但如果利用傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于種類繁多的微生物來(lái)說(shuō)仍然存在著比較大的困難，并且，檢測(cè)效率低下的問(wèn)題一直沒(méi)有得到很好的解決。另外，即使對(duì)傳統(tǒng)的檢測(cè)進(jìn)行應(yīng)用，仍然不能對(duì)活性較弱的微生物菌類進(jìn)行效果良好的檢測(cè)，同時(shí)，也不利于食品微生物工作研究的順利展開(kāi)。與之相比，PCR 技術(shù)檢測(cè)食品微生物會(huì)更好地避免這些問(wèn)題的產(chǎn)生，更快捷地區(qū)分食品中微生物的類型，且具備更好的精確性和全面性，完全能夠?yàn)槭称钒踩峁┳盍己玫谋Ｕ虾捅O(jiān)督，對(duì)提升我國(guó)的食品安全和維護(hù)社會(huì)穩(wěn)定起到了重要的作用［5］。

2.3 PCR技術(shù)檢測(cè)食品微生物有良好的應(yīng)用前景

PCR 技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的食品微生物檢測(cè)技術(shù)來(lái)說(shuō)，在自動(dòng)化應(yīng)用、成本、檢測(cè)的時(shí)間、操作設(shè)計(jì)和工作時(shí)效等方面都具備較大的優(yōu)勢(shì)。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR技術(shù)具有著廣闊的應(yīng)用前景，其廣泛應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域，充分體現(xiàn)了我國(guó)科學(xué)技術(shù)方面的發(fā)展進(jìn)步，也彰顯了我國(guó)在食品安全領(lǐng)域的責(zé)任和態(tài)度。但是，仍然應(yīng)該看到我國(guó)的食品行業(yè)的安全形勢(shì)仍然嚴(yán)峻，特別是我國(guó)當(dāng)代城市化建設(shè)加速，各區(qū)域的食品物流量呈幾何式放大，這就容易導(dǎo)致食品在生產(chǎn)、加工、銷售、運(yùn)輸、流轉(zhuǎn)等過(guò)程中或多或少會(huì)被微生物所污染和影響，進(jìn)而會(huì)嚴(yán)重影響到食品質(zhì)量，甚至?xí)霈F(xiàn)食品衛(wèi)生安全問(wèn)題風(fēng)險(xiǎn)。因此，社會(huì)應(yīng)普遍對(duì)食品安全問(wèn)題重視起來(lái)，特別是對(duì)食品的微生物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用要高度關(guān)注，因?yàn)檫@種技術(shù)的發(fā)展是及時(shí)解決食品安全問(wèn)題和消除食品安全隱患的最有力的保證。隨著我國(guó)的生物科技的發(fā)展和創(chuàng)新，有許多帶有先進(jìn)理念的食品微生物檢測(cè)技術(shù)被應(yīng)用到科學(xué)實(shí)踐中，PCR 技術(shù)在檢測(cè)食品微生物時(shí)可以有效地拓展微生物的檢測(cè)空間，進(jìn)一步地提升食品安全控制的效果和質(zhì)量。那么，PCR技術(shù)在未來(lái)的發(fā)展應(yīng)用中，將在食品微生物有害物質(zhì)檢測(cè)中起到越來(lái)越重要的作用，必將進(jìn)一步推進(jìn)我國(guó)食品行業(yè)安全高效發(fā)展。

3 PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)的應(yīng)用

PCR 技術(shù)檢測(cè)食品微生物時(shí)，對(duì)食品中的食源性的菌群有很強(qiáng)的檢測(cè)作用，同時(shí)，還能夠?qū)κ称返钠渌煞诌M(jìn)行檢測(cè)，并且能夠用于轉(zhuǎn)基因食品領(lǐng)域，應(yīng)用的范圍和領(lǐng)域是相對(duì)廣泛的。

3.1 對(duì)食品食源性菌群檢測(cè)

隨著近幾年科學(xué)技術(shù)的較快發(fā)展，PCR 技術(shù)在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域也取得了技術(shù)上的優(yōu)勢(shì)和進(jìn)步，特別是在對(duì)食品微生物的沙門氏菌群、李斯氏菌群、埃希氏菌群和葡萄球菌群等有害的微生物檢測(cè)中，PCR 技術(shù)都能進(jìn)行快速而有效的識(shí)別和監(jiān)控，可以在最大程度上保障食品行業(yè)的安全［6］。

3.2 對(duì)食品微生物的有效成分鑒定

對(duì)于食品中微生物的有效成分，如果運(yùn)用單一的檢測(cè)手段和技術(shù)是無(wú)法取得準(zhǔn)確的檢測(cè)效果的。而PCR技術(shù)應(yīng)用能夠很好地解決這一問(wèn)題，快速、便捷和有效地識(shí)別食品中的有效成分。特別是對(duì)于深加工的食品，其成分會(huì)發(fā)生相對(duì)復(fù)雜的改變，而應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)深加工的食品進(jìn)行檢測(cè)，能夠取得準(zhǔn)確、高效的結(jié)果，能為食品的營(yíng)養(yǎng)成分提供最為翔實(shí)的數(shù)據(jù)信息，便于消費(fèi)者理性消費(fèi)和選擇性消費(fèi)。

3.3 對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的鑒定

PCR 技術(shù)還有一個(gè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)，就是可以對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的鑒定提供良好的技術(shù)支持，并且能夠提供定量和定性的雙向數(shù)據(jù)分析。當(dāng)前，傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)不能夠全面、有效地檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因食品中的各種成分，特別是對(duì)于某些食品微生物的細(xì)菌和毒素都很難發(fā)揮檢測(cè)的作用。然而，PCR 技術(shù)可以有效地在這些方面上進(jìn)行應(yīng)用，特別在玉米、大豆等食品微生物檢測(cè)上具有較高的優(yōu)勢(shì)，為保證我國(guó)食品安全和食品營(yíng)養(yǎng)成分鑒定起到了決定性的作用。

4 PCR技術(shù)對(duì)食品微生物檢測(cè)應(yīng)用發(fā)展

未來(lái)，PCR 技術(shù)在食品的微生物檢測(cè)方面還需要確定發(fā)展方向，在以下幾個(gè)方面探索和研究。第一，PCR 技術(shù)對(duì)食品微生物檢測(cè)的準(zhǔn)確性［7］。在以往的PCR技術(shù)檢測(cè)中，其準(zhǔn)確性主要是靠DNA模板和RNA模板制備精度，因此，在未來(lái)的發(fā)展實(shí)踐中，要提高PCR技術(shù)檢測(cè)的準(zhǔn)確性，就得針對(duì)在提煉DNA模板和RNA 模板精度上下功夫。第二，PCR 技術(shù)數(shù)字化檢測(cè)技術(shù)。隨著信息產(chǎn)業(yè)技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，信息技術(shù)與生物科技結(jié)合發(fā)展的趨勢(shì)也越來(lái)越明顯，而許多食品生產(chǎn)商對(duì)數(shù)字化PCR 技術(shù)的應(yīng)用非常熱衷，特別是將微滴液體隨機(jī)排布在陣列結(jié)構(gòu)，改善PCR 技術(shù)中因散熱所造成的檢測(cè)結(jié)果存在誤差的問(wèn)題。而數(shù)字化的PCR技術(shù)將突破傳統(tǒng)技術(shù)的限制，使基因定量的特異性和靈敏性得到很大的提升，使未來(lái)的PCR 技術(shù)數(shù)字化檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用前景非常的廣闊。

5 結(jié)語(yǔ)

本文結(jié)合微生物檢測(cè)發(fā)展趨勢(shì)，深入探討PCR 技術(shù)的相關(guān)概念理論，發(fā)現(xiàn)PCR 技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用及諸多優(yōu)勢(shì)，值得推廣。