膳食纖維對大鼠腦缺血后PTEN/PI3K/Akt/NF-κB 信號通路的影響

楊事達(dá) 曲慧玲

1.遼寧省人民醫(yī)院檢驗科，遼寧沈陽 110015；2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧沈陽 110016

腦梗死可誘導(dǎo)病理生理級聯(lián)反應(yīng)，包括最初的興奮性毒性，隨后是較長的神經(jīng)炎癥期[1]。此外，腦梗死可以被視為一種系統(tǒng)性疾病，也影響遠(yuǎn)程器官功能，包括肺及免疫系統(tǒng)和腸道功能[2]。最近，有研究表明，腸道菌群異常與患者的預(yù)后惡化相關(guān)[3-4]，并且這些變化在住院后3 周內(nèi)都很明顯。嚙齒類動物腦梗死模型的進(jìn)一步實驗研究已經(jīng)確定了免疫系統(tǒng)在沿著腸-腦軸介導(dǎo)過程中起著關(guān)鍵作用[5-6]。腸道微生物組產(chǎn)生大量生物活性代謝物可能通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)或傳入神經(jīng)通路影響大腦功能，特別是短鏈脂肪酸（shortchain fatty acid，SCFA），其中的醋酸鹽、丁酸鹽和丙酸鹽已被證明容易越過血腦屏障，并影響大腦在發(fā)育、健康和疾病中的功能[7-9]。例如，SCFAs 治療通過促進(jìn)抗炎機(jī)制和減少軸突損傷來改善實驗性自身免疫性腦炎的病程[10]。盡管腸道微生物組對腦梗死預(yù)后有重要貢獻(xiàn)，并且SCFAs 是微生物組的主要生物活性介質(zhì)之一，但SCFAs 在腦缺血后慢性期腦梗死后恢復(fù)中的作用及其潛在治療用途尚未得到研究。本研究探討添加膳食纖維后對腦梗死后大鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)通路的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年雄性Wistar 大鼠，體重200～250 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：211002300052024，動物許可證號：SCXK[遼]2015-0001，所有動物實驗操作程序符合中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會管理條例要求。

1.2 儀器與試劑

ET-1 購于美國Sigma-Aldrich 公司，產(chǎn)品批號：E6877；Anti-PTEN 抗體購于美國Abcam 公司，產(chǎn)品批號：ab 267787；Anti-p-PI3K 抗體購于美國Abcam公司，產(chǎn)品批號：ab 278545；Anti-p-Akt 抗體購于美國Abcam 公司，產(chǎn)品批號：ab38449；Anti-PI3K 抗體購于美國Abcam 公司，產(chǎn)品批號：ab32089；Anti-Akt 抗體購于美國Abcam 公司，產(chǎn)品批號：ab 108202；Anti-NF-κB/p65 抗體購于美國Abcam 公司，產(chǎn)品批號：ab 207297；Anti-β-Actin 抗體購于美國Abcam 公司，產(chǎn)品批號：ab115777。微量注射器（型號：87943）購于美國Hamilton 公司；蛋白電泳儀（型號：PowerPac HV）購于美國Bio-Rad 公司；電轉(zhuǎn)膜裝置（型號：Trans-Blot?TurboTM）購于美國Bio-Rad 公司；搖床購于德國Heidolph（型號：6173000）公司。

1.3 研究方法

1.3.1 實驗動物分組 隨機(jī)選取24 只大鼠顱內(nèi)注射內(nèi)皮素（endothelin，ET-1）制作腦缺血模型，模型制作完成后4 只大鼠死亡。剩余20 只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為缺血組和缺血+膳食纖維組，每組10 只；另隨機(jī)取10 只大鼠作為假手術(shù)組，大鼠顱內(nèi)注射生理鹽水作為對照，假手術(shù)組的大鼠均存活。

1.3.2 腦缺血模型的制作方法 將ET-1 用生理鹽水稀釋成0.5 μg/μl，注射點為以下3 點（根據(jù)大鼠腦解剖圖譜，AP 示以前囟為中心向前，ML 示以前囟為中心向側(cè)方，DV 示以前囟為中心向下方）[11-12]：①AP+0.7 mm、ML+2.2 mm、DV-2.0 mm；②AP+2.3 mm、ML+2.5 mm、DV-2.3 mm；③AP+0.7 mm、ML+3.8 mm、DV-5.8 mm。ET-1 用微量注射器以0.5 μl/min 注射。注射ET-1 后約3 h（此時大鼠麻醉已清醒）若大鼠出現(xiàn)提尾倒懸時右上肢向胸前屈曲或行走時向右側(cè)傾倒或向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，且癥狀持續(xù)超過24 h，則可判定為缺血模型制作成功[13]。

1.3.3 膳食纖維的添加 在大鼠飼養(yǎng)過程中，7～35 d 給予膳食纖維經(jīng)口喂入，每周固定兩天添加飼料，其他時間可根據(jù)大鼠進(jìn)食情況隨時注意添加。正常飲食組即缺血組和假手術(shù)組飼料成分配比如下：玉米淀粉為465.692 g/kg、絡(luò)蛋白為140.000 g/kg、糊精玉米淀粉為155.000 g/kg、蔗糖為100.000 g/kg、大豆油為40.000 g/kg、纖維素為50.000 g/kg、礦物混合物（AIN-93M）為35.000 g/kg、維生素混合物（AIN-93）為10.000 g/kg、L-胱氨酸為1.800 g/kg、膽堿酒石酸為2.500 g/kg、丁基化羥基甲苯為0.008 g/kg。缺血+膳食纖維組飼料成分配比如下：玉米淀粉為465.692 g/kg、絡(luò)蛋白為140.000 g/kg、果膠為25.000g/kg、糊精玉米淀粉為25.000g/kg、蔗糖為100.000 g/kg、大豆油為40.000 g/kg、纖維素為150.000 g/kg、礦物混合物（AIN-93M）為35.000 g/kg、維生素混合物（AIN-93）為10.000 g/kg、L-胱氨酸為1.800 g/kg、膽堿酒石酸為2.500 g/kg、丁基化羥基甲苯為0.008 g/kg。

1.3.4 梗死體積的測量 第40 天時，使用尼氏染色測量缺血組和缺血+膳食纖維組之間腦梗死的體積的差異。通過NIH Image J 軟件進(jìn)行測量，得到總的梗死體積。

1.3.5 Western blot 腦缺血術(shù)后40 d，把每組大鼠麻醉，提取梗死周邊組織。提取蛋白，然后進(jìn)行蛋白定量、按照每個孔上樣10 μl，含總蛋白50 μg，上樣2 μl緩沖液。充分混勻后，金屬浴5 min，儲存于-20℃。聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳接受后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后，室溫封閉1 h。然后進(jìn)行雜交和顯色，Image J 軟件分析條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組梗死體積比較

缺血組梗死體積為（130.853±11.462）mm3，與缺血+膳食纖維組梗死體積[（127.371±9.857）mm3]比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.728，P=0.475）。

2.2 膳食纖維對大鼠腦缺血后PTEN/PI3K/AKT/NF-κB 信號通路蛋白表達(dá)的影響

缺血組的p-PI3K、p-Akt 的蛋白表達(dá)低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；缺血+膳食纖維組的p-PI3K、p-Akt 的蛋白表達(dá)高于缺血組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。缺血組的PTEN、NF-κB/p65 的蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；缺血+膳食纖維組的PTEN、NF-κB/p65 的蛋白表達(dá)低于缺血組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖1。

3 討論

本研究證實了腸道菌群及其代謝產(chǎn)物SCFAs 可以作為一種干預(yù)“靶點”，通過針對性地對他們進(jìn)行調(diào)控，就有可能通過調(diào)控梗死后的炎癥反應(yīng)從而在腦梗死的治療及神經(jīng)功能的恢復(fù)等方面發(fā)揮作用。本課題組前期工作表明添加膳食纖維能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，膳食纖維可以被腸道菌群代謝發(fā)酵而產(chǎn)生SCFAs[14]。通過對小膠質(zhì)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)腦卒中后恢復(fù)[8]。SCFAs 對腦卒中后恢復(fù)和神經(jīng)元可塑性的影響可能是通過小膠質(zhì)細(xì)胞活動間接介導(dǎo)的，與樹突重塑和小膠質(zhì)細(xì)胞的重塑有關(guān)[15-17]。研究表明腦梗死后補(bǔ)充SCFAs 后細(xì)胞分支增加，提示小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)降低。因此，SCFAs 對小膠質(zhì)細(xì)胞激活的修飾可能會對突觸消除產(chǎn)生影響，從而影響小膠質(zhì)細(xì)胞依賴性突觸可塑性[18]。RNA Seq 分析結(jié)果表明，SCFAs 在這一過程中主要抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活[8]。

NF-κB 是廣泛已知的與腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[19]。PI3K/Akt 信號是NF-κB 信號通路的主要上游元件。PI3K/Akt 信號通路在神經(jīng)元中表達(dá)最為明顯，而在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)也有表達(dá)。以前的研究表明，Akt（Thr-308 和Ser-473）的磷酸化是Akt 活化的原因。Akt 是一種主要的神經(jīng)保護(hù)因子。Akt 磷酸化的增加反映了Akt 活性的增加。PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與了基因表達(dá)的調(diào)控。然而，PTEN 基因可以負(fù)向調(diào)控PI3K/Akt 信號通路。PTEN 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中也起到一定的作用[20]。近年來，人們對PTEN抑制劑在腦缺血損傷中的研究表明在腦缺血后，PTEN 過度表達(dá)，并通過PI3K/Akt 途徑參與缺血性卒中的發(fā)生[21-25]。此外，Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是先天性免疫反應(yīng)的主要組成部分，其配體脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）可以激活大鼠海馬神經(jīng)元的興奮。LPS 可以激活細(xì)胞內(nèi)磷酸酶活性通過蛋白的去磷酸化導(dǎo)致PTEN 活化，進(jìn)而抑制Akt 磷酸化，TLR4 的活化通過去磷酸化激活PTEN，TLR4 的解離通過去磷酸化激活第二信使PIP3，抑制PI3K，從而抑制下游因子Akt 的活化，最終導(dǎo)致NF-κB 的釋放，而LPS對PTEN 和Akt 磷酸化狀態(tài)的影響通過阻斷TLR4 激活而逆轉(zhuǎn)。那么調(diào)控PTEN/PI3K/Akt/NF-κB 信號通路，則能夠抑制腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，進(jìn)而抑制腦缺血后的炎癥反應(yīng)。而SCFAs 發(fā)揮作用的機(jī)制其中一條是通過上調(diào)PI3K/Akt 信號，抑制NF-κB 通路的激活[26-27]。本研究結(jié)果顯示SCFAs 抑制了PTEN 的表達(dá)，從而調(diào)控PI3K/Akt/NF-κB 信號通路。添加膳食纖維后，應(yīng)用Western blot 方法測定梗死周圍組織NF-κB 表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與缺血組比較，膳食纖維產(chǎn)生的SCFAs 增多，該組大鼠腦梗死周邊區(qū)域PTEN 降低，p-PI3K 及p-Akt的表達(dá)明顯增高，而細(xì)胞核NF-κB/p65 水平顯著降低。

本研究顯示腦梗死后添加膳食纖維能夠抑制了PTEN 的表達(dá)，上調(diào)PI3K/Akt 信號，抑制NF-κB 通路的激活，有效抑制缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，這些研究成果為臨床治療帶來新的方法。