高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)奶牛糞污及降解產(chǎn)物中雌激素

邵志勇，周 源，何 斌，吳利軍，楊文海，陳夏冰，劉 武，金爾光

（武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430208）

隨著人民生活水平逐漸提高，人們對(duì)肉、蛋、奶的需求量日益增加，刺激畜牧業(yè)朝著集約化方向快速擴(kuò)展［1］，同時(shí)帶來(lái)大量的畜禽糞污，造成的環(huán)境污染問(wèn)題日益凸顯。對(duì)畜禽糞污的污染仍主要集中在N、P、重金屬和農(nóng)藥等常規(guī)污染物的研究和控制，雌激素等污染物未得到足夠的重視［2］。環(huán)境中的雌激素屬于典型的內(nèi)分泌干擾物，具有較強(qiáng)的生態(tài)和生理毒性，可以打破生物體自身的平穩(wěn)狀態(tài)，使各個(gè)平穩(wěn)運(yùn)行的系統(tǒng)失去穩(wěn)定狀態(tài)［3］，從而導(dǎo)致男性不育、女性生殖器官腫瘤、兒童早熟，野生動(dòng)物繁殖能力下降及水生生物雌性化等生殖疾?。?］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)禽畜養(yǎng)殖場(chǎng)排泄產(chǎn)生的雌激素量約為污水處理廠排放的10 倍［5］，其中，奶牛糞污中的雌激素占畜禽糞污中雌激素的90%［6］。

用于動(dòng)物性食品、液體樣品中雌激素的檢測(cè)方法較多，有氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）、電感耦合等離子發(fā)射光譜法（ICP）、電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜法（ICP-MS）［7，8］，但關(guān)于奶牛糞污中雌激素的檢測(cè)方法鮮有報(bào)道。為保障人類和動(dòng)物的生殖代謝等健康問(wèn)題，建立一種奶牛糞污及其降解產(chǎn)物中雌激素含量檢測(cè)方法至關(guān)重要。本研究使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)奶牛糞污及其降解產(chǎn)物樣品中雌酮、17-α-雌二醇、17-β-雌二醇、雌三醇4 種天然雌激素的檢測(cè)方法進(jìn)行研究，對(duì)奶牛糞污的安全處理與資源化利用的安全評(píng)價(jià)有積極意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

MS205DU 電子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；SB-5200D 超聲波清洗儀，寧波新芝生物科技有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；QYCQ-24B+DP-01 固相萃取裝置，上海喬躍電子有限公司；ZX-DC 氮吹儀北京眾信佳儀科技有限公司；Acquity UPLC Xevo TQ-S 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配電子噴霧離子源），美國(guó)Waters 公司；Milli-Q 純水儀，美國(guó)Millipore 公司；3K15 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma 公司；Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），美國(guó)Waters 公司。

雌酮（純度1 000 μg/mL，CAS 號(hào)53-16-7），17-α-雌二醇（純度1 000 μg/mL，CAS 號(hào)57-91-0），雌三醇（純度1 000 μg/mL，CAS 號(hào)50-27-1），購(gòu)于美國(guó)o2si smart solutions 公司；17-β-雌二醇（純度100 μg/mL，CAS 號(hào)50-28-2），購(gòu)于法國(guó)A2S Analytical Stan?dard Solutions 公司；17-雌三醇-D2（純度≥98%，79037-36-8），購(gòu)于上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；17-β -雌 二 醇-D2（純 度1 000 μg/mL，CAS 號(hào)53866-33-4），北京曼哈格生物科技有限公司；雌酮-D2（純度100 μg/mL，CAS 號(hào)56588-58-0），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；乙腈、甲醇購(gòu)于美國(guó)Ther?mo Fisher 公司。氯化鈉、氨水、鹽酸、冰乙酸等試劑均為分析純；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 移取3 種內(nèi)標(biāo)對(duì)照品200 μL 至10.00 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配置成濃度為2 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液。

雌三醇、雌酮、17-β-雌二醇的混合對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液的配制，移取3 種激素的混合對(duì)照品溶液200 μL 于10.00 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，并逐級(jí)稀釋，濃度依次為0、2、5、20、50、100 和200 ng/mL。所有濃度的激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中均加入50 μL 的內(nèi)標(biāo)溶液。

17-α-雌二醇的混合對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液的配制，移取17-α-雌二醇的混合對(duì)照品溶液200 μL 于10.00 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，并逐級(jí)稀釋，濃度依次為0、20、50、100、200、500 和1 000 ng/mL。以上所有濃度的激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中均加入50 μL 的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.2 樣品前處理 分別采集哺乳牛、犢牛糞樣各3 份，發(fā)酵床上層和下層樣品各1 份，約500 g 做為代表性樣品，黑色塑料袋密封，并立即存放于冰盒中冷藏存放，然后保持冷凍狀態(tài)盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并冷凍干燥處理。凍干后的樣品避光保存，分析前用高速粉碎機(jī)將其粉碎，過(guò)篩，使其粒徑小于2 mm ，混合均勻后縮分至100 g，儲(chǔ)存于樣品瓶中，密封保存，供檢測(cè)用。

稱取2.00 g 樣品，加入50 μL 氘代內(nèi)標(biāo)，再加入20 mL 乙腈，振蕩1 h，離心，取上清液10 mL，氮吹近干，加入30%甲醇水溶液5 mL，待凈化。

1.2.3 樣品凈化 預(yù)先用以5 mL 乙酸乙酯、5 mL 甲醇、5 mL pH 2.0 鹽酸溶液活化HLB 小柱，取備用液上柱，以5 mL 30%甲醇水溶液洗滌，抽至近干后加入3 mL 的石油醚洗滌，將小柱抽干，再用5 mL 乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液于玻璃離心管中，氮吹至近干，用2 mL 50%甲醇水溶液溶解，過(guò)膜，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 檢測(cè)條件 液相色譜條件，C18 柱，柱長(zhǎng)100 mm，內(nèi)徑2.1 mm，粒徑1.8 μm；流速為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為35 ℃。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

質(zhì)譜條件，電噴霧離子源，負(fù)離子模式；脫溶劑氣溫度500 ℃；脫溶劑氣、錐孔氣均為高純氮?dú)猓浑x子源溫度150 ℃；脫溶劑氣流速1 000 L/h；錐孔氣流速150 L/h；碰撞氣流速0.13 mL/min；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，監(jiān)測(cè)條件見(jiàn)表2。4 種激素在MRM 條件下色譜見(jiàn)圖1。

圖1 奶牛糞污中4 種激素色譜

表2 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

由于奶牛糞污及降解產(chǎn)物中的激素是一種內(nèi)源性物質(zhì)，很難獲得不含激素的空白試樣用于檢出限的評(píng)定。通過(guò)添加含有氘代的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照梯度稀釋，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，4 種激素均呈現(xiàn)了良好的線性關(guān)系（R2>0.99）（表3）。

由表3 可知，雌三醇、雌酮、17-β-雌二醇的曲線以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，在2~200 ng/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，17-α-雌二醇的曲線以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，在20~1 000 ng/mL 內(nèi)線性關(guān)系良好（R2≥0.995）。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)

采用空白基質(zhì)提取液逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法確定定量限，雌三醇、雌酮、17-β-雌二醇的定量限為2 ng/mL；17-α-雌二醇的定量限為20 ng/mL。

2.2 回收率

稱取牛糞3 份，每份2.00 g 樣品（偏差最大0.02 g），3 份樣品中分別加入100、50 和0 μL 激素混合標(biāo)準(zhǔn)品，每份樣品加入50 μL 氘代內(nèi)標(biāo)，充分混勻后靜置2 h，4 種激素的平均回收率為93.6%～145.3%，表明該方法具有良好的檢測(cè)性能（表4）。

表4 回收率

2.3 奶牛糞污及降解產(chǎn)物中雌激素的測(cè)定結(jié)果

將奶牛糞污及微生物異位發(fā)酵床中的樣品經(jīng)預(yù)處理和色譜條件提取并檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在犢牛糞中未檢出雌酮，而哺乳牛糞中檢出雌酮；犢牛雌三醇的檢出量高于哺乳牛；犢牛的雌激素總檢出量低于哺乳牛，與王真［9］研究結(jié)果不一致，與李艷等［10］研究結(jié)果一致；梁紫薇等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在相同品種、相同飼喂方式下，不同季節(jié)肉雞雌激素的排放量也存在較大差異。

樣品中雌激素檢查結(jié)果見(jiàn)表5。由表5 可知，發(fā)酵后的牛糞雌激素總檢出量低于犢牛、哺乳牛，發(fā)酵床上層樣品中只有17-β-雌二醇未檢出，其他3 種雌激素檢出，發(fā)酵床下層樣品均未檢出，可能受發(fā)酵床中微生物影響，與郭立泉等［12］研究結(jié)果一致，說(shuō)明生物發(fā)酵床對(duì)相關(guān)雌激素具有一定降解功能。

表5 奶牛糞污及降解產(chǎn)物中激素檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

LC-MS/MS 技術(shù)擁有高靈敏度、高分辨率、高特異性和高效分離等特點(diǎn)［13］，被用于實(shí)現(xiàn)解析化合物分子結(jié)構(gòu)或樣品的定性定量分析。利用其特性與實(shí)際情況相結(jié)合，建立了一種用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)奶牛糞污及降解產(chǎn)物中4 種天然激素的檢測(cè)方法，該方法對(duì)樣品中雌三醇、雌酮、17-β-雌二醇的檢出限為2 ng/mL，17-α-雌二醇的檢出限為20 ng/mL，加50 μL 氘代內(nèi)標(biāo)時(shí)，回收率為93.6%～145.3%。運(yùn)用該方法對(duì)奶牛場(chǎng)糞污及微生物異位發(fā)酵床墊料中的激素殘留進(jìn)行檢測(cè)，部分未檢出。該方法可用于奶牛糞污及降解產(chǎn)物中激素殘留的檢測(cè)，方法靈敏度高、檢出限低，為奶牛糞污及降解產(chǎn)物中激素的測(cè)定提供了一種高效、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。