基于AFLP標(biāo)記的薄殼山核桃種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

梁 燕，韓傳明*,孫 超，王翠香，閔旭峰，王 靜，王清海

(1.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東 濟南 250014；2.棗莊市山亭區(qū)自然資源局，山東 棗莊 277500)

薄殼山核桃 (CaryaillinoensisK.Koch)，屬胡桃科山核桃屬，又名美國山核桃、長山核桃、碧根果和長壽果等，英文名 pecan[1]，是優(yōu)良的經(jīng)濟林樹種，在用材和林果方面表現(xiàn)優(yōu)異。2017年，美國出口的薄殼山核桃價值達到3億美元，其中有76.37% 銷往中國。薄殼山核桃有比較廣泛的栽培分布范圍，適宜于大陸性氣候帶的地區(qū)進行引種栽培，緯度 25—35°范圍里的地區(qū)生長結(jié)實情況最佳[2]。據(jù)文獻記載，江西于 1890 年開始引種，是我國最早引種該樹種的省份之一，后在江蘇的江陰、南京、浙江杭州和福建莆田等地栽植[3]。薄殼山核桃雌雄同株異花，雌雄異熟，風(fēng)媒傳粉，多屬于異樹異花授粉，因此，薄殼山核桃是高度雜合的多年生植物，優(yōu)良單株種質(zhì)資源的收集和分子標(biāo)記意義重大。

同其他多年生木本植物相比，目前薄殼山核桃的分子標(biāo)記研究報道主要有Grauke等篩選出19對 SSR 引物用于48個薄殼山核桃品種的鑒定[4]，焦思宇等利用ISSR技術(shù)分析了阜陽林科站引進的33個薄殼山核桃品種的遺傳多樣性[5]，張日清等進行了美國山核桃群體遺傳多樣性的RAPD分析[6]。 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 分子標(biāo)記技術(shù)具有帶型豐富、可靠性強、可重復(fù)性高、靈敏度高等特點，在番石榴[7]、鱷梨[8]、滇山茶[9]、楸樹[10]、銀杏[11]等木本植物遺傳多樣性分析和遺傳結(jié)構(gòu)研究中已成熟應(yīng)用。為了明確山東地區(qū)引進的薄殼山核桃種質(zhì)遺傳多樣性和親緣關(guān)系，本研究以山東省林業(yè)科學(xué)研究院引種的 30 個優(yōu)良薄殼山核桃品種(系)為對象，利用 AFLP 分析標(biāo)記技術(shù)，準(zhǔn)確了解和評價種質(zhì)資源的遺傳背景、遺傳結(jié)構(gòu)、品種間的遺傳距離，建立DNA指紋圖譜，為進一步開展薄殼山核桃的新品種選育、品種鑒定和種質(zhì)資源保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

30份供試材料采自山東省林業(yè)科學(xué)研究院濟南市萊蕪區(qū)、泰安市岱岳區(qū)、聊城市冠縣薄殼山核桃種質(zhì)資源圃，具體來源見表1。于2020年4月分別采集各品種(系)樹冠外圍新梢嫩葉作為試驗材料，用酒精洗凈后晾干放入硅膠干燥劑中保存，帶回實驗室備用。

表1 供試薄殼山核桃品種(系)及其來源

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與檢測 取干燥好的葉片材料0.3 g，液氮冷凍后研磨成干粉，DNA采取改良的CATB法提取[12]。配制0.8%的瓊脂糖凝膠，電壓180 V 電泳時間40 min，在凝膠圖像分析系統(tǒng)下進行DNA檢測。

1.2.2 AFLP體系的建立 從64對引物組合中篩選出9對(見表2)EcoR I/Mse I 引物用于本次研究。

試驗條件：對供試樣品采用EcoR I /Mse I雙酶切，酶切和連接、預(yù)擴增、選擇性擴增參考王東升[13]紫椴和野核桃AFLP遺傳多樣性研究中的反應(yīng)體系。

1.2.3 電泳分析 選擴產(chǎn)物的檢測(采用ABI PRISM 377 sequencer)。預(yù)電泳 20—30 min、點樣、電泳2.5 h(電壓1 200 V)。ABI 377測序儀進行AFLP多態(tài)性分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 用GENESCAN3.1軟件打開膠圖，對膠圖進行數(shù)據(jù)提取，設(shè)置參數(shù)計算多態(tài)性比率PPBs，并在假定哈迪-溫伯格平衡的前提下計算其有效等位基因(Ne)、基因多樣度(H)和Shannon信息指數(shù)(I)。通過Binthere軟件提取樣品的各片段大小的結(jié)果，EXCEL轉(zhuǎn)換將表內(nèi)的數(shù)值不為0轉(zhuǎn)換為1(數(shù)值為0的不轉(zhuǎn)換)，從而生成由“l(fā)”和“0”組成的原始矩陣，用NTSYSpc-2.11F軟件進行數(shù)據(jù)分析。對原始矩陣用SimQual程序求DICE相似系數(shù)矩陣，并獲得相似系數(shù)矩陣。用SHAN程序中的UPGMA方法進行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成聚類圖，用EIGEN模塊進行基于Jaccard遺傳相似系數(shù)的主坐標(biāo)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP擴增多態(tài)性分析

利用篩選出的9對EcoR I/Mse I 引物組合(見表2)對30個薄殼山核桃基因組DNA進行AFLP擴增多態(tài)性分析(如圖1)，擴增獲得的條帶清晰、位置一致性良好。總體上，9對引物組合共擴增出1 425個條帶，多態(tài)性條帶1 381個，其中有4個引物組合的多態(tài)性比率達到100%。E-ACG/M-CAA擴增條帶最多，為192個，多態(tài)性比率亦為100%，效果最好，E-ACC/M-CAC擴增條帶數(shù)188，多態(tài)性條帶數(shù)為157，比率為83.51%，雖然比例較低，但數(shù)量較多。9對引物組合整體平均條帶數(shù)為158.3，平均多態(tài)性比例為96.9%，多態(tài)性較好，滿足試驗需要。

圖1 30個薄殼山核桃品種(系)的熒光AFLP電泳圖譜(引物組合E-ACG/M-CAA)

表2 AFLP分析引物組合及其選擇性擴增結(jié)果

2.2 遺傳多樣性分析

基于等位基因頻率計算有效等位基因數(shù)(Ne)、基因多樣度(H)及Shannon信息指數(shù)(I)是進行遺傳多樣性水平評估的重要方式[14]。如表3所示，30個薄殼山核桃品種(系)利用9對引物組合所檢測到的不同位點的觀測等位基因數(shù)(Na)為1.652 8—1.888 9，平均1.710 3；有效等位基因數(shù)范圍1.182 1—1.306 8，平均1.240 3；基因多樣度范圍0.120 1—0.190 9，平均0.152 2；Shannon信息指數(shù)范圍0.200 0—0.304 8，平均0.245 5。9個引物組合中，E-ACG/M-CAA與E-ACA/M-CTT結(jié)果最好，同時2個引物組合多態(tài)性均為100%。

表3 30個薄殼山核桃品種(系)遺傳多樣性指標(biāo)

2.3 遺傳相似系數(shù)與聚類分析

由表4可知，30個供試樣品遺傳相似系數(shù)范圍為0.746 4—0.885 3，變異范圍為0.138 9?！娚健c‘Stuart’的相似系數(shù)為0.885 3，說明2個品種遺傳關(guān)系較近；‘小糙皮1’與‘金華’遺傳相似系數(shù)為0.746 4，2個品種遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)；‘小糙皮2’與‘安農(nóng)3號’遺傳相似系數(shù)為0.749 0。與其他品種間相比，小糙皮系列遺傳相似系數(shù)整體較小。

基于遺傳相似系數(shù)，對30個薄殼山核桃品種(系)聚類，見圖2。在遺傳相似系數(shù)0.796處，30個薄殼山核桃品種分為3個組，A組中包含17個品種，其中有‘Stuart’‘Caddo’‘Shoshoni’‘Tejas’‘Mahan’‘Pyzner’‘Wichita’‘Western’‘Baker’9個美國品種，‘Stuart’‘Western’和’Desirable’‘Wichita’是美國主栽品種的前4名[15-16]，聚類在一起，說明其遺傳關(guān)系較近，具有豐產(chǎn)穩(wěn)定的特點，3號、9號、28號、YXG、64號、YL 6個優(yōu)株，‘鐘山’和‘云光’2個品種與豐產(chǎn)穩(wěn)定的美國薄殼山核桃聚在一起，需重點觀察其結(jié)果豐產(chǎn)特點；B組含有11個品種(系)，‘Mohawk’‘San Saba Improved’‘Pawnee’‘Starking Hardy Giant’中 ‘Mohawk’‘Starking Hardy Giant’‘Pawnee’在美國均表現(xiàn)出堅果早熟的特點[15-16]，根據(jù)聚類結(jié)果看，‘金華’[17]與‘Starking Hardy Giant’聚在一起，2者遺傳關(guān)系較近，‘紹興’與‘Mohawk’這2者遺傳關(guān)系較近，‘安農(nóng)3號’與‘安農(nóng)5號’聚在一起，‘安農(nóng)3號’在安徽合肥表現(xiàn)出速生的特點[18]；其中‘小糙皮1’和‘小糙皮2’單獨分為C組，與其他品種距離較遠(yuǎn)，‘小糙皮1’與‘小糙皮2’遺傳相似系數(shù)為0.807 1。小糙皮系列與其他品種遺傳相似系數(shù)整體較小，是很好的親本。目前，許多科技工作者正在從薄殼山核桃與小糙皮山核桃、薄殼山核桃與大糙皮山核桃的二代雜種中，選擇優(yōu)良品種，在寒冷地區(qū)發(fā)展有價值的薄殼山核桃品種[15]。

圖2 基于AFLP分析的30個薄殼山核桃品種(系)UPGMA聚類圖

2.4 主坐標(biāo)分析

基于AFLP分子標(biāo)記的主坐標(biāo)分析(如圖3)，30個薄殼山核桃發(fā)散均較好，分布較均勻。30個薄殼山核桃被更直觀地分成3組，分別包含19，9，2個品種(系)。分組結(jié)果和UPGMA聚類結(jié)果基本一致，稍有不同的是品種‘Pawnee’與‘Starking Hardy Giant’，在圖3中可以看到2個品種在組的邊緣，‘Pawnee’處在較為中間的位置，而‘Starking Hardy Giant’與‘Western’、‘Baker’距離較近。小糙皮系列與其他品種距離較遠(yuǎn)，與已得結(jié)果一致。

圖3 基于AFLP分子標(biāo)記的30個薄殼山核桃品種(系)二維主坐標(biāo)分析圖

3 討論

本研究中篩選的9對AFLP引物組合平均多態(tài)性比例為96.9%，多態(tài)性較好，其中有4個引物組合的多態(tài)性比率達到100%。E-ACG/M-CAA擴增條帶最多，為192個，多態(tài)性比率亦為100%，效果最好。王東升等利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)篩選的8對引物組合多態(tài)性比率為97.2%[19]，和本研究中的結(jié)果差不多，100%引物組合為1對，遠(yuǎn)低于本研究中的4對，說明9對引物多態(tài)性較好。Hamrick研究認(rèn)為基于AFLP分析，多數(shù)多年生木本植物平均多態(tài)性位點比率為65%，平均每個位點觀測等位基因數(shù)(Na)為2.2，平均每個位點的有效等位基因數(shù)(Ne)為1.24[20]。本研究中，30個薄殼山核桃品種(系)利用9對引物組合所檢測到的不同位點的觀測等位基因數(shù)1.710 3，有效等位基因數(shù)1.240 3，基因多樣度0.152 2，Shannon信息指數(shù)0.245 5，30個品種觀測等位基因數(shù)(Na)略低于多年生木本植物平均值，Ne和多年生木本植物平均值相近，說明30個薄殼山核桃的遺傳豐富度中等，結(jié)果可信。有效等位基因數(shù)(Ne)其數(shù)值越接近觀測等位基因數(shù)(Na)，表明等位基因在群體中分布越均勻，遺傳多樣性越好[21]。研究中Ne與Na數(shù)值接近，說明有效等位基因分布較為均勻，但整體數(shù)值較小。30個品種標(biāo)記結(jié)果高于何建等對30個新疆核桃品種利用AFLP分子標(biāo)記結(jié)果(Ne=1.208 5，H=0.129 7，I=0.206 6)[22]。與其他樹種相比，低于馬慶國等[23]對75個金絲楸AFLP分子標(biāo)記結(jié)果(Ne=1.36，H=0.28，I=0.43)。

薄殼山核桃屬于多年生的木本植物，大部分品種雌雄異熟，異樹異花授粉。30個供試樣品遺傳相似系數(shù)范圍為0.746 4—0.885 3，變幅較小，說明樣品間親緣關(guān)系較近，遺傳距離普遍較小。焦思宇等對33份薄殼山核桃ISSR分析結(jié)果中遺傳相似系數(shù)變幅為0.17[5]，與本研究結(jié)果相差不大。李暉等以 161 個美國山核桃品種及株系、1 個核桃品種和 1 個山核桃品種為試材，品種間相似系數(shù)范圍為 0.29—0.94[24]，變幅顯著較高，可能與樣本中有核桃和山核桃有關(guān)。30個薄殼山核桃對于種質(zhì)資源來說樣本量相對較小，為了達到既定的育種目標(biāo)，需擴大引種資源范圍，進一步調(diào)整資源結(jié)構(gòu)。在以后的研究中，宜擴大樣品范圍，采用高通量技術(shù)方法等更深入探討表型和分子標(biāo)記的對應(yīng)聯(lián)系，為育種提供更加精確的理論基礎(chǔ)。

通過NTSYSpc-2.11F軟件進行的 UPGMA聚類分析和PCA主坐標(biāo)分析結(jié)果表明，以小糙皮系列品種為親本與其他薄殼山核桃品種雜交，更易獲得有利變異，可結(jié)合‘Stuart’‘Western’‘Wichita’品種的豐產(chǎn)穩(wěn)定特點，和 ‘Mohawk’‘Starking Hardy Giant’‘Pawnee’堅果早熟的特點，‘安農(nóng)3號’速生的特點，培育出適合山東省栽培的優(yōu)良品種。主坐標(biāo)分析從不同的方向和層面，提供薄殼山核桃各種質(zhì)之間和群組之間的關(guān)系；在排序圖上品種的位置越近，它們的遺傳組成越相似[25]，分析結(jié)果可以為育種和種質(zhì)資源保護提供參考，可以更直觀地表現(xiàn)出品種間遺傳結(jié)構(gòu)特點。

4 結(jié)論

以AFLP分子標(biāo)記對30個薄殼山核桃品種的遺傳多樣性分析，篩選出的9對引物組合可獲得很好的多態(tài)性結(jié)果，是可信且準(zhǔn)確的分子標(biāo)記手段。30個薄殼山核桃品種遺傳多樣性較好，但需進一步擴大引種資源范圍、更合理安排引種結(jié)構(gòu)，以獲得更好的遺傳變異寬度。

UPGMA聚類分析和PCA主坐標(biāo)分析結(jié)果表明，以小糙皮系列品種為親本小糙皮系列品種為很好的雜交親本選擇，利用UPGMA聚類分析在不同的分組中選擇雜交親本，為優(yōu)良品種的培育提供理論價值。