基于HPLC的‘關山’櫻花嫩紅素成分
——異櫻花苷和櫻花亭的定量分析

付 濤，黃增芳，施 源，徐金華，沈雨鎧，王志龍

(1. 寧波城市職業(yè)技術學院/浙江園林綠化技術協同創(chuàng)新中心，浙江 寧波 315100；2.寧波市林場，浙江 寧波 315100；3. 嵊州市景觀園林綠化有限公司，浙江 紹興 312400)

嫩紅素也被稱為紅花漂紅素，具有重要的護膚、養(yǎng)膚和治膚的功能。天然嫩紅素常見于西紅花、人參和桑白皮等名貴中藥，具有活血化瘀、緩解干燥暗沉狀況、激活表皮細胞活性、促進細胞代謝再生、恢復正常的血液循環(huán)、分解沉淀的黑色素、抑制黑色素的再生等功能。然而，由于原材料大多是名貴中藥，生產成本較高，價格也較為昂貴，普通消費者難以消費。此外，近年來，化學合成嫩紅素也多用于化妝品、護膚品等產品中，但化學合成成分具有刺激性，并不適合所有人群，安全性不高。因此，亟需尋找到一種廉價的原材料用于天然嫩紅素的提取。

嫩紅素廣泛分布于櫻屬植物體內，日本等發(fā)達國家研究較為成熟，市場上已有相關產品，如有名的JAMAY櫻花嫩紅素，此外，日本在櫻花食品、生活用品上應用也很廣泛，如櫻花糕、櫻花茶、櫻花香皂、櫻花沐浴液等產品，但國內研究還很少。我國櫻屬植物種類世界第一，但絕大部分資源尚未得到有效開發(fā)，目前，我國櫻花產業(yè)僅局限于景觀應用，食用、藥用、保健產品以及生活用品等方面還未有應用，因此，國內有關櫻花嫩紅素的研究還極少見報道。日本晚櫻品種‘關山’在我國南方尤其浙東地區(qū)適應性強，無明顯病蟲害發(fā)生，花量極大且為重瓣花，產量較高，且在我國南方地區(qū)種植比較廣泛，是非常好的櫻花嫩紅素提取原材料。

異櫻花苷和櫻花亭是櫻花嫩紅素的主要活性成分，本研究以我國南方主栽櫻花品種——‘關山’進行櫻花嫩紅素異櫻花苷和櫻花亭的定量分析，旨在提高我國櫻花資源的應用范圍，為我國櫻花資源的開發(fā)、利用提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2021年4月下旬，在寧波城市職業(yè)技術學院校園內陸續(xù)采集‘關山’盛花期的花，然后利用干燥箱低溫(36—38 ℃)烘干，裝入密封袋4 ℃冰箱保存、備用。

1.2 方法

利用METTLER TOLEDO電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)準確稱取干樣品12.00 mg，在容量瓶中加入70%甲醇1 mL并定容至100 mL，提取24 h，過濾獲得濾液，然后稀釋10倍，用1次性注射器抽取提取樣液經0.45 μm水系濾膜過濾后待測。標準品為異櫻花苷和櫻花亭(上海源葉生物科技有限公司，HPLC≥98%)2種標準品均配制成初始質量濃度為2 000 ng/mL的母液。分別進行單標進樣與混標進樣。單標進樣是為了確定每種物質的出峰時間；混標進樣可以大大減少進樣次數，節(jié)省試驗時間，降低試驗誤差，可更好地建立準確的標準曲線；等質量濃度等體積混合成混標，得到1 000 ng/mL的混標溶液，然后依次稀釋成1 000，500，200，100，50，20，10，5,1 ng/mL等9個質量濃度梯度的混標溶液。進樣儀器為日本島津高效液相色譜儀(HPLC)CTO-20A(日本島津公司)，HPLC條件主要包括：色譜柱C18柱，柱溫為35 ℃，進樣量為5 μL，流速為0.3 mL/min，其中流動相和流動相梯度詳見表1。最后獲得色譜峰，以各物質色譜峰面積相應的標準品質量濃度求回歸方程和相關系數。標準曲線建立后，根據樣品中各物質的出峰面積，運用回歸方程求得其質量濃度，再依據計算式 1 000X/12求得干樣品中嫩紅素質量含量(μg/g)。式中，X表示測定物的質量濃度(ng/mL)，1 000代表樣品稀釋到1 000 mL，12代表樣品干品質量12 mg。

對1 000 ng/mL混標溶液平行測定3次，通過計算標準偏差來考察其測定的精密性；對 1 000 ng/mL混標溶液在0，4，8，12 h分別測定1次，通過計算標準偏差來考察其測定的穩(wěn)定性；對待測的櫻花提取液，同一樣品平行測定 3 次，通過計算標準偏差來考察其測定的重復性。在已測樣品中(本底量A0)準確加入已知量的標準品(加入量A1)，然后再進行檢測獲得測出量(A2)，依據表達式[A2/(A0+A1)]×100計算回收率(%)[1]。

表1 流動相和流動相梯度

2 結果與分析

2.1 標準曲線建立

取1 000 ng/mL異櫻花苷單標進樣，出峰時間大致在3.35 min，同理櫻花亭出峰時間大致在3.63 min。由圖1可知，異櫻花苷和櫻花亭彼此分離，峰形對稱，效果較好。以峰面積(Y) 對質量濃度(X)進行線性回歸，得回歸方程：異櫻花苷Y=554.895 353X+1 567.125 008(R2=0.999 809 96),線性范圍1—1 000 ng/mL；櫻花亭Y=221.578 696X+308.044 811(R2=0.992 465 15)，線性范圍1—1 000 ng/mL。異櫻花苷(如圖2-A)及櫻花亭(如圖2-B)標準曲線呈良好的線性關系。

圖1 混標色譜圖(1 000 ng/mL)

A：異櫻花苷標準曲線；B：櫻花亭標準曲線圖2 2種櫻花嫩紅素標準曲線

2.2 精密度、穩(wěn)定性、重復性和加樣回收率實驗

1 000 ng/mL混標溶液重復進樣3次，結果表明異櫻花苷和櫻花亭峰面積的RSD分別為 0.85%和1.46%，表明精密度較好。

同樣用1 000 ng/mL混標溶液在0，4，8，12 h進樣，結果表明在 12 h 內色譜峰面積無明顯變化，異櫻花苷和櫻花亭峰面積的RSD分別1.21%和1.38%，表明12 h內穩(wěn)定性較好。

取樣品溶液3份，進樣測定各物質的量。結果異櫻花苷平均質量分數分別為520.80 μg/g，櫻花亭未檢測出，異櫻花苷RSD為0.85%，表明重復性較好。

在稀釋10倍的樣品溶液中準確加入已知量的標準品(10 μg)，然后再進行檢測獲得測出量。結果異櫻花苷和櫻花亭的平均回收率分別為 101.45%和100.24%，RSD分別為1.43%和1.52%，說明加樣回收率結果較好。

2.3 樣品測定

由圖3可知，樣品色譜圖只出1個峰，該峰為異櫻花苷對于的色譜峰，而櫻花亭未出現對應色譜峰。將異櫻花苷對應色譜峰面積(5 162.147 mm2)帶入異櫻花苷回歸方程，得到異櫻花苷質量濃度，換算得到‘關山’櫻花干品中異櫻花苷平均含量為539.97 μg/g，未檢測到櫻花亭成分含量。

圖3 樣品色譜圖

3 結論與討論

目前，國內在櫻花的繁殖栽培方面、品種分類以及分子標記等方面的研究報道相對較多。如王賢榮[2]、楊明艷等[3]和李曉玲等[4]在扦插繁殖、嫁接繁殖和組織培養(yǎng)等方面做了大量工作；嚴春風等[5]、伊賢貴等[6]、顧宇等[7]在櫻花形態(tài)學分類、孢粉學和細胞分類學等方面研究較為深入；宛甜等[8]、商韜等[9]和張瓊[10]利用分子標記技術對我國櫻屬植物進行了相關研究。然而國內對櫻花化學成分和提取物的研究不多，僅在櫻花色素提取工藝優(yōu)化[11]、櫻葉揮發(fā)油化學成分分析[12]、櫻花提取物體外抗氧化[13-14]等方面有一些研究。在櫻花用于產品研發(fā)方面，更是鳳毛麟角。如劉曉偉等[15]利用櫻花制備一種復合果醬和陸偉等[16]公布一種櫻花糕點的制備方法。總的來說，國內櫻花還主要應用于園林景觀方面，其產品研發(fā)方面還遠遠落后于日本等發(fā)達國家。

本研究利用HPLC法同時測定盛花期‘關山’櫻花中嫩紅素——異櫻花苷和櫻花亭的含量，準確定量測定出了異櫻花苷含量為539.97 μg/g，櫻花亭低于檢測限而未測出。表明盛花期的‘關山’櫻花中異櫻花苷含量較高，可作為櫻花嫩紅素主要成分加以提取，用于化妝品、護膚品和面膜等產品的主要成分。本試驗為后續(xù)櫻花嫩紅素化學成分的提取和應用提供了一定的理論基礎。