單鏈抗體融合蛋白抗腫瘤的研究進展

薛麗娜 張艾立 樓曉昆 閻輝 謝恬 劉臻

歸因于單鏈抗體（single chain Fv,ScFv）的小分子量、高穿透力和低免疫原性等優(yōu)點，ScFv融合蛋白（fusion protein,FP）在腫瘤免疫治療領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用潛力。ScFv與不同的基因或基因片段通過基因重組融合技術(shù)制備得到FP，其具有不同功能蛋白的活性，以直接、特異性靶向和增強免疫系統(tǒng)的方式殺傷腫瘤細(xì)胞。本文對近年來ScFv-FP抗腫瘤的研究進展作一綜述。

1 ScFv-FP的結(jié)構(gòu)與功能

靶向抗腫瘤藥物（targeted anti-tumor drugs,TAT）是將抗腫瘤藥物直接與配體相結(jié)合，在配體的靶向作用下將藥物運輸至腫瘤部位進行精準(zhǔn)治療。在這些靶向配體中，單克隆抗體（monoclonal antibody,mAb）因其特異度高而備受關(guān)注[1]。ScFv是將抗體的輕鏈可變區(qū)（variable region of light chain,VL）和重鏈可變區(qū)（variable region of heavy chain,VH），通過一段 15～20個甘氨酸、絲氨酸或蘇氨酸的柔性肽連接成一種不含F(xiàn)c片段的小分子基因抗體，其分子質(zhì)量僅為原來抗體質(zhì)量的1/6，但仍擁有與相應(yīng)抗原結(jié)合的活性（圖1）[2]。雖然mAb在藥物代謝上更有優(yōu)勢，但是ScFv與原mAb相比分子量小，翻譯后修飾較少，因此保留了與親代抗體對抗原的特異親和力。此外，ScFv更易于與FP相結(jié)合，組織穿透作用強，免疫原性低[3]。

圖1 ScFv的組裝過程

FP是指運用基因工程的方法，選擇性把兩段或多段編碼功能蛋白基因連接在一起，進而表達的新型蛋白產(chǎn)物。目前研究較為熱門的FP包括：（1）可影響骨髓分化的矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（runt-related transcription factor 1,RUNX1）-蛋白酪氨酸激酶（janus kinase 2,JAK2）FP，有望用于白血病治療[4]；（2）人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）-細(xì)胞因子FP：可用于延緩骨髓抑制性化療乳腺癌患者的中性粒細(xì)胞減少時間；（3）白介素 2（interleukin 2,rIL-2）-HSA-FP改善了rIL-2的代謝過快，加強了抗腫瘤療效；（4）人β 防御素 2（human β-defensin-2,DF）-HSA FP 在突變的胰腺細(xì)胞中攝取量更多，對腫瘤細(xì)胞的殺傷率也更大[5]；（5）延長血清半衰期的 ScFv-HSA-FP[5]；（6）人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）-綠膿桿菌（pseudomonas aeruginosa,PA）FP HlaH35A-PA0833改善了宿主對HLA的攝取與免疫器官對HLA的傳遞，增強了人體對致病菌的免疫力[6]。

ScFv-FP是一種由ScFv與蛋白融合而成，既可保持抗原抗體結(jié)合的穩(wěn)定性，又可保持外部蛋白質(zhì)生物活性功能的蛋白質(zhì)。表1列舉了一些常見的ScFv-FP及其功能作用[7-10]。

表1 常見ScFv-FP及其功能作用

2 ScFv-FP的構(gòu)建與選擇

2.1 ScFv的構(gòu)建 首先從雜交瘤細(xì)胞中提取出mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，通過PCR擴增重鏈輕鏈的可變區(qū)基因,用連接肽將VH的C或N端與VL的C或N端相連后即可構(gòu)建制得ScFv。Zhang等[11]從豬外周血淋巴細(xì)胞（peripheral blood lymphocytes，PBL）中提取RNA，并將其作為模板合成cDNA，經(jīng)過PCR擴增VL與VH，通過重疊延伸PCR技術(shù)（gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR） 將 VH、VL和連接肽連接在一起形成全長ScFv。隨著現(xiàn)代分子技術(shù)的發(fā)展，目前通過噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)來進行篩選可獲得ScFv。噬菌體展示技術(shù)是將所需的蛋白DNA序列插入至噬菌體的外殼蛋白基因之中，當(dāng)噬菌體進行復(fù)制時，目的基因也會進行轉(zhuǎn)錄翻譯，從而得到目的蛋白，再進行蛋白篩選[12]。篩選的方式有固相、液相兩種。固相篩選中，由于得到的蛋白具有特異性，可以與肽庫上的特異性靶分子結(jié)合進行孵育，表達蛋白的噬菌體吸附于固相肽庫上，洗滌后即可除去未吸附的噬菌體。將吸附的噬菌體剝離，對宿主菌進行擴增，這一過程可使抗體含量大大增加。Xu等[13]為了更好保持抗原的天然構(gòu)象也有用生物素標(biāo)記抗原，用鏈親和素磁珠在磁場中通過液相分離得到ScFv，通過4輪ScFv-phage肽庫的篩選，得到富集的抗PCSK9-ScFv抗體,但這種方法也存在著每次篩選后肽庫不對稱擴增等問題。Chang等[14]開發(fā)了熒光免疫分析組成的高通量單克隆篩查系統(tǒng)以及使用微芯片激光驅(qū)動的克隆DNA檢索系統(tǒng)，這些系統(tǒng)能夠減少篩選次數(shù)，甚至消除復(fù)雜性較低肽庫的影響。

2.2 ScFv-FP的選擇性構(gòu)建 為了得到ScFv融合基因，首先需要將目的基因和ScFv基因通過PCR相連接，然后將合成的的核苷酸序列克隆到質(zhì)粒中形成重組質(zhì)粒。之后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，離心超聲破碎后即可得到所需的FP（圖2）。如要驗證蛋白，可挑取培養(yǎng)后的菌落，提取質(zhì)粒，進行瓊脂糖凝膠電泳分析所得的蛋白。Liu等[15]通過PCR合成抗流感PB2-ScFv抗體基因，然后將融合的ScFv結(jié)構(gòu)克隆至pET-23a-T質(zhì)粒中，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為DE3菌株，離心超聲破碎得到FP。Li等[16]直接將優(yōu)化的ScFv-RB4蛋白的氨基酸序列經(jīng)過雙酶（T4-DNA連接酶,Taq-DNA聚合酶）消化插入表達載體proEM，proEM使DH5α感受態(tài)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化，得到ScFv-RBP4-FP。劉大斌等[17]分別構(gòu)建了由ScFv-sTF表達的質(zhì)粒pQE80LScFv-sTF和由ScFv表達的質(zhì)粒pQE80L-ScFv來證明FP的抗腫瘤效果，研究結(jié)果表明ScFv-sTF可以與抗原特異性結(jié)合，對腫瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響。吳黎黎等[18]構(gòu)建了pFast-Bac1-scFv-IgG1Fc用于治療腺疾病，其構(gòu)建的FP具有較高的抗原親和力，腫瘤殺傷能力較前明顯提升。高瑞娟等[19]通過重組質(zhì)粒構(gòu)建Fv-LDP-AE研究力達霉素（lidamycin,LDM）FP對腫瘤侵襲的影響，其中LDM是由一個酸性輔基蛋白（lida-protein,LDP）和一個烯二炔發(fā)色團（active enediyne,AE）組成。實驗結(jié)果表明其構(gòu)建的Fv-LDP-AE對人肝癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移具有抵抗抑制作用。

圖2 ScFv-FP的構(gòu)建過程

3 ScFv-FP的表達

ScFv-FP的獲得還需通過外界載體的表達，目前比較常用的表達體系有大腸桿菌表達體系、酵母表達體系、昆蟲表達體系、哺乳動物表達體系等等，而目前穩(wěn)定且熱門的主要是大腸桿菌和酵母表達系統(tǒng)。

3.1 大腸桿菌表達系統(tǒng) 大腸桿菌用于抗體的表達歷史悠久，目前大部分的抗體或抗體片段均通過大腸桿菌這個體系表達。大腸桿菌細(xì)胞膜與外膜有著周漿間隙，根據(jù)其蛋白去路可分為胞外分泌、胞質(zhì)表達、周質(zhì)表達3種：（1）胞外分泌主要分泌少數(shù)小分子肽；（2）胞質(zhì)表達分泌的蛋白表達量最多，但一般均為無活性包涵體；（3）周質(zhì)表達的位置位于外膜與細(xì)胞膜之間，自身活性受外界因素影響較大。大腸桿菌產(chǎn)量高、生長速度快，能選擇性吞噬質(zhì)粒，是外源性蛋白表達的主要途徑。由于抗體含有二硫鍵和多個順式脯氨酸多肽構(gòu)型，在大腸桿菌表達過程中會導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解或錯誤折疊，從而可能產(chǎn)生毒性蛋白[20]。另外，原核生物中缺乏糖基化和磷酸化功能，使得外源性的蛋白表達過程存在一定的弊端。為了解決上述問題，提高大腸桿菌的表達量和表達效率，近年來通過優(yōu)化mRNA模板、使用融合標(biāo)簽、降低包涵體形成技術(shù)、自誘導(dǎo)技術(shù)、高細(xì)胞密度培養(yǎng)技術(shù)、流加培養(yǎng)技術(shù)等可大幅提高外源性蛋白的表達含量與準(zhǔn)確率[21]。

3.2 酵母表達 酵母菌是最常見的簡單真核生物，繁殖快，實驗操作簡單，還有真核生物對外源蛋白加工修飾等功能。用于蛋白翻譯的酵母主要有酒釀酵母、多形漢森酵母、巴斯德畢赤酵母、溶脂亞羅菌、乳克魯維酵母等，其中應(yīng)用最廣泛的為巴斯德畢赤酵母[22]。與原核生物相比，巴斯德畢赤酵母中的甲醇代謝啟動子AOX1可翻譯大量蛋白，分泌效率高、穩(wěn)定性好，與動植物昆蟲等表達載體在操作上更簡單，成本更低[23-24]。其次巴斯德畢赤酵母表達的抗體與PBL分泌的抗體相似性較高，具有較強的抗腫瘤能力。但酵母中N-糖基化、O-糖基化修飾與人源糖基化顯著不同，其可導(dǎo)致免疫原性增加，得到的蛋白半衰期變短等一系列問題。通過酵母分泌途徑中準(zhǔn)確引入人源糖基酶和糖基轉(zhuǎn)移酶可產(chǎn)生人類使用的白蛋白，從而提高蛋白表達的效率。因此使用酵母進行ScFv-FP表達也具有較大的市場價值。

4 ScFv-FP抗腫瘤的機制

ScFv-FP的抗腫瘤機制主要取決于其FP性質(zhì)對應(yīng)的抗腫瘤生物活性，以下列舉部分FP的抗腫瘤機制。

4.1 阻滯腫瘤細(xì)胞周期 高瑞娟等[25]構(gòu)建了由抗明膠酶 ScFv（3G11）和 LDM 組成的 Fv-LDP-AE，體外實驗表明Fv-LDP-AE通過LDM誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯和凋亡，0.01 nmol/L Fv-LDP-AE就能夠阻滯細(xì)胞周期S期和G2/M 期。盛唯瑾等[26]研究表明，ScFVLDM-FP能降低人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中表皮生長因子（epidemal growth factor receptor,EGFR）mRNA的表達，通過抑制Ras和ERK1/2蛋白的表達，阻滯細(xì)胞G2/M期。鐘根深等[27]研究中構(gòu)建的ScFv-FP（dFv-LDP-AE）可增強LDP抑制膠原蛋白酶的作用，使HCC在G2/M期發(fā)生阻滯。

4.2 靶向殺傷腫瘤細(xì)胞 Kanagawa等[28]研究表明，ScFv-CTL可以特異性結(jié)合VEGFR2/flk1靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。倪長偉等[7]構(gòu)建的ScFv-sTRAIL可以與腫瘤細(xì)胞特有的表面抗原靶向結(jié)合并激活TRAIL-2，增強了其腫瘤治療的靶向性與殺傷性。鐘根深等[27]將LDM、抗明膠酶dFv-LDP和強化ScFv-FP（dFv-LDPAE），分別作用于高表達明膠酶的人纖維肉瘤HT-1080。研究結(jié)果表明LDM、抗明膠酶dFv-LDP和強化ScFv-FP（dFv-LDP-AE）均對腫瘤細(xì)胞有抑制和殺傷能力，與常用來治療纖維肉瘤的氨甲喋呤（methotrexate,MTX）比較，dFv-LDP-AE對腫瘤細(xì)胞的的殺傷能力顯著高于MTX，其半數(shù)抑制濃度（IC50）低于MTX 1 000倍或更多。

4.3 抑制腫瘤細(xì)胞的增殖 談燚等[8]成功地構(gòu)建了整合PD-L1抗體的ScFv-mFc，注射了5 mg/kg劑量ScFv-mFc的荷瘤小鼠瘤體體積平均增長率從14.90%降低至3.72%，體內(nèi)實驗顯示ScFv-mFc對腫瘤的抑制生長作用。孫蕊等[29]設(shè)計了針對CD20且富含顯性T細(xì)胞表位的ScFv-pLLO，作用于B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Raji和T淋巴細(xì)胞系Jurkat E6-1，實驗結(jié)果表明ScFv-pLLO能有效抑制RaJi細(xì)胞生長，并且對Jurkat E6-1細(xì)胞不產(chǎn)生作用。

4.4 誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡 郭曉芳等[30]通過實驗發(fā)現(xiàn)不同濃度LDP-Hr-AE均能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，LDPHr-AE濃度越高，細(xì)胞凋亡率越高。孫蕊等[29]以抗CD20的ScFv與顯性表位結(jié)合得到ScFv-pLLO，ScFv的作用機制主要為抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（antibodied depend on cell-mediated cytotoxicity,ADCC）、補體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（complement depend on cell-mediated cytotoxicity,CDC）和細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death,PCD）。ScFv抗CD20抗體中的二型誘導(dǎo)凋亡作用較強，但缺少Fc片段使得ADCC和CDC作用下降，因此加入顯性抗原肽LLO來提高其抗瘤細(xì)胞活性。實驗結(jié)果表明ScFv-pLLO可顯著提高瘤細(xì)胞的凋亡率，加入ScFv-pLLO的RaJi細(xì)胞凋亡率分別是空白組和無關(guān)對照組的6.7倍和5.9倍。

4.5 抑制腫瘤細(xì)胞遷移 高瑞娟等[25]研究表明，F(xiàn)v-LDP-AE是一種基于3G11對腫瘤細(xì)胞Ⅳ型膠原酶靶向結(jié)合特性而構(gòu)建的增強型FP。BoydenChamber侵襲實驗表明Fv-LDP-AE能抑制BEL-7402細(xì)胞侵襲。封云等[31]通過Fab-LDM對人纖維瘤細(xì)胞作用發(fā)現(xiàn)ScFv-FP對腫瘤細(xì)胞遷徙的抑制作用最強。

4.6 增強機體免疫應(yīng)答 杜志娜等[32]研究結(jié)果表明，西妥昔單抗-MICB（major histocompatibility complex-I-related chain molecules B）FP可以加強自然殺傷細(xì)胞免疫抑制腫瘤細(xì)胞Huh7的增殖。Wu等[33]驗證霍亂霉素b亞基（cholera toxin B subunit,CTB）/生長激素抑制素（somatostatin,SS）可以誘導(dǎo)體內(nèi)CTB和SS的特異性免疫，讓患者血清生長激素恢復(fù)正常水平。王璇等[34]構(gòu)建的細(xì)胞因子 FP（IP10-EGFRvⅢ-ScFv）可以增強體內(nèi)淋巴細(xì)胞免疫功能，并穿過血腦屏障殺傷腫瘤細(xì)胞，同時免疫記憶能有效避免腫瘤復(fù)發(fā)。

5 ScFv-FP的應(yīng)用

5.1 腫瘤靶向治療 ScFv具有分子質(zhì)量小、穿透力較強、特異性較高、免疫原性低、不良反應(yīng)較小等優(yōu)點，可將脂質(zhì)體、藥物、免疫毒素、病毒載體等與ScFv連接，形成免疫藥物或者免疫毒素等，同時利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特點，特異性免疫殺傷腫瘤細(xì)胞。ScFv-FP抗腫瘤藥物由于靶向治療針對性強，療效顯著，在殺傷腫瘤細(xì)胞時基本不損傷正常組織，已在臨床腫瘤治療中得到應(yīng)用。Makvandi-Nejad等[35]構(gòu)建的ScFv-CTL可特異性結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子受體2，靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。

5.2 細(xì)胞免疫 病毒感染生物體后，細(xì)胞內(nèi)表達能識別某種病毒編碼蛋白的抗體，從而阻止病毒在細(xì)胞間傳遞。ScFv-FP能在細(xì)胞內(nèi)克隆與表達，從而可用于病毒感染性疾病的診斷和治療。ScFv-FP在細(xì)胞內(nèi)免疫應(yīng)用主要有兩種表型敲除：（1）細(xì)胞內(nèi)表達特定抗體分子，阻斷特定內(nèi)源蛋白活性，用于靶蛋白的生物學(xué)功能基因治療；（2）通過細(xì)胞內(nèi)抗體對特定功能蛋白進行干擾，以達到治療目的。

5.3 影像診斷 由于ScFv具有很強的穿透能力，其在腫瘤組織中的分布指數(shù)高于完整抗體分子，可使腫瘤定位圖像明確、清晰，同時可使放射性核素消除迅速,避免非特異性損傷，因而對人體危害小，可用于影像學(xué)腫瘤成像和定位診斷。IFN-γ與Ⅰ標(biāo)記ScFv聯(lián)合應(yīng)用可使局部腫瘤標(biāo)志物濃度提高2～4倍，可顯著增強顯像效果[36]。放射性同位素標(biāo)記的ScFv在進行腫瘤影像學(xué)分析時，將針對腫瘤特異性抗原或相關(guān)抗原的標(biāo)記抗體注入體內(nèi)，確定腫瘤位置，再通過內(nèi)照射效應(yīng)達到放射性免疫治療。

5.4 生物檢測 ScFv易于制備，親和力良好，常用以快速、準(zhǔn)確檢測食物和水等中的有害物質(zhì)。Makvandi-Nejad等[35]制備的抗莫能菌素ScFv，可靈敏高效檢測出莫能毒素。Meyer等[37]構(gòu)建的抗沙門桿菌外膜蛋白ScFv，能快速準(zhǔn)確檢測出是否存在沙門桿菌感染。

6 總結(jié)與展望

ScFv-FP作為一種小分子基因工程抗體，在理論和應(yīng)用方面的研究頗有進展，在抗腫瘤、構(gòu)建其他工程抗體、顯像定位診斷、靶向治療和細(xì)胞內(nèi)免疫以及生物檢測等方面展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。同時，ScFv-FP藥物市場也持續(xù)擴容，2004年羅氏上市的VEGFR單抗Avastin適用于聯(lián)合以5-FU為基礎(chǔ)的化療方案一線治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，2012年美國食品藥品監(jiān)督管理局（U.S.Food and Drug Administration,FDA）和歐洲藥品管理局先后批準(zhǔn)了Zaltrap通過靜脈給藥治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的方案，2014年FDA批準(zhǔn)PD-1抗體Opdivo和Keytruda可用于治療惡性黑色素瘤、轉(zhuǎn)移性鱗狀非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌和肝細(xì)胞癌，2015年FDA先后批準(zhǔn)單抗藥物Darzalex和Empliciti適用于治療復(fù)發(fā)和難治多發(fā)性骨髓瘤成人患者。盡管應(yīng)用市場不斷擴大，但目前研究仍然存在許多問題，如基于ScFv的小分子量，其在體內(nèi)清除速率過快，甚至可能無法達到有效的診斷和治療周期；其次，其穩(wěn)定性也較差，受到自身結(jié)構(gòu)、配方、環(huán)境及生產(chǎn)操作等多種因素影響，需對其進行有效評估并進行改造。