腦缺血再灌注損傷涉及的信號通路研究進展

章霞 陳冰 李敏 張宇燕 陳偉燕

腦血管疾病具有發(fā)病率、復發(fā)率、致殘率、病死率均較高，并發(fā)癥多，即“四高一多”的特點[1]，其中缺血性腦血管病約占60%～80%，且發(fā)病率逐年升高，發(fā)病年齡趨于年輕化[2]。及時恢復腦組織缺血區(qū)血液供應是缺血性腦血管病治療的有效方法[3]，但在再灌注恢復供血的同時易出現(xiàn)血腦屏障破壞、腦水腫、腦出血、神經(jīng)功能損害及細胞凋亡等病理現(xiàn)象[4]，容易進一步加重腦組織損傷。腦缺血再灌注損傷涉及的信號通路十分廣泛，如磷脂酰肌醇-3激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase,Akt）信號通路、NF-κB 信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信號通路、Notch信號通路及Janus激酶信號轉(zhuǎn)導子與轉(zhuǎn)錄激活子（Janus kinase signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT）信號通路等。本文對目前研究關(guān)注較多的信號通路作一綜述。

1 PI3K/Akt信號通路

PI3K/Akt信號通路與腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞的凋亡密切相關(guān)。PI3K廣泛存在于細胞中，可因抑癌蛋白缺失或胰島素等刺激激活，特異性催化使磷脂酰肌醇3位磷酸化，產(chǎn)生具有第二信使作用的磷酸肌醇。Akt又稱蛋白激酶B，不僅是PI3K/Akt通路的中心環(huán)節(jié)，也是其直接靶點和主要靶酶，主要傳導PI3K始動的生物信息。Akt通過下游靶點如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-9、NF-κB、叉頭框蛋白、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白、前列腺凋亡響應基因-4等調(diào)節(jié)細胞生存與代謝[5]。PI3K/Akt信號通路的作用機制是細胞外刺激激活PI3K，PI3K通過磷酸化Thr308和Ser473位點，直接或間接激活Akt形成磷酸化Akt（phosphorylated,p-Akt）。p-Akt通過增加一氧化氮合酶生成、抑制下游凋亡Caspase-9等的表達、抑制線粒體釋放細胞色素C及凋亡因子、活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、抑制糖原合成酶激酶-3的活性等，調(diào)節(jié)細胞代謝、增殖、凋亡及遷移等過程[6]。

PI3K/Akt信號通路是粒細胞、巨噬細胞刺激因子激活后，作用最強的抗凋亡途徑[7]，也是腦缺血再灌注損傷后引起細胞凋亡、氧化應激等過程的重要信號通路[8]。再灌注后3～12 h，半影區(qū)Akt表達顯著增強，而損傷中心腦區(qū)Akt活性較低[9]。研究表明海馬神經(jīng)元細胞中Akt的激活呈現(xiàn)出先降后升再降的雙向變化趨勢，缺血24 h海馬神經(jīng)元Akt磷酸化水平達到最高，缺血36～48 h后細胞色素C和Caspase-3表達升至最高，表明PI3K/Akt信號通路可能參與調(diào)控了腦缺血后的細胞凋亡[9]。研究通過建立局灶性腦缺血再灌注損傷的模型，發(fā)現(xiàn)與異丙酚組比較，異丙酚+PI3K特異性抑制劑組的大鼠行為學評分、腦梗死體積及細胞凋亡率均明顯增加，B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）蛋白表達量均明顯減少，這提示異丙酚對缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)保護作用可能與PI3K/AKT信號通路有關(guān)[10]。

PI3K/Akt通路在炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展過程中也發(fā)揮著重要作用。PI3K/Akt信號通路中的下游信號分子內(nèi)皮型氧化氮合酶通過“精氨酸-內(nèi)皮型氧化氮合酶-瓜氨酸”途徑合成一氧化氮（nitric oxide,NO），NO可直接抑制炎性細胞因子生成，具有抗炎作用[11]。侯瑋琛[12]研究發(fā)現(xiàn)沒食子酰芍藥苷能通過激活核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2）從而具有抗炎作用，且Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性受PI3K/Akt調(diào)節(jié)，使用PI3K特異性抑制劑Ly294002對PC12細胞進行預處理后，發(fā)現(xiàn)該抑制劑能抑制沒食子酰芍藥苷的促Nrf2轉(zhuǎn)核能力，并且還會抑制沒食子酰芍藥苷對炎癥因子TNF-α和IL-1β的影響，削弱對細胞活性和凋亡的保護作用。由此可見，PI3K/Akt信號通路在腦缺血再灌注損傷后抗凋亡和抗炎方面發(fā)揮了重要作用。

2 NF-κB信號通路

NF-κB是Rel蛋白家族的組成部分[13]，主要分布在神經(jīng)細胞、星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞中，參與調(diào)控多種炎癥基因的轉(zhuǎn)錄[14]，是腦缺血后炎性級聯(lián)反應的始動因素，參與腦缺血再灌注損傷的發(fā)生和發(fā)展[15]。NF-κB常以二聚體形式存在，尤以p65/p50異二聚體最為常見，也是其發(fā)揮生物學活性的主要形式。NF-κB信號通路未激活時，p65/p50二聚體與其抑制蛋白ⅠκB家族結(jié)合成失活狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中，無法發(fā)揮其生物學作用。病理狀態(tài)下，ⅠκB的上游激酶磷酸化使得IκB降解，NF-κB與ⅠκB解離后可與細胞核內(nèi)DNA特定靶點結(jié)合，啟動相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)細胞因子表達、免疫反應及炎癥反應等[16]。激活后的NF-κB可使抑制因子ⅠκB轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，構(gòu)成負反饋調(diào)節(jié)，抑制炎癥介質(zhì)的生成。而炎性細胞因子如IL-1、IL-2、TNF-α，黏附分子如血管細胞黏附分子-1、細胞間黏附分子-1，以及轉(zhuǎn)化生長因子-β等又可誘導NF-κB進一步活化，形成正反饋調(diào)節(jié)，加重炎癥反應[17]。

研究證實，NF-κB信號通路可通過促進炎癥反應、自由基損傷和細胞凋亡，在腦缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[16，18]。腦缺血再灌注損傷后，血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生大量自由基及TNF-α、IL-1、血小板激活因子等誘導NF-κB表達，NF-κB激活使得血管細胞黏附分子-1、細胞間黏附分子-1等黏附分子及炎癥因子的基因表達增多[19]，而上述因子直接或間接影響內(nèi)皮細胞，激活趨化因子，啟動下游激酶級聯(lián)反應[20]。缺血再灌注時，機體也可產(chǎn)生超氧化物歧化酶等因子，阻斷NF-κB信號通路，起到腦保護作用。大量研究證明，皂苷類、黃酮類、酚類和生物堿等中藥活性成分對腦缺血再灌注損傷模型大鼠具有較好的腦保護作用[21]，其腦保護作用機制可能與抑制缺血后NF-κB信號通路的激活有關(guān)。腦缺血再灌注誘導了腦和PC12細胞ⅠκB磷酸化和NF-κB p65的核翻譯，而紅花黃色素B能顯著降低NF-κB p65的核翻譯，同時降低ⅠκB磷酸化，表明其抗炎作用可能是通過抑制NF-κB途徑實現(xiàn)的。研究表明腦心通膠囊治療后腦梗死有所好轉(zhuǎn)，腦梗死體積減少，提示腦心通膠囊可能通過降低TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）-9表達量從而減輕腦損傷，與此同時，NF-κB表達量也相應降低，提示腦心通治療腦缺血的機制可能是通過NF-κB信號通路調(diào)節(jié)NF-κB表達量,進一步調(diào)節(jié)炎癥反應，減少再灌注損傷，改善梗死后腦水腫，保護腦組織[22]。除此之外，采用針刺治療能顯著降低血清及缺血腦組織IL-1β、IL-6和IL-8含量，降低NF-κB p 65蛋白表達，從而有效調(diào)節(jié)急性腦缺血大鼠炎性損傷[23]。

NF-κB信號通路還與腦缺血再灌注損傷后引起的細胞凋亡密切相關(guān)。雷公藤內(nèi)酯醇對急性腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能缺損評分明顯改善，神經(jīng)細胞凋亡減少，腦梗死體積減小，與此同時，NF-κB p65和NF-κB活性的表達被抑制[24]，提示NF-κB通路激活可能與細胞凋亡有關(guān)。在腦缺血再灌注損傷中，NF-κB信號通路的作用機制主要是促進炎癥反應、誘導細胞凋亡和介導自由基損傷，3條途徑相互作用、相互影響，加重了腦損傷程度。研究也表明，NF-κB的活化具有雙向性，活化過度加重腦缺血損傷，表達不完全則不利于保護腦組織[18]。因此，如何適度干預NF-κB的活化以減輕腦缺血再灌注損傷，已成為今后研究的熱點和重點。

3 MAPK信號通路

MAPK信號通路是真核細胞內(nèi)重要的信號傳導系統(tǒng)，是聯(lián)系細胞質(zhì)和細胞核的樞紐。MAPK信號通路的激活是一個三級酶促級聯(lián)反應，MAPK激酶磷酸化后激活MAPK，將細胞外刺激信號轉(zhuǎn)導至細胞內(nèi)部，調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等過程[25]。MAPK信號通路包括細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signalregulated kinase,ERK）通路、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）/應激活化蛋白激酶（stress activate dprotein kinase,SAPK）通路、p38通路和ERK5通路4條途徑[26]。目前上述信號通路活性表達強弱對腦缺血再灌注損傷的影響已成為研究的熱點。

絲裂原活化蛋白激酶（methyl ethyl ketone,MEK）/ERK通路被生長因子、細胞因子、G蛋白偶聯(lián)受體配體、滲透壓等刺激后，按神經(jīng)生長因子（nerve growth factor,NGF）-大鼠肉瘤蛋白（rat sarcoma protein,RAS）-加速纖維肉瘤激酶（rapidly accelerated fibrosarcoma,RAF）-MEK順序激活，激活后的ERK1/2通過核轉(zhuǎn)位進入細胞核，進一步激活其下游相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和胞質(zhì)/胞核激酶有絲裂原激活的蛋白激酶作用激酶（MAP kinase-interacting kinase,MNKs）、核糖體 S6蛋白激酶（ribosomal S6 kinase,RSK）、絲裂原和應激激活蛋白激酶（mitogen-and stress-activated protein kinases,MSKs）等，從而調(diào)控細胞的生長、增殖和分化[27]。ERK/MAPK通路參與調(diào)控腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞的凋亡，當神經(jīng)元缺血缺氧時，神經(jīng)元細胞會發(fā)生自噬和凋亡。Beretta等[28]應用MEK-ERK1/2和ERK1/2 MAPK阻滯劑、p38 MAPK阻滯劑研究七氟醚對腦缺血再灌注損傷的保護機制，提出MEKERK1/2和ERK1/2 MAPK是保證細胞外信號傳導至胞內(nèi)的重要信號通路。姜云耀等[29]通過網(wǎng)絡藥理學方法，經(jīng)通路富集分析后，明確益氣通絡顆粒保護腦缺血再灌注損傷靶基因比較集中的3條信號通路為環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）、PI3K/Akt和ERK/MAPK，同時研究還發(fā)現(xiàn)，給藥組與模型組比較，cAMP含量顯著上升，PKA、p-環(huán)磷腺苷效應元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein,CREB）、p-Akt和 p-丙酮酸磷酸雙激酶（pyruvate orthophosphate dikinase,PPDK） 表達增加，p-JNK、p-p38和p-ERK表達下降，表明益氣通絡顆粒通過調(diào)控cAMP、PI3K-Akt和ERK/MAPK信號通路發(fā)揮了對腦缺血再灌注損傷的保護作用。亞低溫療法也可改善大鼠缺血后神經(jīng)功能缺損，減少梗死面積及細胞凋亡，顯示其對腦組織的保護作用可能與通過MAPK/ERK通路降低磷酸化MEK-2、ERK1/2蛋白的表達水平有關(guān)[30]。

p38 MAPK是MAPK家族的重要成員，在應激條件下被激活，既參與調(diào)控細胞生長、損傷、凋亡和炎癥反應等過程，又介導神經(jīng)元的生長和凋亡[31]，被稱為細胞信號轉(zhuǎn)導的中轉(zhuǎn)站。p38信號通路可被炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1、表皮細胞生長因子（epidermal growth factor,EGF）/轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-β,TGF-β）或紫外線等刺激激活[32]，調(diào)控細胞凋亡、細胞因子產(chǎn)生及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。研究顯示p38 MAPK信號通路可能通過以下環(huán)節(jié)參與細胞凋亡[33]：（1）使c-myc基因表達增強；（2）促進 p53磷酸化；（3）激活 cfos基因和c-jun基因；（4）相關(guān)凋亡因子/相關(guān)凋亡因子配體（factor associated suicide/factor associated suicide ligand,Fas/FasL）介導調(diào)亡；（5）增強 Bax 轉(zhuǎn)位；（6）增強表達TNF-α。p38 MAPK能夠增強TNF-α表達水平，促進p38 MAPK活化，誘導細胞凋亡。Legos等[34]在腦缺血小鼠造模前1 h及造模后6 h，給予不同口服劑量的 SB239063（p38 MAPK抑制劑），24 h后檢測腦梗死體積及神經(jīng)元缺損情況，結(jié)果顯示口服SB239063可明顯減少腦梗死體積，降低神經(jīng)元缺損。p-p38 MAPK在大鼠腦中動脈缺血組、電針預處理組均較正常組明顯上調(diào)[35]，提示p38 MAPK通路參與了大腦中動脈閉塞的發(fā)生，而且電針預處理組p-p38 MAPK/p38 MAPK明顯低于大鼠腦中動脈缺血組，表明抑制p38 MAPK磷酸化可能是電針預處理干預大腦中動脈閉塞的重要機制之一。因此p38 MAPK信號通路可能成為治療腦缺血再灌注損傷的作用新靶點。

4 Notch信號通路

Notch 信號通路由 4 種受體（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）、5 種配體（DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1和Jagged2）及下游效應物組成，可調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡、遷移及黏附等生長發(fā)育[36]。缺氧時，缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor,HIF-1α）激活，誘導血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）等表達，DLL4等Notch配體表達增多，其胞外段與細胞表面的Notch受體胞外段結(jié)合，激活Notch受體，在去整合素金屬蛋白酶的作用下，Notch受體胞內(nèi)段裂解并遷移入核，并與MAML蛋白轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動下游靶基因Hes1、Hes7等的轉(zhuǎn)錄。

腦缺血后，Notch信號通路在神經(jīng)細胞凋亡、炎癥反應及缺血區(qū)血管生成等方面均能發(fā)揮較好的調(diào)控作用。腦缺血后，Notch受體胞內(nèi)段表達增多，激活JNK/c-Jun信號通路促進細胞凋亡級聯(lián)反應[37]，抑制Notch信號通路可抑制神經(jīng)細胞凋亡，保護神經(jīng)功能免受侵害[38]。Zhao等[39]建立小鼠全腦缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)鳶尾素預處理后，IL-1β和TNF-α的表達降低，海馬神經(jīng)元的凋亡減少，表明鳶尾素可能抑制腦缺血損傷后的炎癥，減少神經(jīng)元凋亡，同時鳶尾素還能上調(diào)Notch1、Notch胞內(nèi)段和Hes-1的表達，表明鳶尾素可通過激活Notch信號通路減輕腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)損傷。Notch信號在小膠質(zhì)細胞中表達，對小膠質(zhì)細胞的成熟和活化具有促進作用，并可促進腦缺血再灌注損傷后炎癥反應的發(fā)生[40]。劉波[41]對腦中動脈缺血大鼠進行DAPT（一種γ-泌肽酶特異性抑制劑）治療，發(fā)現(xiàn)Notch信號通路在大鼠缺血性腦損傷過程中被激活，活性明顯上調(diào)，而DAPT可減少 Notch-1、Jagged-1、Hes-1 的表達，也可減少 IκB 激酶、NF-κB的表達，表明Notch信號通路可通過NF-κB參與炎癥反應，介導腦缺血再灌注損傷。Notch信號通路在內(nèi)皮細胞分化為頂端細胞和柄細胞的過程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。腦缺血發(fā)生后，HIF-1α被激活，可促進VEGF表達，VEGF配體與受體結(jié)合激活Notch信號通路，上調(diào)DLL4的表達，啟動下游靶基因Hey、Hes轉(zhuǎn)錄。

5 JAK/STAT信號通路

JAK/STAT信號通路是多種細胞因子在細胞內(nèi)傳遞信號的共同途徑，主要參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、存活、凋亡等過程[42]。大量研究表明，JAK/STAT信號通路在腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡的過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，其中JAK2-STAT3關(guān)系最為密切。腦缺血后JAK2-STAT3過度活化，JAK2-STAT3信號通路異常激活，加速了神經(jīng)元細胞的凋亡，導致腦損傷加重。魏小于等[43]研究發(fā)現(xiàn)白及多糖治療腦缺血再灌注損傷大鼠可抑制JAK2-STAT3信號通路異?；罨种萍毎蛲?、炎癥反應，從而保護缺血后神經(jīng)細胞，阻斷腦損傷的加重。

目前，腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元細胞的存活、死亡與JAK/STAT信號通路的具體關(guān)系尚不明確。因此，深入探討JAK/STAT信號通路在調(diào)控腦缺血再灌注損傷中神經(jīng)元凋亡的作用機制，分析JAK/STAT信號通路與其他信號通路之間的相互作用，將為防治腦缺血再灌注損傷提供更有效的思路，并為尋求治療新靶點提供可靠的參考依據(jù)。

6 其他腦缺血再灌注損傷過程中的信號通路

參與腦缺血再灌注損傷的信號通路還有很多，例如水通道蛋白4、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、MMP、死亡受體通路、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotidebinding oligomeric domain-like receptor protein 3,NLRP3）炎性復合體通路、低氧誘導因子（hypoxia inducible factor,HIF）等。缺血再灌注后出現(xiàn)的腦水腫與MMP關(guān)系密切，褪黑素可減少MMP-9表達以保護血腦屏障的毛細血管基膜完整性[44]，維持顱內(nèi)外滲透壓平衡，減少腦水腫的發(fā)生[45]；MMP-2和MMP-9可激活lL-8等多種促炎因子、消化Ⅳ型膠原蛋白和緊密連接蛋白及破壞顱內(nèi)外滲透性平衡，促進腦水腫的發(fā)生[46]。同時，MMP-2和MMP-9在再灌注損傷中發(fā)揮的作用也不盡相同，MMP-9參與早期腦缺血再灌注損傷后腦水腫的形成及再灌注損傷[47]，而MMP-2主要負責后期修復組織及清除壞死組織等。研究表明，川芎、黃芪有效成分配伍可有效抑制缺氧誘導的腦微血管內(nèi)皮細胞發(fā)生G1/S期阻滯，減少細胞的凋亡，減弱細胞中Caspase-3和Caspase-8基因表達，而Caspase-8是死亡受體通路的關(guān)鍵啟動因子，活化后的Caspase-8可引發(fā)Caspase蛋白酶解級聯(lián)反應，并進一步鏈式水解激活其下游的Caspase-6、Caspase-7等同源酶，最后激活其效應物Caspase-3發(fā)生生物效應。以上均說明川芎、黃芪有效成分對內(nèi)皮細胞的保護作用可能與抑制死亡受體通路有關(guān)。

7 小結(jié)

腦缺血再灌注損傷是一個復雜的損傷過程，以神經(jīng)細胞凋亡為主要因素，線粒體功能障礙與炎癥反應為關(guān)鍵環(huán)節(jié)，氧化應激、興奮氨基酸過度釋放等為重要誘發(fā)因素，鈣離子超載、血腦屏障破壞、酸中毒以及腦水腫等為繼發(fā)性損傷，共同促進腦缺血損傷的惡化。腦缺血再灌注損傷涉及的信號通路相當廣泛，且各信號通路間互相影響、相互交叉成網(wǎng)絡，如腦缺血后Notch通路和NF-κB信號通路相互交叉影響，促進炎癥因子表達[48]；NLRP3信號通路亦可通過激活NF-κB通路上調(diào)IL-1β前體表達，進一步增強NLRP3炎性體的作用[49]。而這些作用機制與各信號通路之間的相互作用或關(guān)系尚不明確，有待于進一步深入研究。

目前臨床常采用中西醫(yī)聯(lián)合用藥的方式治療腦缺血再灌注損傷，利用中藥多組分、多途徑、多靶點綜合作用的特點，通過抑制細胞凋亡、抑制炎癥反應、減少自由基產(chǎn)生等多種途徑聯(lián)合防治缺血再灌注損傷。但是，聯(lián)合不同信號通路共同預防和治療腦缺血再灌注損傷的措施因?qū)嵤┑臅r間點、交匯點及組合方式均不明確，需要進一步深入開展各信號通路之間的相互作用及作用機制的研究。