病原感染在自身免疫性肝病發(fā)生發(fā)展中的作用

張海萍， 閆惠平， 陳德喜， 馬迎民

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 臨檢中心， 北京市肝病研究所， 北京 100069

自身免疫性肝病(autoimmune liver disease，AILD)主要包括以肝臟實質(zhì)細胞炎癥損傷為主的自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)、以慢性肝內(nèi)膽汁淤積為特征的原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis，PBC)和以特發(fā)性肝內(nèi)外膽管炎癥和纖維化為特征的原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis，PSC)。與其他自身免疫疾病相似，這類免疫介導(dǎo)的肝膽疾病的發(fā)病機制目前尚不明確，近年很多學(xué)者從遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)、腸道微生態(tài)、分子模擬、化學(xué)藥物、環(huán)境因素等各個方面陸續(xù)闡述了AILD的發(fā)病機制研究進展[1]。但是，疾病是如何起始的？驅(qū)動因素是什么？依然知之甚少。

病原體感染與AILD發(fā)病相關(guān)的問題近年已有報道，包括感染肝炎病毒后出現(xiàn)AIH、或在明確HBV或HCV感染的患者中存在高滴度自身抗體和AILD的疾病特征，非常需要臨床醫(yī)生進行鑒別診斷。而且文獻[2]證實，以大腸桿菌感染為主的尿路感染是PBC(尤其是女性患者)發(fā)病的危險因素之一。EB病毒(EBV)、水痘帶狀皰疹病毒等也有與自身免疫疾病的觸發(fā)有關(guān)的報道。但是，這些病毒或細菌是如何造成機體免疫耐受機制被破壞，進而誘導(dǎo)出現(xiàn)AILD？下文將從分子模擬機制等方面簡單介紹病原感染在AIH和PBC的發(fā)生和發(fā)展中的作用及其影響。

1 分子模擬機制與自身免疫性疾病

早在20世紀(jì)60年代早期，有學(xué)者[3]觀察到寄生蟲和宿主之間存在抗原交叉反應(yīng)，并提出了保護性分子模擬的概念。此后，Damian將這種分子模擬的概念轉(zhuǎn)移到了自身免疫領(lǐng)域，他認(rèn)為病原體和宿主之間的這種相似性或相互作用可能導(dǎo)致自身免疫[4]。近一步研究認(rèn)識到，某些外來抗原與宿主細胞或細胞外抗原成份有序列同源性，進入人體后激發(fā)的免疫應(yīng)答既攻擊外來物質(zhì)，也同時攻擊人體的細胞或細胞外成份，因而引起自身免疫性疾病。

分子模擬可能是外來抗原(傳染源、藥物、外來化學(xué)物質(zhì)和腸道源性細菌等)打破機體自我耐受的一種機制。通過這種機制，適應(yīng)性免疫反應(yīng)可以對與自身相似但不完全相同的表位致敏。產(chǎn)生分子模擬的物質(zhì)與機體的自身抗原在結(jié)構(gòu)或構(gòu)象上有相似之處，入侵的病原體、自然環(huán)境中的抗原[5]、合成肽(化學(xué)制劑、氟烷)和疫苗[6]等都有可能是誘導(dǎo)交叉反應(yīng)抗體和免疫細胞反應(yīng)來打破自我耐受的外源性觸發(fā)因素。在感染源與自身免疫的關(guān)系方面，已經(jīng)證明多種細菌和病毒感染通過分子模擬與自身免疫性疾病關(guān)聯(lián)，例如在格林-巴利綜合征(Guillain-barre syndrome，GBS)中，已發(fā)現(xiàn)空腸彎曲菌感染與周圍神經(jīng)神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)構(gòu)(GM1)有同源性，而且GBS患者攜帶對低聚脂糖和GM1神經(jīng)節(jié)苷脂都有反應(yīng)的自身抗體(交叉抗體)[7-8]。另一個例子是化膿性鏈球菌M蛋白和人心肌肌球蛋白之間的分子模擬，風(fēng)濕性心臟病相關(guān)瓣膜炎患者產(chǎn)生抗體和T淋巴細胞，這些抗體和T淋巴細胞對鏈球菌M蛋白和心肌肌球蛋白都有反應(yīng)，而鏈球菌M蛋白免疫的大鼠也會發(fā)生瓣膜炎[9]。在肝病中，大腸桿菌等微生物通過分子模擬在PBC的病因中發(fā)揮作用，以下將有詳細闡述。更新的例子見于新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)，有研究提示SARS-CoV-2可能是一種快速自身免疫和/或自身炎癥失調(diào)的“激發(fā)因子”，在有遺傳傾向的個體感染新冠病毒后，導(dǎo)致嚴(yán)重的間質(zhì)性肺炎出現(xiàn)。2020年4月Zhang等報道[10]，在某醫(yī)療隊收治的我國危重癥新冠肺炎患者中，約40%出現(xiàn)抗磷脂抗體陽性(分子模擬機制可能參與其中)，其他自身抗體陽性則少見。其中部分抗磷脂抗體陽性的患者出現(xiàn)腦梗塞等嚴(yán)重血栓事件，提示新冠肺炎患者體內(nèi)存在自身免疫紊亂現(xiàn)象。

2 病毒感染與AIH的發(fā)病

2.1 HCV感染與抗肝腎微粒體抗體(anti-liver kidney microsomal antibodies, 抗-LKM) 抗-LKM(含抗-LKM-1)是AIH-2型的標(biāo)志性自身抗體，其靶抗原為細胞色素P450 2D6(cytochrome P450 2D6，CYP2D6)。近二十年來學(xué)者們對CYP2D6的免疫應(yīng)答及抗原表位的各種特征進行了較為詳細的研究[11]。AIH一般分為兩型：AIH-1型以成人為主，占大多數(shù)，AIH-2型主要見于兒童和青少年，僅占AIH的4%～5%[12]。由此決定了臨床上抗-LKM陽性病例十分少見。不僅少見，幾項獨立研究[13-15]表明，高達10%的HCV感染者中存在抗-LKM。筆者團隊[16]對約10萬例次肝功能異?；颊邫z測自身抗體，僅發(fā)現(xiàn)抗LKM(或抗LKM-1)陽性15例, 其中符合AIH-2型診斷的患者7例，均為青少年；余8例診斷為丙型肝炎，均為中年以上患者。

為什么出現(xiàn)這種抗體交叉反應(yīng)的現(xiàn)象？文獻[17]報道，一些丙型肝炎患者在產(chǎn)生針對HCV蛋白NS3和NS5a的抗HCV抗體的同時還與CYP2D6蛋白的跨膜氨基酸254-288位的構(gòu)象表位發(fā)生交叉反應(yīng)。CYP2D6的這一區(qū)域包含免疫顯性表位aa263-270。因此，HCV蛋白和CYP2D6蛋白某些區(qū)域之間的分子模擬可能是慢性HCV感染者出現(xiàn)這種交叉反應(yīng)性自身抗體的一種解釋。另一項針對60例LKM-1陽性和120例LKM-1陰性丙型肝炎患者的研究[18]觀察到，LKM-1陽性患者存在AIH的表現(xiàn)，丙種球蛋白水平較高，肝內(nèi)CD8 T淋巴細胞頻率較高，而兩組的抗病毒治療效果相同。這表明，至少有一部分感染HCV的患者可能同時存在AIH。不過，鑒于國際自身免疫性肝炎組織(Intemational Autoimmune Hepatitis Group，IAIHG)制定的診斷評分系統(tǒng)及簡化評分系統(tǒng)都將病毒指標(biāo)陽性作為減分標(biāo)志物，因此，伴有抗-LKM陽性的HCV患者能否確診AIH，對醫(yī)生來說存在挑戰(zhàn)。而且，困惑的問題還表現(xiàn)在二者有無因果關(guān)系？首先是僅存在交叉反應(yīng)性抗體并不能證明HCV就是導(dǎo)致AIH的觸發(fā)因素；其次，即使其中一些患者確實同時患有丙型肝炎和AIH，也難以確定HCV感染是AIH的啟動因子。

2.2 HCV與抗平滑肌抗體(anti-smooth muscle antibodies, ASMA)和抗核抗體(antinuclear antibodies, ANA) HCV患者存在不同的自身抗體是臨床較為常見的現(xiàn)象。有報道[19]稱，HCV多蛋白區(qū)域與三種平滑肌蛋白(波形蛋白、smoothelin、肌球蛋白)和兩種核抗原(基質(zhì)蛋白、組蛋白H2A)區(qū)域之間存在氨基酸序列的分子模擬。因而推測，HCV感染者的血清也可能是通過產(chǎn)生ASMA或ANA對上述一些模擬宿主抗原發(fā)生反應(yīng)。

2.3 其他肝炎病毒與AIH 在20世紀(jì)90年代初，甲型肝炎病毒感染和AIH的關(guān)系在58例AIH患者一級親屬隊列中得到認(rèn)識。3名親屬表現(xiàn)為亞臨床甲型肝炎，而在此后的5個月內(nèi)，3人中有2人發(fā)展成為AIH[20]。

不同類型的HBV感染者檢測到自身抗體也是臨床常見的情況，大部分自身抗體為低滴度非特異性的自身抗體，而且可能在疾病進程中減弱或消失。有研究[21]發(fā)現(xiàn)，數(shù)據(jù)庫顯示HBV蛋白與ANA/ASMA抗原靶位有區(qū)域同源性，例如，HBV DNA聚合酶與ANA中某些抗原成份：細胞核核心蛋白(NCP)、細胞核有絲分裂器(NUMA)、多發(fā)性硬化抗原(PM-Scl)等各有6～9個氨基酸序列同源， 26%～40%的HBV感染者可能表現(xiàn)針對這些抗原的雙倍活性。而在非病毒導(dǎo)致的肝病中缺乏這種反應(yīng)性。

2.4 EBV感染與AIH 另一個有趣的病原體是EBV，多篇報道[22-23]認(rèn)為其與多種自身免疫性疾病有關(guān)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、自身免疫性甲狀腺炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、1型糖尿病、干燥綜合征和重癥肌無力，以及AIH。有病例報告[24]描述了EBV感染后出現(xiàn)AIH：1例26個月大的女嬰在最近的EBV感染后表現(xiàn)出AIH的典型特征，包括血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高、抗-LKM-1抗體的產(chǎn)生以及T淋巴細胞/漿細胞浸潤的界面性肝炎。雖然有記載的案例認(rèn)為AIH的診斷與EBV感染在時間上非常接近，但是，由于EBV在人群中極高的感染率和AIH低的流行率，列舉足夠可靠的證據(jù)證明兩者的因果關(guān)系還是極為困難的。

2.5 其他病毒與AIH 除了與HCV相關(guān)之外，人們還發(fā)現(xiàn)抗-LKM陽性AIH-2型患者識別的免疫優(yōu)勢表位aa254-271的序列含有一個核心序列PAQPPR，該序列也存在于人類α皰疹病毒1型(human alpha herpesvirus type 1, HHV-1)的感染細胞蛋白4(ICP4)中，從分子模擬機制表明，HHV-1感染也可能在AIH的發(fā)病機制中發(fā)揮作用[25]。還有個案報道[26]認(rèn)為感染人類免疫缺陷病毒(HIV)會引發(fā)AIH：1例52歲的HIV感染者表現(xiàn)血清轉(zhuǎn)氨酶和γ免疫球蛋白水平升高、ANA陽性以及伴有漿細胞增多的界面性肝炎。與以上病例不同的是，HIV感染和AIH的診斷在時間上不接近，相隔了7年；患者血清HAV、HCV、EBV和巨細胞病毒相關(guān)抗體呈陰性，但有既往HBV感染病史。因此這個病例或許是一個多種病毒感染在自身免疫紊亂條件下導(dǎo)致事實上自身免疫病發(fā)生的例子。此外HIV感染者的免疫狀態(tài)受損可能是另一個需要考慮的因素：HIV感染期間CD4 T淋巴細胞數(shù)量減少以及抗HIV治療可能對調(diào)節(jié)性T淋巴細胞產(chǎn)生選擇性影響 ，從而可能促進自身免疫疾病的發(fā)展。

3 細菌感染與PBC的發(fā)生

3.1 大腸桿菌與PBC關(guān)聯(lián)

PBC的流行病學(xué)、病例對照研究和大樣本實驗研究[27]表明，細菌感染特別是大腸桿菌感染通過分子模擬機制作用機體，是破壞線粒體自身抗原免疫耐受的一個關(guān)鍵因素，導(dǎo)致針對線粒體自身抗原的抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibody, AMA)產(chǎn)生。

PBC患者(尤其是女性患者)的尿路感染問題首次報道于1984年，Burroughs描述了87例PBC患者中17例(19%)、89例其他慢性肝病患者中6例(7%)出現(xiàn)明顯菌尿[28]。大腸桿菌通常是尿路感染中被分離到的主要微生物。但此后觀察的結(jié)果并非一致，F(xiàn)loreani等[29]報道，PBC的尿路感染總患病率為11.2%，其他慢性肝病為12.1%(其中女性患者為18.4%)，未能證明尿路感染在PBC患者中有顯著差異。

進入21世紀(jì)后，幾個歐美國家進行了幾項大規(guī)模的病例對照研究[30-32]。Howel等在英格蘭東北部進行的基于人群的病例對照研究，共納入100例PBC患者和年齡性別匹配的對照組；61%(58/100)的PBC和51%(109/223)的對照組未發(fā)生尿路感染，未能證明尿路感染與PBC的發(fā)生有關(guān)。此后他們在同一地理區(qū)域再次進行了大樣本病例對照研究(n=318)，此次的數(shù)據(jù)顯示出PBC與尿路感染有顯著關(guān)聯(lián)[33]。他們將這兩項研究的差異歸因于前一項研究的小樣本量及存在大量風(fēng)險因素。一項在法國的研究[34]從2006年—2007年共納入222例PBC患者。結(jié)果表明，經(jīng)多元logistic回歸分析，218例中104例(48%)和509例對照組中157例(31%)的尿路感染及復(fù)發(fā)史均與PBC顯著相關(guān)(P=0.001)。在美國進行的研究是有史以來最大的，包括1032例PBC患者和年齡、性別、種族和地理位置的匹配的1041例對照組，再次確認(rèn)了大腸桿菌為主的尿路感染史是PBC發(fā)病的顯著危險因素。

3.1.1 大腸桿菌感染與AMA 在90%～95%的PBC患者中可以檢測到AMA，它是非常重要的標(biāo)志物。AMA識別線粒體內(nèi)膜中的一個酶家族，即2-氧乙酸脫氫酶復(fù)合物(2-oxoacid dehydrogenase complexes，2-OADC)，主要包括丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2亞單位(pyruvate dehydrogenase complex E2 subunit，PDC-E2)，支鏈2-氧酸脫氫酶復(fù)合物(branched chain 2-oxo-acid dehydrogenase complex，BCOADC- E2)，2-氧戊二酸脫氫酶復(fù)合物(2-oxo-glutaric acid dehydrogenase complex，OGDC-E2)及二氫脂酰胺脫氫酶結(jié)合蛋白等(dihydrolipoamide dehydrogenase binding protein，E3BP)。序列分析表明，人PDC-E2與大腸桿菌PDC-E2具有顯著的同源性，特別是在AMA的免疫優(yōu)勢表位區(qū)域(表1)。整個ExDK序列被人類和大腸桿菌PDC-E2共享，也是人類PDC-E2識別CD4+PDC-E2特異性T淋巴細胞的基本序列，這種人PDC-E2與大腸桿菌PDC-E2之間的分子模擬可能解釋了線粒體自身抗原耐受性的破壞和AMA的產(chǎn)生。PDC-E2位于線粒體膜內(nèi)，含有硫辛酸-賴氨酸鍵，這是抗原識別和免疫細胞激活所必需的。凋亡膽管上皮細胞(biliary epithelial cells, BEC)內(nèi)PDC-E2異常修飾，使得在特征性的凋亡小泡內(nèi)抗原表位保持免疫完整性。這種免疫原性復(fù)合物被循環(huán)中的AMA識別，形成抗原-抗體復(fù)合物，介導(dǎo)了靶向性膽道損傷。AMA對PBC的高度特異性提示它不僅是診斷PBC的血清學(xué)標(biāo)志物，而且在PBC的免疫病理學(xué)中也具有重要意義。

3.1.2 大腸桿菌與CD4+/CD8+T淋巴細胞表位 細胞免疫的研究[35]同時表明，大腸桿菌的感染可能導(dǎo)致自身反應(yīng)性T淋巴細胞和B淋巴細胞識別自身抗原，致使對線粒體自身抗原的免疫耐受被打破。PBC的組織學(xué)特征包括在門靜脈周圍近中小膽管的單個核細胞密集浸潤，免疫組化對這些淋巴細胞的檢測顯示出優(yōu)勢CD4+和CD8+T淋巴細胞、B淋巴細胞和自然殺傷細胞(NK細胞)。PBC患者肝臟中的膽管上皮細胞和肝細胞也表達大量的人類白細胞抗原(HLA)Ⅰ類和Ⅱ類分子[36]。因此，CD4+和CD8+自身反應(yīng)性T淋巴細胞在PBC發(fā)病機制中起重要作用。在PDC-E2上定位T淋巴細胞自身表位是一項重要的發(fā)現(xiàn)，為進一步研究PBC的自身反應(yīng)性細胞免疫提供了條件。首先，用重組PDC-E2多肽的重疊肽技術(shù)證明了PBC的肝內(nèi)浸潤性T淋巴細胞亞群是專門針對PDC-E2的[37]。此外，在PDC-E2的內(nèi)脂酰結(jié)構(gòu)域內(nèi)的163-176氨基酸殘基(GDLLAEITDKATI)被確定為最小T淋巴細胞表位(表1)，該表位由橫跨整個PDC-E2序列的33個重疊合成肽組成。此外，這些CD4+T淋巴細胞克隆也識別其他線粒體抗原，包括OGDC-E2、BCOADC-E2和E3BP。

總之，已經(jīng)證明PBC患者的血清可與人PDC-E2和大腸桿菌PDC-E2均發(fā)生反應(yīng)，實驗研究證實大腸桿菌感染通過分子模擬機制不僅在B淋巴細胞水平，也在T淋巴細胞水平可以引發(fā)免疫系統(tǒng)的對人PDC-E2耐受性的破壞。

表1 人PDC-E2 155-1851*的分子模擬和免疫優(yōu)勢表位Table 1 Molecular mimicry and immunodominant epitopesof human PDC-E2 155-1851*

3.2 環(huán)境中微生物的分子模擬與PBC 大腸桿菌并不是破壞線粒體自身抗原耐受性的唯一細菌，在眾多的候選菌中，新鞘氨醇桿菌屬芳香新鞘氨醇菌(N.aromaticivorans) 引起關(guān)注。該菌是一種革蘭陰性需氧菌，其PDC-E2蛋白的氨基酸序列與人類PDC-E2的主要免疫原性脂?；Y(jié)構(gòu)域也具有高度同源性(表1)。值得注意的是，這種微生物在環(huán)境中(土壤、水和沿海平原沉積物)無處不在[38]?？梢?，其他細菌也有可能通過分子模擬參與PBC的病因?qū)W[39]，這給認(rèn)識PBC的發(fā)病因素又增加了復(fù)雜性。

4 未解的問題

多年的研究表明，病原體與許多自身免疫性疾病的起病有關(guān)，但是難以獲取其在自身免疫破壞過程的啟動和/或傳播中發(fā)揮作用的直接確鑿證據(jù)。原因是多方面的，首先，不是所有病例都有特定病原體感染史，也不是所有受到該病原感染的人都發(fā)生了相關(guān)的自身免疫疾病。第二，某些患者既往可能確實遭遇某種病原體，但在自身免疫疾病診斷時，由于病原體消除又無明顯的抗體而不能得到既往病原體感染的證據(jù)。第三，旁觀者誘導(dǎo)的炎癥使阻止腸道共生菌發(fā)生逃逸的屏障被破壞，可能發(fā)生微生物易位。研究者[40]發(fā)現(xiàn)一種腸道細菌——鶉雞腸球菌(Enterococcusgallinarum)會遷移到肝臟、腸系膜等組織器官，造成自身免疫性疾?。辉浑s交方法確證自身免疫病遺傳模型小鼠的肝臟中存在這種腸球菌；AIH患者的肝組織中也存在鶉雞腸球菌，而正常人及非AIH患者肝臟組織則未發(fā)現(xiàn)這種細菌。第四，有人推測病原體感染到機體發(fā)生自身免疫損傷是一個漫長過程[23]。首次感染引起機體免疫反應(yīng)以消滅入侵的生物體，病原體可能在幾天或幾周內(nèi)被消滅，也可能持續(xù)存在較長時間。在慢性感染的情況下，免疫反應(yīng)不足以完全消除病原，但由于病原體和宿主之間存在相似結(jié)構(gòu)，最初針對該病原體產(chǎn)生的交叉反應(yīng)性B淋巴細胞/抗體和/或T淋巴細胞會慢慢攻擊宿主的類似結(jié)構(gòu)，從而在該病原體感染后數(shù)月、數(shù)年甚至數(shù)十年內(nèi)導(dǎo)致自身免疫病發(fā)生。

綜上所述，AILD的啟動因素是復(fù)雜的，日常生活中、環(huán)境中的多種微生物、抗原物質(zhì)均可能是自身免疫的誘發(fā)或啟動因素。在病因與發(fā)病機制方面，有許多未知問題需要深入認(rèn)識與探索。相信未來將有更多研究成果，幫助認(rèn)識病原體感染與AILD的關(guān)系，以期更好地管控和減少疾病的發(fā)生。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：張海萍負責(zé)收集資料分析并撰寫論文；閆惠平負責(zé)寫作設(shè)計、思路指導(dǎo)及論文修改并最后定稿；陳德喜和馬迎民負責(zé)論文審閱。