基于系統(tǒng)生物學(xué)比較溫病“辛涼三劑”方證的病理機(jī)制差異*

胡莉，白辰，劉邵陽(yáng)，龍超君，于河，谷曉紅，劉鐵鋼

北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 北京 100029

吳瑭·《溫病條辨》中分別稱桑菊飲、銀翹散、白虎湯為辛凉輕劑、辛凉平劑、辛凉重劑，其依據(jù)三方透邪外達(dá)力度而有輕、中、重程度之分。桑菊飲和銀翹散皆是辛凉解表之劑，白虎湯為清氣分熱的處方。但在透邪外達(dá)的作用上三者是一致的。用于衛(wèi)分證的桑菊飲解表之力稍弱，主要為清肅肺氣、宣肺止咳，故稱辛凉輕劑；銀翹散辛透凉泄，透泄力介于桑菊飲和白虎湯之間，故稱辛凉平劑?！稖夭l辨》言：“白虎本為達(dá)熱出表”，又稱：邪重，非其力不舉?？梢姲谆感傲υ谌咧凶顝?qiáng)，因其辛透寒泄，大清氣分邪熱，故稱辛凉重劑。

辛凉輕劑桑菊飲證表征為咳嗽，身熱不甚，口微渴；其證質(zhì)為肺失宣降，證治以宣肺為主。辛凉平劑銀翹散證表征為發(fā)熱，微惡風(fēng)寒，無(wú)汗或有汗不暢，頭痛口渴，咳嗽咽痛；其證質(zhì)為風(fēng)熱邪氣侵襲肺衛(wèi)、衛(wèi)外失司，證治以泄衛(wèi)為主。辛凉重劑白虎湯證表征主治壯熱面赤，煩渴引飲，汗出惡熱；其證質(zhì)為肺胃熱熾，證治以清熱生津?yàn)橹?。三個(gè)方證方藥組合雖各有側(cè)重，然皆輕清突出。臨床孰去孰從，權(quán)在靈活。

隨著基因、蛋白、代謝組技術(shù)的發(fā)展，系統(tǒng)生物學(xué)——在于研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、生物系統(tǒng)組成之間相互關(guān)系的結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)功能的一門新學(xué)科順勢(shì)而生。以構(gòu)建“表征（Symptoms）-基因（Targets/Genes）”網(wǎng)絡(luò)為方法，從改善或恢復(fù)生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度來(lái)認(rèn)識(shí)方證生物學(xué)機(jī)制的比較，對(duì)生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行整體分析[1]。本研究用系統(tǒng)生物學(xué)方法，構(gòu)建了“辛凉三劑”方證表征的“表征-基因-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)其進(jìn)行基于功能與通路分析，借以闡述“辛凉三劑”方證證治的作用機(jī)制及差異。

資料與方法

1 一般資料

第七版《方劑學(xué)》[2]記載：“桑菊飲主治癥狀：咳嗽，身熱不甚，口微渴，脈浮數(shù)。銀翹散主治癥狀：發(fā)熱，微惡風(fēng)寒，無(wú)汗或有汗不暢，頭痛口渴，咳嗽咽痛，舌尖紅，苔薄白或薄黃，脈浮數(shù)。白虎湯主治癥狀：壯熱面赤，煩渴引飲，汗出惡熱，脈洪大有力?！?/p>

2 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件

中藥靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)SymMap[3]（http://www.symmap.org），HPO數(shù)據(jù)庫(kù)[4]（https://hpo.jax.org/、PolySearch2文獻(xiàn)挖掘工具[5]（http://polysearch.cs.ualberta.ca/），蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)String[6]（https://string-db.org/），基因注釋和分析資源Metascape[7]（http://metascape.org）。網(wǎng)絡(luò)可視化工具 Cytoscape 3.7.2[8]。

3 “辛涼三劑”方證表征相關(guān)靶標(biāo)基因獲取

本研究采用數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與文獻(xiàn)挖掘兩種方式結(jié)合獲得“辛凉三劑”方證表征的相關(guān)靶標(biāo)基因。利用SymMap數(shù)據(jù)庫(kù)、HPO數(shù)據(jù)庫(kù)、PolySearch2文獻(xiàn)挖掘工具，以桑菊飲證的“咳嗽”、“身熱不甚”、“口微渴”；銀翹散證的“發(fā)熱”、“微惡風(fēng)寒”“無(wú)汗”、“頭痛”、“口渴”等；白虎湯證的“壯熱”、“面赤”、“大渴”、“大汗”等關(guān)鍵詞檢索“辛凉三劑”方證表征相關(guān)靶標(biāo)基因后取其并集，去除重復(fù)基因及Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)[9]（http://www.uniprot.org/）中未經(jīng)注釋的或不屬于人類的靶點(diǎn)，得到“辛凉三劑”方證表征對(duì)應(yīng)的SymMap terms和HPO terms條目。并利用OmicShare[10]網(wǎng)站（http://www.omicshare.com/），把“辛凉三劑”方證表征靶標(biāo)之間關(guān)系以韋恩圖展示。

4 靶點(diǎn)蛋白的生物功能分析

以String 數(shù)據(jù)庫(kù)作為背景網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，分別將桑菊飲證、銀翹散證、白虎湯證的靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入，選擇研究物種為“Homo sapiens”，以0.95作為最低交互得分，以數(shù)據(jù)庫(kù)、實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)挖掘?yàn)榫W(wǎng)絡(luò)交互來(lái)源，構(gòu)建“辛凉三劑”方證表征的有效靶點(diǎn)互作（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，保存為TSV格式文件。

5 網(wǎng)絡(luò)可視化與核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了使網(wǎng)絡(luò)關(guān)系更為直觀，本研究應(yīng)用 String 數(shù)據(jù)庫(kù)以TSV文件保存的結(jié)果在軟件 Cytoscape 3.7.2上構(gòu)建“表征-基因”可視化網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)Degree值（連接度）調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)的大小、顏色，以更直觀地呈現(xiàn)靶標(biāo)之間的相互作用關(guān)系；并利用其MCODE拓展功能篩選核心網(wǎng)絡(luò)，選擇MCODE SCORE前三的核心網(wǎng)絡(luò)，并記錄其Node和Edge值。

6 基因功能和通路富集分析

利用MetaScape平臺(tái)，從“辛凉三劑”方證的“表征-基因”網(wǎng)絡(luò)中選取MCODE 得分最高的第一聚類相關(guān)基因進(jìn)行分析，將預(yù)測(cè)靶標(biāo)基因上傳至David數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/），進(jìn)行GO富集分析[選擇生物過程，分子功能和細(xì)胞組成3個(gè)模塊]和KEGG通路分析。利用 Cytoscape 的 MCODE 功能篩選基因功能和通路的核心網(wǎng)絡(luò)，篩選出Pvalue<0.001的通路，并根據(jù)其上富集的基因數(shù)進(jìn)行降序排列，選取排名前20的通路，使用OmicShare網(wǎng)站（http://www.omicshare.com/）將結(jié)果以高級(jí)氣泡圖的形式展現(xiàn)。

結(jié) 果

1 相關(guān)基因檢索

針對(duì)桑菊飲證、銀翹散證、白虎湯證三個(gè)方證的表征，在中藥靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)SymMap、HPO數(shù)據(jù)庫(kù)上手動(dòng)檢索了盡可能多的terms。例如，對(duì)于癥狀“發(fā)熱”，在中藥靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)SymMap中通過“發(fā)熱”進(jìn)行檢索；通過關(guān)鍵字和其他同義詞（例如“Recurrent fever”）搜索了HPO數(shù)據(jù)庫(kù)，并找到了三個(gè)具有相似含義的HPO術(shù) 語(yǔ)：“Fever”（HP:0001945），Recurrentfever（HP:0001954），Unexplainedfevers（HP:0001955），Periodic fever（HP:0032323）。如表1-3所示，大多數(shù)表征有幾個(gè)對(duì)應(yīng)的SymMap terms和HPO terms，而一些“有汗不暢”“身熱不甚”“惡熱”等表征未包括在數(shù)據(jù)庫(kù)中。

表1 桑菊飲證表征的相應(yīng)terms

2 “辛涼三劑”方證靶標(biāo)預(yù)測(cè)

經(jīng)檢索桑菊飲證、銀翹散證、白虎湯證三個(gè)方證的表征，獲得Genes列表，并將桑菊飲證、銀翹散證、白虎湯證三個(gè)方證表征的相關(guān)靶標(biāo)基因取其并集，去除重復(fù)基因及Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中未經(jīng)注釋的或不屬于人類的靶點(diǎn)。得到桑菊飲證表征涉及蛋白靶點(diǎn)244個(gè)，銀翹散證表征涉及蛋白靶點(diǎn)410個(gè)，白虎湯證表征涉及蛋白靶點(diǎn)172個(gè)。桑菊飲證、銀翹散證、白虎湯證表征的靶標(biāo)基因的相互關(guān)系見圖1。

圖1 三方證映射靶標(biāo)韋恩圖

表2 銀翹散證表征的相應(yīng)terms

表3 白虎湯證表征的相應(yīng)terms

Y1代表銀翹散證，y2代表桑菊飲證，y3代表白虎湯證?！靶笼澣齽狈阶C表征共有的靶標(biāo)基因有8個(gè)；銀翹散證和桑菊飲證表征中共有而白虎湯證中沒有的靶標(biāo)基因有235個(gè)，銀翹散證和白虎湯證表征中共有而桑菊飲證中沒有的靶標(biāo)基因有26個(gè)，桑菊飲證和白虎湯證表征中共有而銀翹散證中沒有的靶標(biāo)基因?yàn)?個(gè)；桑菊飲證表征中有而白虎湯證和銀翹散證中都沒有的靶標(biāo)基因有1個(gè)，銀翹散證表征中有而桑菊飲證和白虎湯證中都沒有的靶標(biāo)基因有140個(gè)，白虎湯證表征中有而銀翹散證和桑菊飲證中都沒有的靶標(biāo)基因有138個(gè)。

3 基因間互作關(guān)系分析

利用String 數(shù)據(jù)庫(kù)及Cytoscape網(wǎng)絡(luò)可視化工具構(gòu)建“表征-基因”網(wǎng)絡(luò)，得到桑菊飲證表征基因間互作關(guān)系28個(gè)，銀翹散證表征基因間互作關(guān)系42個(gè)，白虎湯證表征基因間互作關(guān)系19個(gè)。利用Cytoscape將“表征-基因”網(wǎng)絡(luò)可視化并使用MCODE工具獲得該網(wǎng)絡(luò)的核心部分，各個(gè)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的大小由其連接度（相鄰網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的數(shù)目）決定：節(jié)點(diǎn)越大尺寸越大則該節(jié)點(diǎn)連接度越高，具體見圖2-5。

4 方證通路GO富集結(jié)果

對(duì)三個(gè)方證的基因分別進(jìn)行基因富集分析后，桑菊飲證獲得GO生物進(jìn)程168個(gè)；銀翹散證獲得GO生物進(jìn)程288個(gè)；白虎湯證獲得GO生物進(jìn)程71個(gè)。三個(gè)方證涉及的生物學(xué)進(jìn)程結(jié)構(gòu)和相互關(guān)系基本相似，在GO生物進(jìn)程可映射的基因上存在差異。桑菊飲證映射了27個(gè)基因、桑菊飲證映射了40個(gè)基因、桑菊飲證映射了19個(gè)基因。桑菊飲證和銀翹散證共有的基因有26個(gè)，為TNF、CCL2、CCR1、HP、IL10、BTK、ERCC5、ERCC3、HBB、ERCC4、BLNK、ERCC2、IL6、NCF2、NCF1、NCF4、HBA2、HBA1、STAT3、XPA、CYBA、CYBB、XPC、DDB2、CD79B、CD79A；銀翹散證和白虎湯證共有基因3個(gè)，為EDARADD、EDAR、EDA；桑菊飲證和白虎湯證無(wú)共有基因；桑菊飲證獨(dú)有的基因?yàn)镃XCL8；銀翹散證獨(dú)有的基因?yàn)镃HEK2、ERCC8、APP、APOA1、APOE、IL1B、THPO、TP53、BRCA2、JAK2、MPL；白虎湯證獨(dú)有的基因?yàn)镠SP90AB1、ORAI1、HSP90AA1、STIM1、HSPA1B、ITPR2、TMEM67、HSPA1L、HSPH1、NPHP4、HSPA2、HSF1、HSPA4、DNAJB1、HSPA9、NPHP1。桑菊飲證、銀翹散證、白虎湯證在GO 生物過程經(jīng) MCODE 篩選后得到核心條目分別為18條、9條、7條。具體分析結(jié)果見圖6。

5 方證通路KEGG富集結(jié)果

經(jīng)富集分析后，桑菊飲證獲得KEGG通路86個(gè)；銀翹散證獲得KEGG通路108個(gè)；白虎湯證獲得KEGG通路50個(gè)。三個(gè)方證共同涉及的信號(hào)通路18個(gè)；桑菊飲證和銀翹散證共有的信號(hào)通路有65個(gè)；銀翹散證和白虎湯證共有的信號(hào)通路有4個(gè)；桑菊飲證和白虎湯證無(wú)共有的信號(hào)通路；桑菊飲證獨(dú)有的信號(hào)通路有3個(gè)；銀翹散證獨(dú)有的信號(hào)通路有21個(gè)；白虎湯證獨(dú)有的信號(hào)通路有28個(gè)。

為了更加系統(tǒng)地分析目標(biāo)靶點(diǎn)的生物學(xué)功能，我們運(yùn)用KEGG的PATHWAY數(shù)據(jù)庫(kù)部分對(duì)目標(biāo)靶點(diǎn)進(jìn)行PATHWAY通路分析。得到桑菊飲證相關(guān)通路52條（P-Value<0.01），銀翹散證相關(guān)通路46條（P-Value<0.01），白虎湯證相關(guān)通路18條（PValue<0.01）。通過OmicShare平臺(tái)將分析結(jié)果轉(zhuǎn)化為高級(jí)氣泡圖（見圖7-9）。

圖3 銀翹散證的“表征（Symptoms）-基因（Targets/Genes）”網(wǎng)絡(luò)及核心模塊

圖4 白虎湯證的“表征（Symptoms）-基因（Targets/Genes）”網(wǎng)絡(luò)及核心模塊

圖5 “辛涼三劑”方證表征（Symptoms）的基因（Targets/Genes）網(wǎng)絡(luò)

圖7 桑菊飲證靶標(biāo)的KEGG通路富集分析

在P-Value<0.01的桑菊飲證、銀翹散證、白虎湯證的富集通路分別有52條、46條、18條，其相互之間的關(guān)系如圖10。圖中所示，“辛凉三劑”方證表征共有的富集通路有5條，以NOD樣受體信號(hào)通路（NOD-like receptor signaling pathway）為主；銀翹散證和桑菊飲證表征中共有而白虎湯證中沒有的富集通路有36條，以細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）、趨化因子信號(hào)通路（Chemokine signaling pathway）、B細(xì)胞受體信號(hào)通路（B cell receptor signaling pathway）、NF-κB信號(hào)通路（NF-kappa B signaling pathway）、HIF-1信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、Toll樣受體信號(hào)通路（Toll-like receptor signaling pathway）、TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway）為主；銀翹散證和白虎湯證表征中共有而桑菊飲證中沒有的富集通路為0條；桑菊飲證和白虎湯證表征中共有而銀翹散證中沒有的富集通路為1條，是EB病毒感染（Epstein-Barr virus infection）可能相關(guān)性疾??；桑菊飲證表征中有而白虎湯證和銀翹散證中都沒有的富集通路有10條，以T細(xì)胞受體信號(hào)通路（T cell receptor signaling pathway）為主；銀翹散證表征中有而桑菊飲證和白虎湯證中都沒有的富集通路有5條，以Jak-STAT信號(hào)通路（Jak-STAT signaling pathway）為主；白虎湯證表征中有而銀翹散證和桑菊飲證中都沒有的富集通路有12條，以MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、鈣信號(hào)通路（Calcium signaling pathway）為主。

圖8 銀翹散證靶標(biāo)的KEGG通路富集分析

圖9 白虎湯證靶標(biāo)的KEGG通路富集分析

圖10 P<0.01的辛涼三劑方證的富集通路

討 論

辛凉三劑方證均為外感風(fēng)熱病邪侵犯人體后不同的病變階段，故本篇旨在通過構(gòu)建“辛凉三劑”方證表征-基因-通路網(wǎng)絡(luò)，探討溫病“辛凉三劑”方證的病理機(jī)制差異?！稖?zé)嵴摗分小皽匦吧鲜埽紫确阜巍敝赋?，由于肺主氣屬衛(wèi)，與皮毛相合，衛(wèi)氣敷布于皮毛，故風(fēng)溫病邪外侵，肺衛(wèi)首先受其影響，衛(wèi)氣閉郁，肺氣失宣，故有發(fā)熱微惡寒，咳嗽等表現(xiàn)。肺衛(wèi)之邪感邪不甚，經(jīng)及時(shí)治療后可獲痊愈。若感邪較重，或肺衛(wèi)之邪不解，則其可發(fā)為胃與心包的傳變邪熱在肺衛(wèi)不解，由衛(wèi)入氣，則順傳于胃，多呈陽(yáng)明熱熾的病理表現(xiàn)：壯熱、汗出、口渴、苔黃燥、脈洪大等。此即“辛凉三劑”方證在風(fēng)熱病邪侵犯人體后由外及內(nèi)、順傳逆?zhèn)鞯膫髯兡Ｊ胶筒∑谔卣鳌?/p>

桑菊飲證屬風(fēng)熱病邪侵襲肺衛(wèi)，病位主要在肺，肺主氣屬衛(wèi)，鼻氣通于肺，衛(wèi)氣被郁，肺氣失于宣暢，表現(xiàn)以咳嗽為主要癥狀。病勢(shì)表現(xiàn)為正盛邪微，故身熱不甚；病變初起津傷不甚則口微渴。銀翹散證與桑菊飲證同屬于衛(wèi)分階段，邪犯肺衛(wèi)，以衛(wèi)氣閉郁為主要病機(jī)變化，病勢(shì)上正邪相爭(zhēng)故見發(fā)熱。衛(wèi)氣閉郁，開合失常則見無(wú)汗或有汗不暢；頭為諸陽(yáng)之會(huì)，衛(wèi)氣郁阻，經(jīng)氣不利而見頭痛；其與桑菊飲證病變同處于初期階段津傷不甚而口渴。白虎湯證的病變部位則是病邪加重由衛(wèi)分傳變?nèi)霘夥?，臟腑病變部位在胃，病勢(shì)上正邪劇爭(zhēng)、里熱蒸迫而見壯熱惡熱，熱勢(shì)較前兩者加重；且熱盛于里迫津外泄而見大汗不已，熱盛傷津則燥渴引飲，其津傷程度較前兩者甚。

發(fā)熱是生物體在進(jìn)化上高度保守的應(yīng)對(duì)感染和損傷的防御機(jī)制，可以有效地激活免疫系統(tǒng)來(lái)清除病原體從而維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)[11]。如圖11所示“辛凉三劑”方證的信號(hào)通路的異同，“辛凉三劑”方證共有NOD樣受體信號(hào)通路引發(fā)炎癥發(fā)生的發(fā)熱機(jī)制有目共睹，其中NOD1和NOD2在參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中至關(guān)重要[12]。桑菊飲證與銀翹散證的共有信號(hào)通路中的Toll樣受體信號(hào)通路、NF-kB信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路與Jak-STAT信號(hào)通路均為免疫與炎癥相關(guān)信號(hào)通路，可以通過免疫炎癥反應(yīng)引起機(jī)體發(fā)熱。病原微生物等外致熱源入侵機(jī)體后，引發(fā)機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)的模式識(shí)別受體則為Toll樣受體（TLRs）[13]，細(xì)胞漿 Toll/IL-1 受體（TIR）的結(jié)構(gòu)域會(huì)激活TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[14]，該結(jié)構(gòu)域與TIR結(jié)構(gòu)域包含的接頭蛋白MyD88發(fā)生相互作用[15]。由Toll樣受體信號(hào)通路在中游激活NF-kB信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路后可在下游表達(dá)出發(fā)揮促炎作用的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和發(fā)揮趨化作用的IL-8、RANTES、MIP-1α、MIP-1β等炎性細(xì)胞因子[16-18]。IL-1β能夠影響適應(yīng)性免疫反應(yīng)和先天性免疫反應(yīng)，影響T細(xì)胞的成熟和B細(xì)胞的增殖，此外還能促進(jìn)炎癥分子（例如一氧化氮、磷脂酶A2、環(huán)氧合酶-2和前列腺素E2）的表達(dá)[19]。TNF-α是由單核吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的多肽，是急性感染性疾病的炎癥過程和臨床表現(xiàn)的重要介質(zhì)[20]。同時(shí)，在接觸外致熱源如肽聚糖的刺激后在Toll樣受體信號(hào)通路中可形成TLR1和TLR2的復(fù)合體作用于Rac1，后激活P13K-Akt信號(hào)通路，Akt可間接作用于NF-kB/Rel復(fù)合體而發(fā)生后續(xù)的反應(yīng)。T細(xì)胞信號(hào)通路也可促進(jìn)IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、GMCSF、TNF-α、CDK4的細(xì)胞因子的表達(dá)，B細(xì)胞信號(hào)通路可促進(jìn)細(xì)胞因子參與自身的免疫。

圖11 “辛涼三劑”方證主要通路機(jī)制的異同列舉（以KEGG通路編號(hào)形式展示）

由上，可發(fā)現(xiàn)辛凉三劑方證通過多通路誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)引起機(jī)體發(fā)熱的過程。咳嗽是由于氣管、支氣管黏膜或胸膜受炎癥、異物、物理或化學(xué)性刺激引起，聲門關(guān)閉、呼吸肌收縮，肺內(nèi)壓升高，然后聲門張開，肺內(nèi)空氣噴射而出[21]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)咳嗽與炎癥因子TGF-β1的水平和α-SMA的表達(dá)有關(guān)[22-23]。桑菊驗(yàn)證的咳嗽表征的病理機(jī)制，是由屬于體內(nèi)固有免疫的模式識(shí)別受體的RIG-I樣受體介導(dǎo)的信號(hào)通路RIG-I受體信號(hào)通路，通過一系列的信號(hào)傳遞，最終激活核因子NF-kB及所介導(dǎo)的通路所致[24-26]。

銀翹散證和白虎湯證的共有通路MAPK信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，原癌基因c-JUN的末端激酶（JNK）是MAPK信號(hào)通路的另一亞類，一些促炎性因子如TNF-α、白細(xì)胞介素家族（IL1、IL6等）都可以激活JNK通路從而加劇炎癥反應(yīng)[27]。且通過激活白細(xì)胞介素受體，啟動(dòng)MAPK途徑，增加TNF-α、IL-6、IL-8等炎性因子的表達(dá)，發(fā)生局部炎性反應(yīng)，引起發(fā)熱[28]。故銀翹散證和白虎湯證相較桑菊飲證不具備的信號(hào)通路的誘導(dǎo)下熱勢(shì)更重。且白虎湯證獨(dú)有通路中鈣離子通路又發(fā)揮了獨(dú)特的作用。細(xì)胞中突觸特異性建立的基礎(chǔ)則是鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)單個(gè)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與功能適應(yīng)的指導(dǎo)[29]。鈣離子在細(xì)胞內(nèi)的分布具有明顯的區(qū)域特征，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)血清和腦脊液中發(fā)熱介質(zhì)Na+/Ca2+比值的變化與發(fā)熱有關(guān)，當(dāng)中樞內(nèi)固有Na+/Ca2+比值發(fā)生改變，即Ca2+外流時(shí)比值升高，則體溫升高[30]。且Ca2+是多種細(xì)胞功能的普遍調(diào)節(jié)因子，鈣離子通路的激活誘導(dǎo)Ca2+的釋放，胞漿Ca2+的增加通過鈣離子結(jié)合引起的肌鈣蛋白-肌球蛋白復(fù)合體的構(gòu)象變化引起收縮[31]，進(jìn)而促進(jìn)胃腸道平滑肌收縮使產(chǎn)熱增加。Ca2+也是心肌細(xì)胞中興奮-收縮耦合的核心元素[32]，增強(qiáng)心肌收縮、心臟作功增加。Ca2+作用于骨骼肌、胃腸道平滑肌、心肌等細(xì)胞引起產(chǎn)熱增加時(shí)，交感神經(jīng)興奮可以增強(qiáng)Ca2+濃度[33]，是否可以做出Ca2+濃度的增強(qiáng)也可以引起交感神經(jīng)的興奮、進(jìn)而促進(jìn)汗腺分泌功能加強(qiáng)引起大汗出的假設(shè)。

綜上，本研究根據(jù)“辛凉三劑”方證在風(fēng)熱病邪侵襲人體后由外及內(nèi)并在人體內(nèi)順傳的不同病期的病變機(jī)制。風(fēng)熱犯肺證（桑菊飲證）的咳嗽與與炎癥因子TGF-β1的水平和α-SMA的表達(dá)有關(guān)。風(fēng)熱襲衛(wèi)證（銀翹散證）的發(fā)熱則在共有通路基礎(chǔ)上由MAPK信號(hào)通路加劇炎癥反應(yīng)至發(fā)熱較前者甚。肺胃熱盛證（白虎湯證）的熱盛、汗出傷津則與鈣離子通路與多重直接聯(lián)系。目前，將生物信息學(xué)分析應(yīng)用于中醫(yī)藥研究的技術(shù)已日臻成熟，下一步擬基于該結(jié)果開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以大鼠溫?zé)崮Ｐ蜑檠芯繉?duì)象，發(fā)揮桑菊飲證、銀翹散證、白虎湯證的生物學(xué)作用，進(jìn)而研究三方證對(duì)呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的影響，以期為系統(tǒng)生物學(xué)結(jié)果的科學(xué)準(zhǔn)確性提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。