益心巴迪然吉布亞顆粒中5種有效成分的含量測定方法及其指紋圖譜研究

李紅紅　帕依曼·亥米提　王新春　何承輝

中圖分類號 R917;R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）07-0808-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.07.07

摘 要 目的 建立益心巴迪然吉布亞顆粒中5種有效成分的含量測定方法及其指紋圖譜。方法 采用高效液相色譜法測定10批（編號S1～S10）益心巴迪然吉布亞顆粒中木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（LG）、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷（APG）、迷迭香酸（RA）、香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（DG）、田薊苷（TL）的含量。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）》繪制10批益心巴迪然吉布亞顆粒的指紋圖譜，并進行相似度評價和聚類分析。結果 10批益心巴迪然吉布亞顆粒中LG、APG、RA、DG、TL的含量分別為0.279 5～0.449 9、0.082 4～0.135 3、0.184 8～0.472 1、0.149 0～0.332 6、0.311 2～0.623 3 mg/g;其指紋圖譜中共有13個共有峰，指認出2號峰為LG、6號峰為APG、7號峰為RA、8號峰為DG、11號峰為TL，相似度為0.598～0.990。進一步聚類分析發(fā)現(xiàn)，S6～S10可聚為一類，S1～S5可聚為一類。結論 本研究建立的含量測定方法和指紋圖譜，可用于益心巴迪然吉布亞顆粒的質量控制。

關鍵詞 益心巴迪然吉布亞顆粒;高效液相色譜法;含量測定;指紋圖譜;質量控制

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To establish the method for the content determination of 5 active components in Yixin badiran jibuya granules and their fingerprints. METHODS High performance liquid chromatography method was adopted to determine the contents of luteolin-7-O-β-D-glucuronide （LG）， apigenin-7-O-glucuronide（APG）， rosmarinic acid（RA）， diosmetin-7-O-β-D-glucuronide （DG） and tilianin （TL） in 10 batches （No. S1-S10） of Yixin badiran jibuya granules. The fingerprints of 10 batches of Yixin badiran jibuya granules were drawn by Similarity Evaluation System of Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese Medicine （2004 A edition）， and similarity evaluation and cluster analysis were also performed. RESULTS The contents of LG， APG， RA， DG and TL in 10 batches of Yixin badiran jibuya granules were 0.279 5-0.449 9， 0.082 4-0.135 3， 0.184 8-0.472 1， 0.149 0-0.332 6， 0.311 2-0.623 3 mg/g， respectively. A total of 13 common peaks were demarcated in the fingerprints and were identified as LG （peak 2） APG （peak 6）， RA （peak 7）， DG （peak 8）， TL （peak 11）. The similarity ranged from 0.598 to 0.990. The results of cluster analysis showed that S6-S10 were clustered into one category and S1-S5 were clustered into one category. CONCLUSIONS Established method for content determination and fingerprints can be used for the quality control for Yixin badiran jibuya granules.

KEYWORDS? ?Yixin badiran jibuya granules; high performance liquid chromatography; content determination; fingerprint; quality control

經典維吾爾醫(yī)處方益心巴迪然吉布亞收載于古典醫(yī)籍《阿里卡農》中至今已有800年歷史，由于其臨床療效確切，后以顆粒劑形式被1999年版《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·維吾爾藥分冊》收載[1]。益心巴迪然吉布亞顆粒由香青蘭Dracocephalum Moldavica L.藥材組成，具有活血化瘀、補益心腦、利尿止咳、止痛解毒、通路開竅等功效[2-3]。經筆者前期調查發(fā)現(xiàn)，國內共有5家制藥企業(yè)生產上市該制劑，生產過程中投料藥材為香青蘭地上部分?！吨腥A人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·維吾爾藥分冊》中益心巴迪然吉布亞顆粒僅納入了以香青蘭對照藥材為對照的薄層色譜（TLC）法，而未有含量測定項，再加上香青蘭藥材具有復雜的化學成分，僅用TLC 法很難反映整個顆粒劑的質量優(yōu)劣。目前，對該顆粒劑的質量控制仍處于相對匱乏的狀態(tài)，其指紋圖譜研究也未見文獻報道，結合2020年版《中國藥典》，多數(shù)中藥成方制劑均增加了指紋圖譜研究，因此，對益心巴迪然吉布亞顆粒進行含量測定及指紋圖譜研究是非常必要的。

香青蘭D. Moldavica L.為唇形科一年生草本，藥用全草為地上干燥部分。研究表明，香青蘭中的主要活性成分為黃酮類化合物[4-6]，具有擴張冠脈、降低冠脈血管阻力的功能，如木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（luteolin-7-O-β-D-glucuronide，LG）、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷（apigenin-7-O-glucuronide，APG）、香葉木素-7- O-β-D-葡萄糖醛酸苷（diosmetin-7-O-β-D-glucuronide，DG）、田薊苷（tilianin，TL）等[7-10];苯丙素類化合物也是香青蘭中的一類有效成分，具有抗血栓、抗炎、抗菌、抗病毒等功能，如迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）等[11-13]?；诖?，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法測定益心巴迪然吉布亞顆粒中5種有效成分LG、APG、RA、DG、TL的含量，建立10批該顆粒劑的指紋圖譜，并進行聚類分析，以期較為全面地反映該制劑的整體特點，為其質量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1260型HPLC儀（美國 Agilent 公司）、AB135-S型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、WP-UP-WF-20型超純水機（四川沃特爾水處理設備有限公司）、KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

LG對照品（批號111968-201602，質量分數(shù)97.7%）、RA對照品（批號111871-202007，質量分數(shù)98.1%）均購自中國食品藥品檢定研究院;TL對照品（批號E-1170- 20102223，質量分數(shù)≥98.0%）、APG對照品（批號E- 2352-20121721，質量分數(shù)≥98.0%）均購自上海同田生物技術有限公司;DG對照品（批號90954，質量分數(shù)98.3%）購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司;乙腈為色譜純;甲醇、甲酸為分析純;水為超純水。10批益心巴迪然吉布亞顆粒（編號S1～S10）均購自新疆維吾爾藥業(yè)有限責任公司，批號分別為180338、180339、180533、180534、180608、190211、190439、190347、190552、190627。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Shim-Pack ODS（250 mm×4.6 mm，5 ?m）;流動相為乙腈（A）-0.5%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～23 min，10%A;23～59 min，12%A→26%A;59～70 min，8%A;70～100 min，27%A）;流速為1.0 mL/min;檢測波長為330 nm;柱溫為35 ℃;進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取LG、APG、DG對照品適量，用75%甲醇制成上述成分質量濃度分別為0.592、0.503、0.485? mg/mL的對照品溶液。精密稱取RA對照品適量，用甲醇制成質量濃度為0.595 mg/mL的對照品溶液。精密稱取TL對照品適量，用70%乙醇制成質量濃度為0.192 mg/mL的對照品溶液。精密吸取上述各成分的對照品溶液1.0、0.2、1.0、2.0、5.0 mL，置于同一10 mL量瓶中，以甲醇定容，即得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取益心巴迪然吉布亞顆粒適量，研細，取粉末約1.0 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，超聲（功率100 W，頻率40 kHz）處理30 min;放冷，用70%甲醇定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 益心巴迪然吉布亞顆粒中5種有效成分的含量測定

2.4.1 專屬性考察 取“2.2”“2.3”項下混合對照品溶液、供試品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。結果顯示，益心巴迪然吉布亞顆粒中LG、APG、RA、DG、TL的保留時間分別為45.48、52.76、54.23、55.88、81.20 min，各色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5。結果見圖1。

2.4.2 線性關系考察 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成系列溶液。取該系列溶液和混合對照品溶液（母液）適量，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。以各成分質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸，得5種有效成分的回歸方程與線性范圍，具體見表1。

2.4.3 精密度考察 取“2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄各成分峰面積，計算RSD值。結果顯示，益心巴迪然吉布亞顆粒中LG、APG、RA、DG、TL峰面積的RSD分別為0.83%、1.04%、0.72%、0.67%、0.70%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 精密稱取益心巴迪然吉布亞顆粒（編號S10）1份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h后，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并采用外標法計算含量。結果顯示，益心巴迪然吉布亞顆粒中LG、APG、RA、DG、TL含量的RSD分別為0.68%、2.20%、1.67%、2.11%、0.62%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復性考察 精密稱取益心巴迪然吉布亞顆粒（編號S10）6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并采用外標法計算含量。結果顯示，益心巴迪然吉布亞顆粒中LG、APG、RA、DG、TL含量的RSD分別為0.85%、1.02%、1.12%、1.64%、1.56%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率考察 精密稱取已知5種有效成分含量的益心巴迪然吉布亞顆粒（編號S10）6份，每份0.50 g，置于50 mL量瓶中;按各成分已知含量的100%加入相應對照品溶液，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，益心巴迪然吉布亞顆粒中LG、APG、RA、DG、TL的平均加樣回收率分別為100.53%、93.95%、96.79%、101.03%、91.36%，RSD分別為1.41%、2.48%、2.68%、2.00%、2.97%（n=6）。結果見表2。

2.4.7 樣品含量測定 取10 批益心巴迪然吉布亞顆粒（編號S1～S10）適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，每個批號平行處理2份，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并采用外標法計算含量。結果顯示，10批益心巴迪然吉布亞顆粒中LG、APG、RA、DG、TL的含量分別為0.279 5～0.449 9、0.082 4～0.135 3、0.184 8～ 0.472 1、0.149 0～0.332 6、0.311 2～0.623 3 mg/g。結果見表3。

2.5 益心巴迪然吉布亞顆粒指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 精密度試驗 精密稱取益心巴迪然吉布亞顆粒（編號S10）1份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，分別記錄各共有峰的保留時間和峰面積，以TL為參照峰（S）計算得各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.3%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.5%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 精密稱取益心巴迪然吉布亞顆粒（編號S10）1份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，于室溫放置0、2、4、8、12、24 h后，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，分別記錄各共有峰的保留時間和峰面積，以TL為參照峰（S）計算得各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.4%（n=6），相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復性試驗 精密稱取同一批益心巴迪然吉布亞顆粒（編號S10）6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，分別記錄各共有峰的保留時間和峰面積，以TL為參照峰（S）計算得各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.2%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.0%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.5.4 指紋圖譜建立及相似度評價 取10批益心巴迪然吉布亞顆粒適量，按“2.3” 項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，將數(shù)據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）》，采用中位數(shù)矢量法進行多點校正，設定時間窗寬度為0.60 min，生成10批益心巴迪然吉布亞顆粒的指紋圖譜，見圖2。結果顯示，10批益心巴迪然吉布亞顆粒共有13個共有峰，通過與混合對照品溶液比較，指認出2號峰為LG、6號峰為APG、7號峰為RA、8號峰為DG、11號峰為TL。進一步進行相似度評價發(fā)現(xiàn)，10批益心巴迪然吉布亞顆粒的相似度為0.598～0.990，說明該制劑各批次間存在一定差異。相似度評價結果見表4。

2.5.5 聚類分析 以10批益心巴迪然吉布亞顆粒指紋圖譜中5種有效成分的含量為評價指標，運用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件進行聚類分析，以組間連接為聚類方法，測量區(qū)間為平方歐氏距離，結果見圖3。結果顯示，10批益心巴迪然吉布亞顆粒在平方歐氏距離為10的條件下可聚為2類，其中S6～S10聚為一類，S1～S5聚為一類。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本研究前期考察了不同流動相（乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.5%甲酸溶液）、不同色譜柱（Agilent ZORBAX Extend-C18、Shim-Pack ODS）對有效成分色譜峰分離的影響，結果顯示，當流動相為乙腈-0.5%甲酸溶液、色譜柱為Shim-Pack ODS時，各成分色譜峰的分離效果和峰形較好。同時，在進行梯度洗脫時，筆者采用了反常規(guī)的方法，在59～70 min時將乙腈（A相）比例從26%降至8%，在70～100 min時又將其升高至27%，從而可以將TL色譜峰與旁邊的雜質峰完全分開。

3.2 有效成分選擇及指紋圖譜研究

益心巴迪然吉布亞顆粒是由香青蘭藥材組成的單方制劑，其質量標準中沒有含量測定項，故本研究選取該顆粒劑中含量較高的5種有效成分（LG、APG、RA、DG、TL）含量為指標，并結合指紋圖譜研究來評價其質量。結果顯示，10批益心巴迪然吉布亞顆粒的相似度為0.598～0.990，表明該制劑各批次間存在一定差異。進一步進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，S6～S10可聚為一類，相似度均大于0.8，且這幾種樣品中RA、DG、TL含量較低;S1～S5可聚為一類，相似度在0.598～0.976之間，且這幾批樣品中RA、DG、TL含量較高。由此可知，該制劑各批次間的差異可能與上述幾種成分的含量差異有關。這種差異的產生可能與香青蘭藥材產地、采收時期等有關;另外，該制劑生產過程中的藥材煎煮、濃縮、制粒等因素也可能會造成上述幾種成分差異。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，香青蘭藥材莖、葉中上述有效成分的含量差異較大，因此，制藥企業(yè)在生產該制劑時，應盡可能固定藥材的來源和投料比例，以期達到提高制劑穩(wěn)定性的目的。

綜上所述，本研究建立了益心巴迪然吉布亞顆粒中5種有效成分的含量測定方法及其指紋圖譜，可為該顆粒劑的質量控制提供依據。

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（收稿日期：2021-11-20 修回日期：2022-02-22）

（編輯：唐曉蓮）