彭紅 黃品哲 宋永貴 徐煥華 周明月 朱根華 楊明 艾志?!√K丹
中圖分類號(hào) R917;R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408(2022)07-0800-09
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.07.06
摘 要 目的 研究羊棲菜的化學(xué)成分組成及體外抗神經(jīng)炎癥活性,為其開發(fā)利用以及藥效物質(zhì)研究提供參考。方法 基于超高效液相飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UHPLC-QTOF-MS/MS)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS/MS)對(duì)羊棲菜中化學(xué)成分進(jìn)行全譜分析。利用脂多糖(1 μg/mL)建立小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2的炎癥模型,以帕羅西?。? μg/mL)為陽性對(duì)照藥物,通過CCK-8法檢測(cè)20、40、60、80、100 μg/mL羊棲菜提取物作用24 h后對(duì)細(xì)胞活性及形態(tài)的影響,通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)40、60、80 μg/mL羊棲菜提取物作用24 h后對(duì)細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)含量的影響。結(jié)果 經(jīng)UHPLC-QTOF-MS/MS分析共鑒定出103種非揮發(fā)性成分,經(jīng)GC-MS/MS分析共鑒定出60種揮發(fā)性成分。40、60、80 μg/mL羊棲菜提取物可顯著降低因脂多糖誘導(dǎo)而異常升高的BV2細(xì)胞活化程度和細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6的含量(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 本研究建立了海藻羊棲菜的化學(xué)成分全譜,并證實(shí)了羊棲菜具有一定的體外抗神經(jīng)炎癥活性。
關(guān)鍵詞 羊棲菜;全譜分析;揮發(fā)性成分;非揮發(fā)性成分;抗神經(jīng)炎癥活性
ABSTRACT? ?OBJECTIVE To study the composition of chemical constituents of Sargassum fusiforme and its in vitro anti- neuroinflammatory activity, and to provide reference for its development and utilization and the study of pharmacodynamic substances. METHODS UHPLC-QTOF-MS/MS analysis method and GC-MS/MS method were used to analyze the chemical constituents of S. fusiforme. The lipopolysaccharide (1 μg/mL) was adopted to establish the inflammatory model of neuromicroglia BV2. Using paroxetine (5 μg/mL) as positive control, CCK-8 assay was used to detect the effects of the extracts of S. fusiforme (20, 40, 60, 80, 100 μg/mL) on the activity and morphology of neuromicroglia BV2. The effects of the extracts of S. fusiforme (40, 60, 80 μg/mL) on the contents of tumor necrosis factor α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) in cell supernatant were detected by ELISA. RESULTS A total of 103 non-volatile constituents were identified by UHPLC-QTOF-MS/MS, and 60 volatile constituents were obtained by GC-MS/MS. The extracts of S. fusiforme (40, 60, 80 μg/mL) could significantly reduce the abnormally increased activation of neuromicroglia BV2 and the contents of TNF-α and IL-6 due to lipopolysaccharide (P<0.05 or P<0.01). CONCLUSIONS The study establish the full spectrum of chemical constituents of S. fusiforme, and it is confirmed that S. fusiforme has certain in vitro anti-neuroinflammatory activity.
KEYWORDS? ?Sargassum fusiforme; full spectrum analysis; volatile constituents; non-volatile constituents; anti- neuroinflammatory activity
羊棲菜Sargassum fusiforme (Harv.) Setch.是褐藻門馬尾藻科馬尾藻屬植物的干燥藻體,習(xí)稱“小葉海藻”,主要分布于遼寧、山東、福建、浙江、廣東等沿海地帶的溫暖水域[1],是我國(guó)一種較為常見且資源豐富的海藻。據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》(一部)記載,羊棲菜的形狀特點(diǎn)為分枝互生、無刺狀突起、藻體較小、葉條形或細(xì)匙形[2]。羊棲菜早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載,具有軟堅(jiān)散結(jié)、消痰利水之功效[3]。相關(guān)研究顯示,羊棲菜所含成分具有降血糖[4]、減輕動(dòng)脈粥樣硬化的作用[5],是一種極具研究前景的藥食兩用植物。
我國(guó)的海洋資源十分豐富,海洋藥物展現(xiàn)出了良好的開發(fā)前景[6-9]。但相比于傳統(tǒng)中藥,海洋藥物的總體研究開發(fā)以及質(zhì)量控制水平仍需加強(qiáng),《中國(guó)藥典》對(duì)包括羊棲菜在內(nèi)的海洋藥物主要是采用硫酸-蒽酮顯色法控制其多糖含量,相關(guān)研究也多集中在羊棲菜多糖的制備、分離、結(jié)構(gòu)確定及活性評(píng)價(jià)等方面[10-11],尚缺乏對(duì)羊棲菜相關(guān)功效涉及的潛在活性化合物(如黃酮類、香豆素類、生物堿類化學(xué)成分)的研究[12-13],忽視了羊棲菜所富含的小分子活性成分及其具備的潛在活性。
目前,已有報(bào)道采用化學(xué)分離的方法對(duì)羊棲菜乙酸乙酯、石油醚等萃取部位的成分進(jìn)行分析[14],但對(duì)羊棲菜所含成分的全面分析研究尚為空白。鑒于此,本研究采用超高效液相飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UHPLC- QTOF-MS/MS)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS/MS)獲得海藻羊棲菜的全譜分析數(shù)據(jù)庫(kù),完善對(duì)海藻羊棲菜多糖以外的小分子化合物的研究,并開展以細(xì)胞模型為基礎(chǔ)的羊棲菜體外抗神經(jīng)炎癥活性實(shí)驗(yàn),為其今后功效活性成分的研究、質(zhì)量控制方法的優(yōu)化以及后續(xù)活性化合物的開發(fā)提供參考。
1 材料
1.1 主要儀器
本研究所用的主要儀器有AB SCIEX Triple TOF 5600+型高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Sciex公司),LC-30A型超高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司),Agilent 7890A/5975C型GC-MS/MS儀(美國(guó)Agilent公司),MS105DU型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司),KQ-500B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司),DZTW型調(diào)溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司),64R型恒溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司),Varioskan LUX型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司),TS100型倒置顯微鏡(日本Nikon公司)。
1.2 主要藥品與試劑
海藻羊棲菜干燥藥材(批號(hào)19061309)購(gòu)自安國(guó)市一方藥業(yè)有限公司,經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)岐黃國(guó)醫(yī)書院吳蜀瑤中藥師鑒定為真品;7-羥基香豆素對(duì)照品(批號(hào)DSTDQ006601,純度≥98%)、川陳皮素對(duì)照品(批號(hào)DST00690120,純度≥98%)、濱蒿內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào)AF21052105,純度≥98%)、異貝殼杉烯酸對(duì)照品(批號(hào)DST210311-187,純度≥98%)均購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司;蛇床子素對(duì)照品(批號(hào)201601114,純度≥98%)、帕羅西汀對(duì)照品(批號(hào)2019021134,純度≥98%)均購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司;磷酸鹽緩沖液(PBS,批號(hào)20210506)、高糖DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)CellMax公司;胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胰酶購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司;青霉素-鏈霉素(批號(hào)191118164)購(gòu)自蘇州新賽美生物科技有限公司;CCK-8試劑(批號(hào)GK100011)購(gòu)自美國(guó)GlpBio公司;脂多糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;小鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin- 6,IL-6)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)試劑盒(批號(hào)分別為202107、202106)均購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司;甲醇、乙醇、甲酸、乙腈為色譜純,其余試劑均為分析純,水為去離子水。
1.3 細(xì)胞株
小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。
2 方法
2.1 羊棲菜化學(xué)成分分析
2.1.1 UHPLC-QTOF-MS/MS分析供試品溶液的制備 稱取1 g羊棲菜藥材粉末,加入10 mL 80%甲醇,超聲(功率280 W,頻率40 kHz)提取60 min,過濾,取續(xù)濾液置于10 mL量瓶中,以80%甲醇定容,即得。進(jìn)樣前,使用0.22 μm濾頭過濾。
2.1.2 GC-MS分析供試品溶液的制備 取剪碎的藥材500 g,置于10 000 mL圓底燒瓶中,加10倍量(5 000 mL)水,使用揮發(fā)油提取器提取8 h,收集所得揮發(fā)油,用精油小瓶封存。進(jìn)樣時(shí),取200 μL揮發(fā)油置于10 mL量瓶中,加無水乙醇定容,然后使用0.45 μm微孔濾膜過濾。
2.2 色譜與質(zhì)譜條件
2.2.1 UHPLC-QTOF-MS/MS分析條件 色譜條件如下:使用Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),以水(含0.1%甲酸,A相)-乙腈(含0.1%甲酸,B相)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫(0~15 mim,5%B→55%B;15~45 min,55%B→95%B;45~47 min,95% B;47~47.10 min,95%B→5%B);柱溫為40 ℃;流速為0.3 mL/min,進(jìn)樣量為3 μL。質(zhì)譜條件如下:使用正、負(fù)離子2種掃描模式,掃描范圍為m/z 50~1 550;電壓設(shè)置正、負(fù)值均為4 500 V,去簇電壓為100 V;電噴霧離子源(ESI)溫度為500 ℃;氣簾氣壓力為40 psi,霧化氣、輔助氣壓力均為50 psi;碰撞能量為(40±10) eV。
2.2.2 GC-MS分析條件 色譜條件如下:使用HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);采用程序升溫(初始溫度為60 ℃、保持2 min,以2 ℃/min升溫至80 ℃、保持2 min,以10 ℃/min升溫至120 ℃、保持5 min,以10 ℃/min升溫至160 ℃、保持5 min,以5 ℃/min升溫至280 ℃、保持10 min);載氣為氦氣,載氣流速為1.2 mL/min;進(jìn)樣量為2 μL,進(jìn)樣口溫度為260 ℃,分流比為20 ∶ 1;傳輸管線溫度為280 ℃。質(zhì)譜條件如下:電子轟擊離子源(EI)溫度為230 ℃,四極桿溫度為150 ℃,質(zhì)量掃描范圍為30~600 amu。
2.2.3 成分分析 利用Analyst TF 1.6、PeakView1.2 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)獲取UHPLC-QTOF-MS/MS分析化合物的保留時(shí)間、質(zhì)譜碎片信息等內(nèi)容,通過與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)匹配以及與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道、對(duì)照品比對(duì)進(jìn)行化合物鑒定。利用MSD ChemStation F.01.00.1903軟件獲取GC-MS/MS分析化合物的信息,并與NIST17數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行信息匹配,匹配度不低于90%[15]。
2.3 羊棲菜提取物的體外抗炎作用考察
2.3.1 提取物的制備 將羊棲菜干燥藻體剪碎后置于10 000 mL圓底燒瓶中,加入80%乙醇[料液比為1 ∶ 10(g/mL)]回流提取8 h,使用雙層紗布過濾,收集濾液;殘?jiān)?倍量(mL/g)80%乙醇回流提取1 h,使用雙層紗布過濾;混合2次所得提取液,旋蒸揮去乙醇,將剩余濃縮液冷凍干燥24 h,研磨后制成凍干粉,置于干燥器內(nèi)避光保存。給藥時(shí)取該提取物凍干粉用PBS溶解,然后過0.2 μm除菌濾膜。
2.3.2 BV2細(xì)胞的培養(yǎng) 將BV2細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清、1%雙抗(100 U/mL青霉素、100 ?g/mL鏈霉素)的高糖DMEM完全培養(yǎng)基中,將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代。本研究使用第6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2.3.3 BV2細(xì)胞活性測(cè)定 采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞,均勻接種在96孔板中(6×103個(gè)/孔),分為空白對(duì)照組、模型組(1 μg/mL脂多糖)、陽性藥物組(1 μg/mL脂多糖+5 μmol/L帕羅西汀,濃度根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置)、不同質(zhì)量濃度羊棲菜提取物組[1 μg/mL脂多糖+20(或40、60、80、100) μg/mL海藻羊棲菜提取物,濃度梯度均根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置],每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔;并設(shè)置空白孔進(jìn)行調(diào)零。將細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至60%貼壁后,加入相應(yīng)藥液或空白培養(yǎng)基干預(yù)24 h,然后每孔加入10 μL CCK-8溶液,孵育1.5 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度(OD),計(jì)算細(xì)胞的存活率=(給藥孔OD-空白孔OD)/(空白對(duì)照孔OD-空白孔OD)×100%;并使用顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行綜合分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
2.3.4 細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6含量的測(cè)定 采用ELISA法進(jìn)行測(cè)定。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞,均勻接種在96孔板中(6×103個(gè)/孔),分為空白對(duì)照組、陽性藥物組(1 μg/mL 脂多糖+5 μmol/L帕羅西汀)和不同質(zhì)量濃度羊棲菜提取物組[1 μg/mL脂多糖+20(或40、80) μg/mL羊棲菜提取物],每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞培養(yǎng)至60%貼壁左右時(shí),加入藥物干預(yù)24 h,然后取細(xì)胞上清液,按照試劑盒說明書操作,檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
使用Graphpad Prism 8.0.2軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示,多組間比較采用單因素方差分析;方差齊時(shí)組間兩兩比較用Tukey法,方差不齊時(shí)組間兩兩比較用Dunnetts T3法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
3 結(jié)果
3.1 UHPLC-QTOF-MS/MS分析結(jié)果
經(jīng)UHPLC-QTOF-MS/MS分析,從羊棲菜中共鑒定出103種非揮發(fā)性成分,包括有機(jī)酸類成分3種、生物堿類成分13種、萜類成分24種、黃酮類成分13種、醌類成分1種、糖苷類成分2種、維生素類成分5種、苯丙素類成分5種、香豆素類成分7種、木脂素類成分2種、氨基酸類成分8種、脂肪酸類成分1種,皂苷類成分3種、甾體類成分4種和其他類成分12種。結(jié)果見圖1、表1。
3.2 GC-MS檢測(cè)結(jié)果
經(jīng)GC-MS分析,初步鑒定出60種揮發(fā)性成分,包括烯類、烷類、酯類、酸類等,其中相對(duì)含量較高的有環(huán)十二烷、正十六烷、異植物醇、鄰苯二甲酸二丁酯、棕櫚酸、花生四烯酸、植物醇、植酮等。結(jié)果見圖2、表2。
3.3 BV2細(xì)胞活性考察結(jié)果
與空白對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞的存活率顯著升高(P<0.01),提示脂多糖對(duì)BV2細(xì)胞有刺激活化的作用。與模型組比較,陽性藥物組和羊棲菜提取物40、60、80、100 μg/mL組細(xì)胞的存活率均顯著降低(P<0.05或P<0.01),提示上述藥物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞活化均有一定抑制作用。結(jié)果見表3。
3.4 細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果
空白對(duì)照組細(xì)胞大多較圓潤(rùn),胞體直徑較小,未見形態(tài)較長(zhǎng)的細(xì)胞突觸生長(zhǎng)。模型組活化細(xì)胞的數(shù)量顯著增加,且胞體變肥大,細(xì)胞突觸變長(zhǎng)。陽性藥物組和不同質(zhì)量濃度羊棲菜提取物組細(xì)胞的胞體大多較圓潤(rùn),與模型組比較,各給藥組細(xì)胞的突觸增長(zhǎng)情況得到緩和、活化細(xì)胞數(shù)量減少。結(jié)果見圖3。
3.5 細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6含量測(cè)定結(jié)果
與空白對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,陽性藥物組和不同質(zhì)量濃度羊棲菜提取物組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6含量均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果見表4。
4 討論
物質(zhì)基礎(chǔ)研究是藥物開發(fā)和活性研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為了更加全面地提取、分析羊棲菜的化學(xué)成分,本課題組前期分別比較了不同極性溶劑(80%甲醇、乙酸乙酯、乙醇、水)、不同超聲提取時(shí)間(10、30、60、90 min)對(duì)樣品中非揮發(fā)性成分提取效果的影響。結(jié)果表明,當(dāng)溶劑為80%甲醇、提取時(shí)間為60 min時(shí),提取物中可以檢測(cè)到的化合物數(shù)量最多、各成分的相對(duì)含量更高。為使實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、高效,本研究選擇以80%甲醇為提取溶劑,采用超聲提取60 min的方式制備UHPLC-QTOF-MS/MS分析的樣品。此外,本課題組前期還比較了不同極性溶劑(三氯甲烷、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、無水乙醇)、不同提取方式(索氏提取法、水蒸氣蒸餾法)和不同提取時(shí)間(4、6、8 h)對(duì)樣品中揮發(fā)性成分提取效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)使用索氏提取法以石油醚為溶劑提取4 h時(shí),能檢測(cè)并鑒定出50種化合物;當(dāng)使用水蒸氣蒸餾法提取8 h時(shí),能檢測(cè)并鑒定出60種化合物。為了更加全面地分析羊棲菜成分,本研究選擇了以水蒸氣蒸餾法提取8 h的方式制備GC-MS/MS分析的樣品。
本研究首次使用UHPLC-QTOF-MS/MS結(jié)合GC- MS/MS進(jìn)行了羊棲菜的全成分分析。通過UHPLC- QTOF-MS/MS分析共鑒定出103種非揮發(fā)性成分,通過GC-MS/MS分析共鑒定出60種揮發(fā)性成分,完善了羊棲菜的全成分研究。有研究表明,7-羥基香豆素、補(bǔ)骨脂素、蛇床子素等香豆素類小分子化合物對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用[31-34]。尤其是蛇床子素,其對(duì)于阿爾茨海默病患者的神經(jīng)損傷具有一定保護(hù)作用[35]。海藻羊棲菜所含成分中包含以上多種小分子香豆素類化合物,故本課題組推測(cè),羊棲菜具有潛在的抗神經(jīng)炎癥作用。
IL-6可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化,臨床常通過監(jiān)測(cè)IL-6含量來評(píng)估炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度[36] 。TNF-α是一種重要的炎癥因子,在細(xì)胞增殖、分化和凋亡中扮演重要角色[37]。本研究建立體外脂多糖誘導(dǎo)BV2細(xì)胞炎癥模型,選取可調(diào)節(jié)經(jīng)典炎癥通路——絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活的帕羅西汀作為陽性藥物對(duì)照[38],來探索羊棲菜的抗神經(jīng)炎癥活性。結(jié)果顯示,脂多糖可激活BV2細(xì)胞,促進(jìn)炎癥因子IL-6、TNF-α的產(chǎn)生;經(jīng)羊棲菜提取物干預(yù)后,BV2細(xì)胞活性和細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6含量均顯著降低,表明羊棲菜提取物具有一定的抗神經(jīng)炎癥活性。
綜上所述,本研究建立的UHPLC-QTOF-MS/MS法與GC-MS/MS法可快速、有效地對(duì)羊棲菜中化學(xué)成分進(jìn)行全譜分析,為海藻羊棲菜的物質(zhì)基礎(chǔ)研究和質(zhì)量控制研究提供了理論依據(jù);羊棲菜提取物對(duì)BV2細(xì)胞具有較好的體外抗神經(jīng)炎癥作用,但是具體的作用機(jī)制仍不明確。本課題組后期將繼續(xù)開展羊棲菜抗神經(jīng)炎癥作用機(jī)制研究,期望在當(dāng)前的物質(zhì)基礎(chǔ)研究結(jié)果上進(jìn)一步探索其主要藥效活性成分及作用機(jī)制。
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(收稿日期:2021-12-09 修回日期:2022-03-07)
(編輯:林 靜)