益生菌對(duì)魚類黏膜免疫影響的研究進(jìn)展

■徐 晴 李若銘 王桂芹

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物 生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，現(xiàn)代 農(nóng)業(yè)技術(shù)教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，吉林省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118）

益生菌在人類和畜禽方面廣泛使用，大量研究表明，益生菌具有防治多種疾病的功效。益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用尚處于初級(jí)階段，相關(guān)的機(jī)制探索較為有限。黏膜免疫系統(tǒng)具有多種獨(dú)特的先天和適應(yīng)性免疫細(xì)胞和分子，在抵御有害物質(zhì)入侵時(shí)發(fā)揮重要作用。近些年，人們對(duì)魚類等水產(chǎn)動(dòng)物的黏膜免疫系統(tǒng)進(jìn)行了研究，表明了黏膜免疫作為主要防御系統(tǒng)的重要性。文章綜述了魚類的黏膜結(jié)構(gòu)及益生菌對(duì)魚類黏膜免疫系統(tǒng)影響的研究進(jìn)展，并對(duì)今后魚類的黏膜免疫和益生菌研究進(jìn)行了展望。

1 益生菌

1.1 益生菌的概念

益生菌是一類能在體內(nèi)存活，定植在腸道、生殖系統(tǒng)等對(duì)宿主有益的活性微生物，是能產(chǎn)生確切健康功效從而調(diào)節(jié)宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮對(duì)機(jī)體有益作用的活性有益微生物的總稱。益生菌用于調(diào)節(jié)機(jī)體微生態(tài)平衡，增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)有害微生物的抑制作用或通過影響非特異性及特異性免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)黏膜屏障及免疫平衡，抑制腸道炎癥，提高應(yīng)激抗病能力，同時(shí)能提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高動(dòng)物代謝能力等功能。

1.2 常見益生菌種類

益生菌種類繁多，2013年我國(guó)農(nóng)業(yè)部第105號(hào)公告《允許使用的飼料添加劑品種目錄》中公布了可用的微生物種類（見表1），規(guī)范了我國(guó)水產(chǎn)動(dòng)物益生菌的使用。根據(jù)益生菌的來源、使用目的、施用方式和施用魚種的不同，益生菌菌株的選擇多種多樣。益生菌種類主要有乳酸菌（Lactic acid bacteria）、芽孢桿菌（Bacillus）、酵母菌（Yeasts）和光合細(xì)菌（Photosynthetic Bacteria）等，為水產(chǎn)適用益生菌提供多種選擇。

表1 農(nóng)業(yè)部第105號(hào)公告公布飼料中允許添加的微生物種類

2 黏膜結(jié)構(gòu)

黏膜免疫系統(tǒng)（mucosal immune system，MIS）又稱黏膜相關(guān)淋巴組織（mucosa-associated lymphoid tissue，MALT），是指黏膜固有層和上皮細(xì)胞下散在的無包膜的淋巴組織，是適應(yīng)性免疫細(xì)胞產(chǎn)生和成熟的重要部位之一。存在于動(dòng)物胃腸道、口腔通道、鼻咽道、甲狀腺、乳腺、肺、唾液腺、眼睛和皮膚等黏膜部位，而水產(chǎn)動(dòng)物生活在水中，其黏膜免疫系統(tǒng)包括鰓相關(guān)淋巴組織（gill-associated lymphoid tissue，GIALT）、皮膚相關(guān)淋巴組織（skin-associated lymphoid tissue，SALT）和腸道相關(guān)淋巴組織（gut-associated lymphoid tissue，GALT）。在水產(chǎn)動(dòng)物黏膜器官中沒有發(fā)現(xiàn)Peyer氏淋巴結(jié)和扁桃體等有組織的淋巴結(jié)構(gòu)，但這些器官中存在彌漫的淋巴細(xì)胞。水產(chǎn)動(dòng)物黏膜中含有多種免疫細(xì)胞，且富含多種免疫相關(guān)因子（如凝集素、黏蛋白、抗菌肽及免疫球蛋白等），在非特異性免疫和特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。這些黏膜表面覆蓋具有保護(hù)性的免疫黏液層，使黏膜免疫系統(tǒng)在防御病原侵襲感染的第一道防線上發(fā)揮重要作用。

2.1 腸黏膜相關(guān)淋巴組織

GALT 是腸道免疫系統(tǒng)的統(tǒng)稱，是許多病原體的重要進(jìn)入口岸。在魚類的腸黏膜中富含免疫細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞（肥大細(xì)胞）和巨噬細(xì)胞。腸道黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞主要為參與細(xì)胞免疫的T細(xì)胞，使用幾種識(shí)別T細(xì)胞標(biāo)志物的抗體，在鯉（Cyprinus carpio）和黑鱸（Dicentrarchus labrax）的腸道上皮層中都檢測(cè)到了大量的T細(xì)胞。鯉后腸組織中，IgT+B 細(xì)胞在黏膜固有層和黏膜上皮細(xì)胞層都有分布，但在黏膜固有層中的出現(xiàn)較晚，而虹鱒（Oncorhyn?chus mykiss）IgM+和IgT+細(xì)胞在整個(gè)腸道內(nèi)均可檢測(cè)到。多聚免疫球蛋白受體pIgR 介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多聚免疫球蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)在黏膜免疫中發(fā)揮重要作用，在紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）中利用原位雜交技術(shù)檢測(cè)到pIgR 在腸上皮細(xì)胞中大量分布，鯉pIgR 主要位于腸上皮細(xì)胞和黏液細(xì)胞的細(xì)胞核附近，以及腸上皮和固有膜內(nèi)的淋巴樣細(xì)胞中。腸道中含有大量的免疫細(xì)胞證明了腸黏膜是機(jī)體黏膜免疫防御的主要部位。

2.2 皮膚黏膜相關(guān)淋巴組織

魚的皮膚由于缺乏角質(zhì)化而被覆蓋一層黏膜層，皮膚黏液是防止感染、干燥和接觸傷害的第一個(gè)物理、化學(xué)和生物屏障。皮膚或表皮層由上皮細(xì)胞、黏液細(xì)胞、棒狀細(xì)胞、杯狀細(xì)胞等大量的免疫活性細(xì)胞組成，這使得皮膚免疫防御變得復(fù)雜。T 細(xì)胞和B 細(xì)胞是機(jī)體免疫的主要參與者，利用T細(xì)胞和B細(xì)胞標(biāo)志物抗體的檢測(cè)表明，虹鱒和鯉的皮膚表皮中含有豐富的B細(xì)胞和T細(xì)胞。類樹突狀細(xì)胞已在虹鱒皮膚中被發(fā)現(xiàn)，其功能特征與哺乳動(dòng)物的樹突狀細(xì)胞亞群相似，均能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化和增殖。皮膚的B細(xì)胞免疫應(yīng)答與腸道十分相似，腸道黏膜免疫中的特殊免疫球蛋白IgT同樣在皮膚免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。羅非魚（Oreochromis niloticus）皮膚黏液中的IgT 由皮膚組織中IgT+B細(xì)胞分化產(chǎn)生的漿細(xì)胞分泌，并且經(jīng)過遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella Tarda）浸泡后皮膚中IgT表達(dá)上調(diào)，提示IgT 經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)至皮膚黏液并在羅非魚的黏膜免疫中起主導(dǎo)作用。

2.3 鰓黏膜相關(guān)淋巴組織

鰓是水生動(dòng)物的呼吸器官，是各種病原體入侵的重要部位，同時(shí)鰓上還覆蓋著黏液，通過含有巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞（肥大細(xì)胞）的黏膜相關(guān)淋巴組織參與免疫防御。在鰓細(xì)絲底部的鰓間隔處具有與哺乳動(dòng)物黏膜中描述的類似的淋巴細(xì)胞聚集體（T細(xì)胞），T細(xì)胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答是細(xì)胞免疫，說明鰓參與了機(jī)體的黏膜免疫防御。

3 益生菌對(duì)魚類黏膜免疫的影響

3.1 益生菌對(duì)GALT的影響

腸道是益生菌的主要靶器官，而益生菌能對(duì)腸道形態(tài)產(chǎn)生影響，因此，與益生菌有關(guān)的腸道免疫研究值得高度重視。Xia等（2018）在羅非魚飼料中添加鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）和乳酸乳桿菌（Lactococcus lactis）增加腸微絨毛長(zhǎng)度和密度，同樣Standen 等（2015）添加含有其他不同的多種益生菌飼喂羅非魚后，改善了羅非魚微絨毛密度和微絨毛長(zhǎng)度，增加腸道吸收表面積。Sewaka等（2019）研究還發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌和菊芋（Helianthus tuberosus）增加了紅羅非魚（red tilapia）腸道的絨毛高度和絨毛寬度，從而增加腸道吸收面積的，影響血清中的血糖、總膽固醇和總蛋白水平。較高的微絨毛密度會(huì)減少腸細(xì)胞之間緊密連接的暴露，這有助于提供一種更有效的屏障來抵御潛在的病原體。益生菌可通過改善腸道微觀形態(tài)改善腸道健康促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)。

益生菌除了對(duì)腸道形態(tài)的影響外，還具有調(diào)節(jié)腸道黏膜細(xì)胞生理活動(dòng)的能力。黏液細(xì)胞是腸道黏膜抵御病原菌感染的重要部分。黏液杯狀細(xì)胞由酸性和中性黏蛋白組成，有助于潤(rùn)滑、捕獲和清除病原體。Sewaka 等（2019）飼喂補(bǔ)充了菊芋和鼠李糖乳桿菌的餌料使紅羅非魚的杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯更高，中性黏液細(xì)胞和雙色黏液細(xì)胞數(shù)量顯著增加，魚腸道各部均以酸性黏液細(xì)胞為主，IgG 與酸性黏蛋白的黏附有利于其在紅羅非魚腸道定植存活。Standen 等（2016）用商品化的多菌種益生菌飼喂羅非魚，使其腸中杯狀細(xì)胞的數(shù)量明顯增多；在只添加乳酸雙球菌的羅非魚中也使杯狀細(xì)胞水平升高，提高腸道對(duì)致病的抵抗力。魚胃腸道中的杯狀細(xì)胞充滿了豐富的酸性黏蛋白。腸道黏液對(duì)防御屏障至關(guān)重要，無論是物理上還是化學(xué)上，因?yàn)樗墓δ苁遣东@和清除病原體，防止它們附著在上皮細(xì)胞上。

添加益生菌能使腸道中免疫相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)生變化。腫瘤壞死因子α（TNF-α）通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，將更多的淋巴細(xì)胞招募到定居或感染部位，從而促進(jìn)宿主對(duì)細(xì)菌定植或入侵的防御機(jī)制。Standen等（2013）添加乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）增加了羅非魚腸道中TNF-α的產(chǎn)生。劉長(zhǎng)軍（2018）在尼羅羅非魚飼料中添加植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），與對(duì)照組相比，尼羅羅非魚腸道細(xì)胞因子核因子κB（NF-κB）、TNF-α和白細(xì)胞介素10（IL-10）的相對(duì)表達(dá)提高，這表明攝食益生菌的魚類處于免疫升高的狀態(tài)，通過改善免疫來幫助其抵抗病原性入侵。研究多菌種益生菌對(duì)羅非魚的影響，結(jié)果表明參與產(chǎn)生免疫反應(yīng)的熱休克蛋白HSP70 基因表達(dá)顯著增加。Xia等（2018）在飼料中添加鼠李糖乳桿菌和乳酸乳桿菌，提高了羅非魚HSP70 表達(dá)，干擾素-γ基因表達(dá)水平最高，腸道和肝臟中促炎細(xì)胞因子表達(dá)增加的魚類對(duì)無乳鏈球菌的抵抗力增強(qiáng)。GALT受到了益生菌調(diào)節(jié)而增強(qiáng)了天然免疫力。

3.2 益生菌對(duì)SALT的影響

益生菌可改善魚類的皮膚相關(guān)淋巴組織，由于皮膚與環(huán)境直接接觸，是魚類最主要和最大的黏膜防御系統(tǒng)之一，因此，有關(guān)益生菌對(duì)皮膚淋巴組織的研究具有重要意義。水產(chǎn)動(dòng)物的皮膚與哺乳動(dòng)物的皮膚并不相同，但在發(fā)育、結(jié)構(gòu)和保護(hù)功能方面有相似之處。Das等（2013）選用解淀粉芽孢桿菌（Bacillus Amy?loliquefaciens）對(duì)鯉進(jìn)行了試驗(yàn)，飼喂三個(gè)水平的包被益生菌飼料，對(duì)全身和皮膚黏膜免疫應(yīng)答表現(xiàn)出不同水平的影響作用，對(duì)皮膚黏液中的溶菌酶、過氧化物酶和總蛋白含量均有顯著提高。Hoseinifar 等（2015）添加嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）飼料，使劍尾魚（Xiphophorus helleri）皮膚黏液中的抗菌活性隨給藥劑量的增加而增強(qiáng)，呈劑量依賴關(guān)系，且喂食益生菌使魚類皮膚黏液蛋白水平升高，皮膚黏液殺菌活性和可溶性蛋白水平的提高可以改善使用益生菌后的免疫反應(yīng)。Van 等（2018）從尼羅羅非魚的胃腸道中分離出來兩種益生菌；Kuebutornye 等（2020）選用三種芽孢桿菌，聯(lián)合添加至尼羅羅非魚飼料中，皮膚黏液免疫指標(biāo)顯著增加，益生菌的協(xié)同作用刺激了黏膜免疫的應(yīng)答。益生菌及其衍生物質(zhì)可以在黏膜上皮局部發(fā)揮作用，或者如果他們滲透到宿主的循環(huán)或刺激免疫細(xì)胞從黏膜部位移動(dòng)到全身淋巴組織，就可以在局部或系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮作用。Hoseinifar 等（2019）在鯉幼魚飼料中添加單獨(dú)或混合的乳酸片球菌和棉籽糖，補(bǔ)充后免疫能力提高，顯著增加了皮膚黏液總免疫球蛋白（Ig），提高皮膚黏液蛋白酶活性，編碼溶菌酶的基因在皮膚中的表達(dá)上調(diào)，可歸因于SALT的調(diào)節(jié)，表明益生菌對(duì)先天免疫反應(yīng)有免疫調(diào)節(jié)作用。Guo 等（2020）通過野生捕撈魚類腸道中分離到的腸系膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）對(duì)免疫相關(guān)基因的上調(diào)作用，激活了大菱鲆（Scophthalmus maximus）皮膚黏膜免疫功能。益生菌可刺激皮膚黏膜免疫的應(yīng)答，調(diào)節(jié)皮膚黏液蛋白及免疫因子，提高免疫力。

3.3 益生菌對(duì)GIALT的影響

鰓上覆蓋著黏液，以保護(hù)其免受入侵的病原體的侵襲，但相關(guān)研究較少，是因?yàn)轱暳涎a(bǔ)充是益生菌最常見的添加方式。在投喂含有益生菌的飼料后，鰓與益生菌的接觸變得最小。如果所投細(xì)菌對(duì)鰓黏膜有很高的親和力，在養(yǎng)殖水體中直接添加益生菌會(huì)更好地增加與鰓的接觸。王淼等（2017）研究中發(fā)現(xiàn)，健康尼羅羅非魚皮膚和鰓黏附細(xì)菌存在相同的優(yōu)勢(shì)菌群，主要為特呂珀菌屬（Truepera）、硫桿菌屬（Thiobacil?lus）、弓形桿菌（Arcobacter）、海單胞菌屬（Marinomo?nas）和弧菌屬（Vibrio）。人工感染無乳鏈球菌后，魚的鰓黏膜共生菌菌群多樣性下降。Wang等（2020）在水中添加益生菌蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis）能提高尼羅羅非魚鰓中的堿性磷酸酶活性，且這兩種益生菌不會(huì)在羅非魚的鰓中定植，而定期投放時(shí)，它們會(huì)影響羅非魚特定組織的水質(zhì)、微生物區(qū)系和免疫酶活性。Mohapatra 等（2012）在飼料中添加多種益生菌混合物投喂南亞野鯪（Labeo rohita），益生菌可以減輕氰戊菊酯的鰓相關(guān)壞死效應(yīng)，可保持鰓的組織結(jié)構(gòu)完整，并促進(jìn)氰戊菊酯暴露期間鰓細(xì)絲的再生。益生菌直接添加到水體中能更好地與鰓接觸，保護(hù)了鰓相關(guān)淋巴組織。

3.4 益生菌對(duì)黏膜表面微生物區(qū)系的影響

益生菌不僅對(duì)局部黏膜免疫有直接影響外，且對(duì)黏膜表面的共生微生物區(qū)系也有一定的影響。共生微生物區(qū)系不能被認(rèn)為是黏膜相關(guān)淋巴組織的一部分，而共生微生物區(qū)系在黏膜相關(guān)淋巴組織的發(fā)育和正常功能中是必不可少的。添加益生菌可以增加潛在有益細(xì)菌的數(shù)量，減少有害微生物的數(shù)量，所以益生菌對(duì)黏膜表面微生物區(qū)系的研究具有重要意義。Wang等（2020）在水中添加益生菌蠟樣芽孢桿菌和糞產(chǎn)堿桿菌，發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚黏膜免疫器官共享一個(gè)核心微生物群，其中鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）在這些器官中比在水和沉積物中相對(duì)豐富得多，為進(jìn)一步研究其在黏液中的功能提供了依據(jù)。然而，相對(duì)豐富的屬不受益生菌處理的影響。Xia 等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚的優(yōu)勢(shì)菌群是梭桿菌門（Fusobacteria）、變形桿菌（Proteobacteria）、放線桿菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes），在添加鼠李糖乳桿菌和乳酸乳桿菌后增加了變形桿菌的分布，減少了梭桿菌、擬桿菌和放線菌的數(shù)量，且單獨(dú)使用乳酸乳桿菌進(jìn)一步豐富了厚壁菌門。Mirghaed等（2018）單獨(dú)或聯(lián)合使用可發(fā)酵纖維和益生菌提高了里海白魚（Rutilus fresii kutum）魚種總原生腸道菌群和原生乳酸菌水平。Guo 等（2020）通過野生捕撈魚類腸道中分離到的腸系膜明串珠菌菌株HY2對(duì)大菱鲆腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)具有調(diào)控作用，能夠增強(qiáng)免疫應(yīng)答和優(yōu)化腸道菌群的結(jié)構(gòu)和多樣性。黏膜表面微生物區(qū)系組成多樣性與黏膜相關(guān)淋巴組織具有相關(guān)性，施用益生菌來調(diào)節(jié)黏膜表面微生物區(qū)系的組成，從而影響?zhàn)つっ庖呦到y(tǒng)。

4 小結(jié)

MALT 是抵御外界環(huán)境有害物質(zhì)的第一道屏障，是機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要部分。近些年，隨著集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，黏膜免疫系統(tǒng)面臨著各種病原體的入侵，威脅著水產(chǎn)動(dòng)物的健康生長(zhǎng)，益生菌作為飼料添加劑，能提高黏膜屏障，調(diào)節(jié)微生物比例和提升黏膜免疫狀態(tài)，益生菌及產(chǎn)品在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)占有舉足輕重的地位。但益生菌對(duì)黏膜免疫系統(tǒng)的研究仍十分有限。今后的研究將集中為尋找合適的多功能益生菌，探索益生菌不同的添加方式和不同用量對(duì)黏膜相關(guān)淋巴組織的影響，深入研究益生菌作用黏膜免疫系統(tǒng)的相關(guān)機(jī)制。隨著研究的逐步深入，益生菌對(duì)黏膜免疫的影響及相關(guān)機(jī)制會(huì)被進(jìn)一步揭示，在禁抗的大背景下，將有助于開發(fā)更多的漁用益生菌產(chǎn)品，推動(dòng)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)向著更為綠色健康的方向發(fā)展。