酵母抽提物添加時間對醬油風(fēng)味的影響

曲艾鈺，張彥民，王 菲，李 沛，吳關(guān)威，趙國忠*

（1.天津科技大學(xué) 省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.山東巧媳婦食品集團有限公司，山東 淄博 255400；3.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

醬油是傳統(tǒng)的發(fā)酵大豆制品，因其特有的風(fēng)味和鮮味而被世界公認(rèn)為不可或缺的調(diào)味品[1]。醬油發(fā)酵主要分為兩步：曲發(fā)酵和醬醪發(fā)酵。曲發(fā)酵主要由曲霉發(fā)酵為主，而醬醪發(fā)酵過程中，復(fù)雜的微生物群落對于關(guān)鍵的揮發(fā)性化合物、氨基酸、肽和糖類的生成非常必要[2]。酵母抽提物（yeast extract，YE）是以含豐富蛋白質(zhì)的食用酵母為原料，經(jīng)細(xì)胞自溶、分離、蒸發(fā)、干燥等技術(shù)，將酵母細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)進行降解而成的酵母產(chǎn)品[3]。YE作為功能性營養(yǎng)品，富含蛋白質(zhì)和多肽、核苷酸、維生素B、維生素E、礦物質(zhì)、游離氨基酸[4]，這些物質(zhì)對促進菌群生長并促進風(fēng)味形成有重要作用。隨著人們對美好生活的追求，YE在食品中的應(yīng)用越來越廣泛，如水產(chǎn)品[5]、飲料[6]、醬油[7]等，但關(guān)于YE在醬油發(fā)酵階段添加時間的優(yōu)化研究鮮有報道。

眾所周知，揮發(fā)性香氣化合物和增味物質(zhì)有助于醬油風(fēng)味的形成[8]。這種現(xiàn)象歸因于一個事實，即醬油的質(zhì)量在很大程度上取決于微生物的貢獻[9]。YE在醬油中的應(yīng)用，不僅取決于YE自身對醬油風(fēng)味的貢獻，更能夠通過提供微生物所需的營養(yǎng)物質(zhì)促進醬油風(fēng)味的形成。該研究以不添加YE為對照組（YE0），以發(fā)酵前期、中期和后期添加YE為實驗組（YE1、YE2和YE3），通過感官評價、電子鼻技術(shù)和頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（headspace-solidphase microextraction-gaschromatographymassspectrometry，HS-SPME-GC-MS）分析四種醬油樣品的感官屬性并對揮發(fā)性香氣物質(zhì)進行定性定量分析，探究YE添加時間對醬油風(fēng)味的影響，為高價值改良品質(zhì)醬油的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

醬醪樣品（黃豆和小麥3∶1）：采自致美齋食品有限公司；酵母抽提物（蛋白質(zhì)：47.0 g/100 g；碳水化合物：16.9g/100 g）：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 試劑

苯乙醇、3-甲基丁醛、2-甲基丁酸乙酯、4-乙基愈創(chuàng)木酚、5-乙基-4-羥基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮（5-ethyl-4-hydroxy-2-methyl-3（2h）-furanone，HEMF）、2,6-二甲基吡嗪、乙酸、乙醇（均為分析純）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；2-辛醇（純度99%）：上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；C7～C40正構(gòu)烷烴（色譜純）：美國AccuStandard公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204/02電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；AllegraTa25R型高速離心機：美國BeckMan公司；PEN3型便攜式電子鼻傳感器：德國Airsense公司；QP2010 Ultra型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）：日本島津公司；50/30 μm fused silica（DVB/CAR/PDMS）固相微萃取頭：美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 醬油的制備工藝流程與操作要點

將黃豆和小麥按質(zhì)量比3∶1混合，并在121 ℃下滅菌20 min。冷卻至室溫后，將3.0‰的米曲霉均勻接種到冷卻至室溫的原料中。在30 ℃條件下堆積培養(yǎng)，待曲表面變?yōu)榘咨M行第一次翻曲。然后繼續(xù)培養(yǎng)，直到表面變黃進行第二次翻曲。待顏色變?yōu)榫G色時停止培養(yǎng)。隨后加入18%鹽水進行醬醪發(fā)酵。在醬醪發(fā)酵初期溫度從15 ℃升高到30 ℃（每天升溫1 ℃），之后在30 ℃條件發(fā)酵75 d，再經(jīng)浸提得到生醬油。

1.3.2 酵母抽提物添加時間的考察

以成曲加入鹽水入罐24 h后開始計為0天，發(fā)酵第30天添加1%的YE為YE2，發(fā)酵第60天添加1%的YE為YE3。每天定時進行一次通氣攪拌。經(jīng)前期預(yù)實驗結(jié)果表明，添加1%的YE效果較好，因此本研究將繼續(xù)探究YE添加時間對醬油發(fā)酵的影響。YE添加比例及添加時間見表1。

表1 酵母抽提物的添加時間試驗設(shè)計Table 1 Design of addition time of yeast extract

1.3.3 感官評價方法

采用定量描述分析（quantitative describe analysis，QDA）評估醬油樣品的香氣特征[10]。從天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院招募了10名訓(xùn)練有素的小組成員（5男5女，年齡23～30歲）。每位小組成員在使用QDA評估醬油風(fēng)味方面都有超過150 h的感官體驗。小組成員最終選擇了七個感官屬性以及如下香氣作參考：焦糖香（HEMF），果香（2-甲基丁酸乙酯），花香（苯乙醇），麥芽香（3-甲基丁醛），煙熏香（4-乙基苯酚），酸味（乙酸），醇香（乙醇），此外，還增加整體風(fēng)味的評估，作為對醬油品質(zhì)的綜合評價。

感官評價在一個密閉無異味的房間進行，將30 g未經(jīng)稀釋的醬油樣品放置在一個100 mL不透明的塑料杯中，采用編號盲評的方法，于25 ℃提供給感官小組成員。小組成員以0-9的等級（0：無強度，1：極弱，2：很弱，3：較弱，4：稍弱，5：強，6：稍強，7：較強，8：很強，9：極強）對四款醬油的七種感官屬性進行評分。每個樣品一式三份進行，所得數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。將得到的六維香氣輪廓繪制成雷達(dá)圖。

1.3.4 電子鼻檢測

Pen3電子鼻由10個金屬氧化物氣體傳感器組成，包括W1C（苯和芳香化合物）、W5S（氮氧化物）、W3C（氨和芳香化合物）、W6S（氫化合物）、W5C（短鏈烷烴芳香成分）、W1S（甲基類）、W1W（含硫化合物）、W2S（醇、醛和酮）、W2W（芳香族化合物和有機硫化物）和W3S（長鏈烷烴）。

取5 mL醬醪置于15 mL頂空瓶中，在（80±2）℃水浴30 min后進行電子鼻測定。其中，電子鼻的參數(shù)設(shè)定為：檢測時間110 s，清洗時間60 s，進樣間隔時間60 s，載氣流速200 mL/min，進樣流量200 mL/min。

1.3.5 揮發(fā)性成分分析

醬油中的揮發(fā)性成分采用HS-SPME-GC-MS法測定，取3 mL樣品于15 mL頂空瓶中，加入30.7 μL 2-辛醇（20 mg/L，基體溶液為甲醇）作為內(nèi)標(biāo)，于60 ℃、600 r/min條件下平衡20 min。在相同的溫度和轉(zhuǎn)速，插入經(jīng)老化的50/30 μm DVB/CAR/PMDS萃取頭頂空吸附30 min。吸附結(jié)束后，將萃取頭插入氣相色譜儀（gas chromatography，GC）進樣口，于250 ℃解吸5 min。

根據(jù)之前的研究設(shè)置GC-MS條件[11]，升溫程序如下：40 ℃下保持5 min，3 ℃/min升溫至250 ℃后保持5 min，分流比為20∶1。MS條件如下：離子源為電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度220 ℃；掃描模式為全掃描。分析得到的圖譜與美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST11）進行對比，選取相似度≥80%的物質(zhì)，與正構(gòu)烷烴（C7～C40）在相同條件下進行GC-MS分析，計算保留指數(shù)（retention index，RI）。

樣品氣味活性值（odor activity value，OAV）是利用單個風(fēng)味物質(zhì)的溶度與其水中的閾值的比值計算得出[12]。OAV≥1的物質(zhì)被認(rèn)為是能夠被人感知的風(fēng)味物質(zhì)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

每個樣品重復(fù)三次實驗，并取平均值用于分析統(tǒng)計，使用Origin 2021作主成分分析（principal component analysis，PCA）并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官分析結(jié)果

為了對四種醬油YE0、YE1、YE2和YE3的香氣特征差異進行評價，進行了定量描述分析（QDA），用六項感官屬性描述種醬醪的香氣特征，包括焦糖香、果香、花香、麥芽香和煙熏香，使用方差分析區(qū)分感官得分的差異，繪制感官評分雷達(dá)圖結(jié)果見圖1。

圖1 四款醬油樣品的感官評分雷達(dá)圖Fig.1 Sensory score radar chart of four soy sauce samples

如圖1所示，醬醪之間六項感官屬性強度存在顯著差異（P＜0.05）。YE1的特點是整體風(fēng)味最強烈，其中，焦糖香、煙熏香、花香、果香較為突出，酸味較弱。從整體風(fēng)味看，除YE1以外，其余三種樣品整體風(fēng)味相差較小。

2.2 電子鼻分析結(jié)果

與感官分析相比，電子鼻分析更準(zhǔn)確、更客觀，效率更高[13]。四種醬油樣品的電子鼻傳感器響應(yīng)雷達(dá)圖結(jié)果見圖2。

由圖2可知，與YE0、YE2和YE3相比，YE1在W2S（10.60）具有更高的響應(yīng)值。而W2S傳感器對醛、醇、酮敏感。結(jié)果表明，醇類、醛類和酮類可能對YE1的香氣貢獻很大，與YE2和YE3相比，在醬油發(fā)酵前期添加YE對醬油整體風(fēng)味影響較明顯。

圖2 四種醬油樣品的電子鼻傳感器響應(yīng)雷達(dá)圖Fig.2 Radar chart of electronic nose sensors response of four kinds of soy sauce samples

2.3 不同醬油樣品的揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

通過HS-SPME-GC-MS定性定量分析研究四種醬醪中的揮發(fā)性風(fēng)味化合物，四種醬油樣品風(fēng)味物質(zhì)種類及各物質(zhì)總含量測定結(jié)果見圖3。

圖3 四種醬油樣品風(fēng)味物質(zhì)種類（a）及各類物質(zhì)總含量（b）比較Fig.3 Comparison of flavor substances types (a) and total content of each category substance (b) in four kinds of soy sauce samples

由圖3a可知，共檢測到49種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，分別為13種酯類、10種醇類、9種酮類、8種醛類、5種酚類和4種酸類。其中，樣品YE0、YE1、YE2和YE3分別含有42種、40種、41種和38種化合物。由圖3b可知，與對照組相比，實驗組中的酯類、醛類、酮類和酚類物質(zhì)有明顯的提升?？赡苁怯捎谕庠刺砑覻E，為醬油體系中的微生物生長提供了足夠的營養(yǎng)源，促進微生物對原料的分解利用，從而有利于酯類、醛類、酮類和酚類的生成，豐富了醬油中煙熏香、焦糖香、麥芽香、果香和花香，使醬油香氣更加飽滿和諧，這與圖2的感官評價結(jié)果一致。發(fā)酵食品中的酯類物質(zhì)通常由發(fā)酵期間微生物代謝作用及醇類和有機酸的酯化反應(yīng)生成[14]。醛類物質(zhì)主要有脂質(zhì)降解或不飽和酸氧化生成[15]。雖然酯類和醛類物質(zhì)的含量低，但由于其較低的閾值，是醬油中的重要風(fēng)味物質(zhì)，主要呈現(xiàn)果香、花香和焦糖香[16]。發(fā)酵前期添加YE發(fā)現(xiàn)，YE1中酯類、醛類、醇類和酮類的含量最高，這些物質(zhì)有利于豐富醬油中的麥芽香、焦糖香、花香和果香，整體風(fēng)味有進一步的提升。隨著中、后期添加YE，酯類、醛類、醇類和酮類濃度呈現(xiàn)下降趨勢。造成這種現(xiàn)象的原因可能是YE可作為醬油發(fā)酵過程中微生物生長代謝的底物被利用，并被分解成小分子的揮發(fā)性物質(zhì)，與中后期添加YE相比，前期添加YE其分解徹底，因此YE1中酯類、醛類、醇類和酮類的含量最高，風(fēng)味更加飽滿和諧。

2.4 四款醬油樣品的風(fēng)味物質(zhì)聚類分析

熱圖描述了四種醬油中已識別的揮發(fā)性化合物的整體情況，結(jié)果見圖4。由圖4可知，顏色強度歸一化范圍從最大值1.50（白色）到最小值-1.47（黑色）。聚類結(jié)果顯示，四種醬油主要分為3簇：YE2和YE3歸為一組，另外兩組分別由YE0和YE1組成。49種揮發(fā)性化合物基于熱圖被分為三組。第一組涵蓋了部分酯類，醇類和酮類等12種物質(zhì)，主要與果香和麥芽香有關(guān)，其中異戊酸乙酯和異戊醛呈現(xiàn)出更高的濃度。第二組涵蓋了所有酚類、大部分醛類以及部分酯類和醇類等20種物質(zhì)，主要貢獻煙熏香、果香和花香，YE2和YE3中酚類物質(zhì)的濃度較高，而YE0和YE1中酚類物質(zhì)的濃度較低。酚類物質(zhì)是醬油中的次要成分，有助于維持食品顏色、味道和保質(zhì)期的穩(wěn)定性[17]。第三組涵蓋了部分酯類、醇類、醛類、酮類和酸類等17種物質(zhì)，主要貢獻果味、焦糖香和酸味，與另外三組相比，YE1中1-辛烯-3-醇，丙位壬內(nèi)酯，異戊酸乙酯，2-甲基丁酸乙酯，癸醛，壬醛和異戊醛的含量最為突出。

圖4 四種醬油樣品的風(fēng)味物質(zhì)聚類分析熱圖Fig.4 Clustered heatmap of flavor substances in four kinds of soy sauce samples

2.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的香氣活力值分析

揮發(fā)性香氣化合物對醬油的貢獻不僅取決于濃度，還取決于它們的氣味閾值。為了進一步評估揮發(fā)性香氣化合物對醬油整體香氣的貢獻，對其OAV進行計算，結(jié)果見表2。由表2可知，在GC-MS分析鑒定的49種揮發(fā)性香氣化合物中，4款醬油樣品中分別有23、22、25和24種化合物的含量超過了它們的氣味閾值，即它們的OAV≥1，這些化合物被認(rèn)為對醬油香氣做出貢獻。四種樣品揮發(fā)性香氣化合物的總OAV表現(xiàn)出顯著差異。

表2 四種醬油樣品中風(fēng)味物質(zhì)的香氣活力值Table 2 Odor activity value of flavor substances in four kinds of soy sauce samples

續(xù)表

焦糖香和煙熏香是構(gòu)成醬油整體風(fēng)味的關(guān)鍵。OAV計算結(jié)果顯示，YE1中焦糖香和煙熏香的總OAV分別是YE0的1.3、2.1倍。3-甲硫基丙醛（焦糖香，OAV 39.6～72.4）、HEMF（焦糖香，OAV 38.1～89.3）、愈創(chuàng)木酚（煙熏香，OAV 110.1～157.3）在醬油中僅以微量存在，但由于其較低的氣味閾值，被認(rèn)為是醬油主要的香氣貢獻物者。醛類來源于相應(yīng)氨基酸通過Ehrlich途徑的降解，對食物的氣味有很強的影響[18]。3-甲硫基丙醛是四種醬油樣品中關(guān)鍵的焦糖味化合物，其來源于甲硫氨酸[19]，其中YE1和YE2的3-甲硫基丙醛的OAV最高。HEMF是由酵母菌（魯氏接合酵母和假絲酵母）通過磷酸戊糖途徑或基于戊糖的美拉德反應(yīng)生成的[20-21]，YE1中HEMF的OAV值達(dá)到89.3，可能是前期添加YE能夠促進魯氏接合酵母和假絲酵母的生長，進而促進HEMF的生成。作為醬油中典型煙熏香氣味的愈創(chuàng)木酚，在YE1中也觀察到了較高的OAV值。

果香和花香用以輔助提升醬油風(fēng)味，使醬油香氣更加飽滿和諧。YE1中的果香化合物的OAV是YE0的2.5倍，而YE2、YE3中的果香化合物的OAV比YE0低59.5%、59.1%，“花香”的總OAV是YE0的2.1倍。由表2可知，異戊酸乙酯（果香，OAV 1 506.3～2 636.4）、2-甲基丁酸乙酯（果香，OAV 3 361.3～27 426.5）、苯乙醛（花香，OAV 34.9～73.0）是四款醬油中關(guān)鍵的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。異戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和壬醛被認(rèn)為是典型的果香類物質(zhì)。YE1中異戊酸乙酯的OAV最高，可能前期添加YE為酵母生長提供足夠的營養(yǎng)源，延長了酵母發(fā)酵階段[22]，YE2和YE3中異戊酸乙酯的OAV較低，后期添加YE可能不利于酵母發(fā)酵。2-甲基丁酸乙酯被認(rèn)為是黑豆醬油的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)[23]，主要來源于醬油長時間發(fā)酵過程中，乙醇和2-甲基丁酸發(fā)生酯化反應(yīng)。乙醇和醋酸是酵母菌和乳酸菌的代謝產(chǎn)物[22]，2-甲基丁酸主要由支鏈氨基酸（異亮氨酸和亮氨酸）在發(fā)酵過程中通過微生物的酶促作用產(chǎn)生[24]，觀察到Y(jié)E1中2-甲基丁酸乙酯的OAV最高，分別是YE0、YE1、YE3的3.0、8.1、6.4倍。苯乙醛被認(rèn)為是中國傳統(tǒng)醬油中典型的揮發(fā)性化合物，在醬油中提供花香，主要通過酵母細(xì)胞的Ehrlich途徑[25]，觀察到Y(jié)E1中的苯乙醛的含量最高。綜上所述，除YE自身能夠為醬油提供風(fēng)味外，在醬油發(fā)酵前期添加YE，更能很好地促進醬油體系中酵母菌的生長代謝，促進醬油綜合風(fēng)味的形成。

2.6 主成分分析

為了深入了解四種醬油之間的差異，使用多變量分析方法進行探究。對所有醬油樣品中檢測到的28種關(guān)鍵揮發(fā)性化合物（OAV≥1）進行了PCA分析，結(jié)果見圖5。由圖5可知，兩個主成分PC1和PC2解釋了總方差的99.9%（分別為97.7%和2.2%）。YE0、YE2和YE3沒有被分開，表明與在醬油前期添加YE相比，在發(fā)酵中期和后期添加YE對醬油的風(fēng)味影響不明顯。

圖5 四種醬油樣品中OAV≥1的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)主成分分析結(jié)果Fig.5 Principal component analysis results of key flavor substances OAV≥1 in four soy sauce samples

3 結(jié)論

該研究采用電子鼻技術(shù)和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）對未添加酵母抽提物（YE0），發(fā)酵前期、中期和后期添加YE釀造的醬油（YE1、YE2和YE3）中的揮發(fā)性香氣成分進行分析。QDA結(jié)果顯示，YE1的整體風(fēng)味得分最高。與未添加YE醬油相比，添加YE的三種醬油中的酯類、醛類、酮類和酚類物質(zhì)有明顯的提升。隨著中、后期添加YE，酯類、醛類、醇類和酮類濃度呈現(xiàn)下降趨勢。熱圖和主成分分析結(jié)果顯示，與未添加YE醬油，中、后期添加YE對提升醬油風(fēng)味影響較小。在醬油前期添加YE，能夠很好地促進醬油體系中酵母菌的生長代謝，促進醬油綜合風(fēng)味的形成。結(jié)果表明，發(fā)酵前期添加YE可增強醬油麥芽香、焦糖香、花香和果香的風(fēng)味特點，使醬油香氣更佳豐富醇厚。