酸黃皮細(xì)菌群落研究及基因功能預(yù)測(cè)

熊英梅，魏冰倩，張 彥，熊建文，郭 壯，王玉榮*

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.湖北文理學(xué)院 乳酸菌生物技術(shù)與工程襄陽市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 襄陽 441053；3.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003；4.柳州工學(xué)院 柳州市螺螄粉植物源性配料研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545616）

山黃皮（Clausena dentata（Willd.）Roem）別名雞皮果、野黃皮，為蕓香科的多年生南亞熱帶“藥食同源”水果，主要分布在廣西、云南南部和越南北部等地區(qū)[1]。山黃皮富含氨基酸、維生素和礦物質(zhì)，藥用價(jià)值較高，具有助食消暑、祛痰化氣、消風(fēng)腫和止痛等多種功效[2-3]。此外，山黃皮果實(shí)中還含有揮發(fā)油和黃酮，具有抑菌、抗氧化等功效[4-6]。成熟的山黃皮可鮮食，亦可干制或腌制成果干果脯，目前，亦有研究人員嘗試將其開發(fā)成果醬、乳酸菌飲料等[7-8]。

南寧市位于廣西壯族自治區(qū)南部偏西，與越南毗鄰，地處亞熱帶，具有豐富的野生植物類群，是一個(gè)以壯族為主體的多民族聚居地，當(dāng)?shù)厝嗣癯０芽诟泻们冶＝r(jià)值高的野生植物作為腌制品的原材料，制成特色的腌制酸食，酸黃皮即為當(dāng)?shù)氐奶厣称分籟9-10]。家庭自制的酸黃皮多以成熟山黃皮為主要原料，經(jīng)去葉清洗、蒸熟去核后放涼，采用一層果肉一層鹽或糖的方法放入洗凈的玻璃瓶中，于陰涼處密封腌制一個(gè)月以上制成[11]。當(dāng)?shù)厝顺Ｔ谌忸惣庸r(shí)加入腌制山黃皮，用于去腥提鮮，或是直接泡水飲用。酸黃皮在廣西等地食用歷史久遠(yuǎn)，受眾范圍較廣，但目前有關(guān)酸黃皮制品的研究較少且主要集中在腌制成品的分析檢測(cè)部分，對(duì)于酸黃皮細(xì)菌群落的研究鮮見報(bào)道。

本研究采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)采自廣西壯族自治區(qū)南寧市的8份酸黃皮樣品的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，并進(jìn)一步使用BugBase網(wǎng)站和PICRUSt軟件預(yù)測(cè)酸黃皮樣品的細(xì)菌基因功能，以期為發(fā)掘菌種資源、提高其食用安全性和經(jīng)濟(jì)效益提供部分參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸黃皮樣品：于2019年7月中旬采自廣西壯族自治區(qū)南寧市（E 107°45′～108°51′，N 22°13′～23°32′）五里亭農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、瑯西菜市場(chǎng)和淡村菜市場(chǎng)，共采集8份，編號(hào)為SHP1～SHP8。所用樣本原料來源于當(dāng)?shù)?，均為自然發(fā)酵形成，腌制時(shí)間均在一個(gè)月左右。每個(gè)樣品采集100 g左右，放于一次性密封袋中低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

DNeasymericonFoodKit：德國QIAGEN公司；338F/806R雙向引物：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（酶活5 U/μL）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）Mix（2.5 mmol/L）、rTaq酶（酶活5 U/μL）、DL 2 000 Marker、10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液：寶生物工程（大連）有限公司；Illumina MiSeq測(cè)序配套試劑：美國Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MiSeq PE250高通量測(cè)序平臺(tái)：美國Illumina公司；R920機(jī)架式服務(wù)器：美國DELL公司；Veriti FAST梯度PCR儀：美國ABI公司；164-5050基礎(chǔ)電泳儀：美國Bio-Rad公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國Protein Simple公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取、擴(kuò)增及測(cè)序

使用QIAGEN Dneasy mericon Food Kit提取酸黃皮樣品的宏基因組DNA，以其為模板，參考QIU Z C等[12]的方法對(duì)16S rRNA V3-V4區(qū)基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并將檢驗(yàn)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序。

1.3.2 生物信息學(xué)分析及可視化

參考郭壯等[13]的方法去除序列中的核苷酸標(biāo)簽與引物，使用QIIME分析平臺(tái)[14]進(jìn)行PyNAST對(duì)齊[15]，依據(jù)100%和97%兩步UCLUST對(duì)序列進(jìn)行劃分得到各操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）[16]，利用ChimeraSlayer去除含有嵌合體的OTU[17]，比對(duì)序列明確其分類學(xué)地位[18]。使用FastTree軟件構(gòu)建核心OTU的系統(tǒng)發(fā)育樹[19]，然后使用BugBase網(wǎng)站（https：//bugbase.cs.umn.edu/）[20]和PICRUSt軟件[21]對(duì)酸黃皮樣品中微生物的基因功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，并參照蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫（clusters of orthologous groups of proteins，COGs）注釋細(xì)菌的基因功能[22]。本研究將在8份酸黃皮樣品中均存在且平均相對(duì)含量＞1.0%的細(xì)菌門、屬和OTU定義為核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門、屬和OTU。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

使用R軟件的corrplot和waterfall包進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸黃皮樣品中細(xì)菌群落組成及優(yōu)勢(shì)菌屬相關(guān)性分析

納入本研究的8份酸黃皮樣品經(jīng)Illumina MiSeq高通量測(cè)序后，共產(chǎn)生了362 818條高質(zhì)量的16S rRNA序列，平均每個(gè)樣品45 352條。通過UCLUST的100%相似性劃分共得到了104 062個(gè)OTU，根據(jù)97%相似性劃分共得到了6 342個(gè)OTU，平均每個(gè)樣品包含793個(gè)OTU。本研究進(jìn)一步對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)酸黃皮樣品中共存在22個(gè)細(xì)菌門和593個(gè)細(xì)菌屬，其相對(duì)含量見圖1。

圖1 酸黃皮樣品中細(xì)菌門（A）和細(xì)菌屬（B）的相對(duì)含量分析結(jié)果Fig.1 Analysis results of relative contents of bacteria phyla (A) and bacteria genera (B) in acidic Randia cochinchinensis samples

由圖1可知，酸黃皮樣品中的核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門有4個(gè)，分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），平均相對(duì)含量分別為49.75%、41.15%、3.61%和2.58%；核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有10個(gè)，分別為隸屬于Firmicutes的芽孢桿菌屬（Bacillus）、大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、梭菌屬（Clostridium）、纖細(xì)芽孢桿菌屬（Gracilibacillus）、枝芽孢菌屬（Virgibacillus）和乳桿菌屬（Lactobacillus），隸屬于Proteobacteria的羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）和伯克氏菌屬（Burkholderia），隸屬于Bacter-oidetes的諾卡氏菌屬（Nocardia），平均相對(duì)含量分別為8.36%、4.13%、4.00%、3.15%、3.05%、2.25%、1.4%、38.77%、4.44%和1.03%。周金沙等[23]亦使用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息統(tǒng)計(jì)與分析，探索了同為廣西地區(qū)的無鹽發(fā)酵酸筍樣品中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Firmicutes、Proteobacteria 和Actinobacteria為其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，這與本研究結(jié)果類似，造成這種現(xiàn)象的原因可能與采集地區(qū)有關(guān)[24]。有研究指出Burkholderia的部分菌可引起肺炎的傳播[25]，而在納入本研究的酸黃皮樣本中均檢測(cè)出Burkholderia，由此可見，解析酸黃皮中菌群組成可為提高食用安全性提供指導(dǎo)。

為進(jìn)一步探究酸黃皮樣品中各菌屬間的影響，本研究使用皮爾森相關(guān)性系數(shù)判定各核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬間的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果見圖2。

圖2 酸黃皮樣品中核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的相關(guān)性分析結(jié)果Fig.2 Correlation analysis results of core dominant genera in acidic Randia cochinchinensis samples

由圖2可知，在10個(gè)核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬中Ralstonia與Nocardia、Burkholderia呈顯著的正相關(guān)（P＜0.05），與Oceanobacillus呈顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；Bacillus與Clostridium、Oceanobacillus與Gracilibacillus呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；Paenibacillus與Lactobacillus呈極顯著的正相關(guān)（P＜0.01），其余各核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬間相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，多數(shù)核心優(yōu)勢(shì)菌屬間正相關(guān)關(guān)系明顯，表明酸黃皮樣品中多數(shù)細(xì)菌呈正向相互調(diào)節(jié)機(jī)制，這也是形成廣西酸黃皮特殊風(fēng)味的基礎(chǔ)。

2.2 基于OTU水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

為了解各酸黃皮樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群的差異，本研究對(duì)酸黃皮樣本中OTU的出現(xiàn)頻率及核心優(yōu)勢(shì)OTU的平均相對(duì)含量進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，納入本研究的酸黃皮樣品中共產(chǎn)生了6 342個(gè)OTU，其中僅出現(xiàn)一次的OTU有2 964個(gè)，占OTU總數(shù)的46.74%，擁有的序列數(shù)為18 755條，占總序列數(shù)的5.35%，而在8份酸黃皮樣品中均存在的OTU數(shù)為145個(gè)，占OTU總數(shù)的2.29%，擁有的序列數(shù)為232 593條，占總序列數(shù)的66.36%。由圖3亦可知，8個(gè)核心優(yōu)勢(shì)OTU分別隸屬于Proteobacteria的Ralstonia（OTU5087）和Burkholderia（OTU10290），隸屬于Firmicutes的Paenibacillus（OTU13645）、Bacillus（OTU15510）、Oceanobacillus（OTU15314）、Gracilibacillus（OTU2400）和Clostridium（OTU9917），隸屬于Acti nobacteria的Nocardia（OTU4677），平均相對(duì)含量分別為37.36%、3.15%、2.60%、2.24%、1.33%、1.51%、1.08%和1.02%。結(jié)合酸黃皮樣品中的核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬分析，發(fā)現(xiàn)Virgibacillus和Lactobacillus雖為酸黃皮樣品的核心細(xì)菌屬，但兩者在共有OTU中的相對(duì)含量均＜1.0%。由此可見，在酸黃皮樣品中存在大量的核心菌群，同時(shí)，由于開放式制作與發(fā)酵，不同樣品中亦存在獨(dú)特的細(xì)菌類群。

圖3 酸黃皮樣品中OTU出現(xiàn)次數(shù)及核心優(yōu)勢(shì)OTU平均相對(duì)含量分析結(jié)果Fig.3 Analysis results of OTU occurrence times and average relative contents of core dominant OTU in acidic Randia cochinchinensis samples

本研究進(jìn)一步根據(jù)核心優(yōu)勢(shì)OTU的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。

圖4 酸黃皮樣品中核心OTU的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of core OTU in acidic Randia cochinchinensis samples

由圖4可知，OTU15314與索氏海洋桿菌（Oceanobacillus sojae）在同一分枝，OTU2400與Gracilibacillus massiliensis聚為一類，OTU15510與阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）親緣關(guān)系較近，OTU13645與Paenibacillus xylanexedens聚為一類，OTU9917與糖丁基梭菌（Clostridium saccharobutylicum）聚為一類，OTU4677與產(chǎn)腔諾卡氏菌（Nocardia coeliaca）聚為一類，OTU5087與Ralstonia syzygii聚為一類，OTU10290與Burkholderia insulsa聚為一類。由此可見，在8個(gè)核心優(yōu)勢(shì)OTU中有50%被鑒定為芽孢桿菌，芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)具有廣譜殺菌活性，對(duì)食品中多種革蘭氏陰性菌和陽性菌均有較強(qiáng)的殺菌作用，可用于防止食品發(fā)酵過程中受到雜菌的污染，大量研究人員篩選對(duì)植物病原微生物、食源性病原微生物和腐敗微生物具有拮抗作用的芽孢桿菌，用作功能性食品的發(fā)酵劑，具有較好的市場(chǎng)前景[26]。

2.3 酸黃皮樣品中細(xì)菌序列基因潛在功能分析

使用PICRUSt軟件對(duì)酸黃皮樣品中細(xì)菌菌群的基因功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)所有序列共注釋到隸屬于23個(gè)功能大類的4 354個(gè)COG，本研究進(jìn)一步對(duì)廣西酸山黃皮中細(xì)菌序列潛在基因功能進(jìn)行分析，結(jié)果見圖5。

圖5 酸黃皮樣本細(xì)菌序列中的潛在功能基因及其相對(duì)含量分析結(jié)果Fig.5 Analysis results of potential functional genes and their relative contents in bacterial sequences of acidic Randia cochinchinensis samples

由圖5可知，酸黃皮樣品中細(xì)菌序列除具有較強(qiáng)的維持細(xì)胞生命活動(dòng)的基本功能外，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝功能、碳水化合物運(yùn)輸和代謝功能以及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝方面潛在功能占比相對(duì)較高，平均相對(duì)含量分別為8.71%、6.63%和3.78%。楊益林等[27]研究發(fā)現(xiàn)，山黃皮含有豐富的天冬氨酸、γ-氨基丁酸和丙氨酸等氨基酸，其中人體必需氨基酸的含量占游離氨基酸總量的3.46%，占水解氨基酸總量的12.75%，這可能是造成酸黃皮樣品中細(xì)菌氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝功能較強(qiáng)的原因。依據(jù)味感，氨基酸可分為酸味、甜味、苦味和鮮味氨基酸，其代謝物可作為食品風(fēng)味的前體物[28-29]，酸黃皮中與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝有關(guān)細(xì)菌序列占比較多，可促進(jìn)成品風(fēng)味形成。

3 結(jié)論

酸黃皮中細(xì)菌群落組成復(fù)雜，本研究從8份樣本中共檢測(cè)出隸屬于22個(gè)細(xì)菌門的593個(gè)屬，4個(gè)核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門分別為變形菌門（Proteobacteria）（49.75%）、硬壁菌門（Firmicutes）（41.15%）、放線菌門（Actinobacteria）（3.61%）和擬桿菌門（Bacteroidetes）（2.58%）；10個(gè)核心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬分別為羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）（38.77%）、芽孢桿菌屬（Bacillus）（8.36%）、伯克氏菌屬（Burkholderia）（4.44%）、大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）（4.13%）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）（4.00%）、梭菌屬（Clostridium）（3.15%）、纖細(xì)芽孢桿菌屬（Gracilibacillus）（3.05%）、枝芽孢菌屬（Virgibacillus）（2.25%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（1.40%）和諾卡氏菌屬（Nocardia）（1.03%），多數(shù)核心優(yōu)勢(shì)菌屬間正相關(guān)關(guān)系顯著，呈正向相互調(diào)節(jié)機(jī)制。酸黃皮中細(xì)菌序列除具有較強(qiáng)的維持細(xì)胞生命活動(dòng)的基本功能外，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝功能、碳水化合物運(yùn)輸和代謝功能以及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝方面潛在功能占比相對(duì)較高。