蔗糖磷酸化酶產生菌的篩選及其催化合成α-熊果苷條件優(yōu)化

陳顯玲，宋連萍，周燕妮，王海芳，譚夏云，蘇 龍，2*

（1.廣西科技師范學院 食品與生化工程學院，廣西 來賓 546119；2.廣西糖資源工程技術研究中心，廣西 來賓 546119）

甘蔗是世界上最重要的糖料和能源作物，廣西以其得天獨厚的地理區(qū)位優(yōu)勢和良好適宜的氣候條件，使其成為全球最適合甘蔗生長的地區(qū)之一[1]。廣西是我國最大的糖料蔗和蔗糖生產基地，產量連續(xù)十多年占全國的60%以上；其中2020～2021榨季，廣西糖料蔗種植面積74.3萬hm2，糖料蔗入榨量4 921萬t，產糖量628.79萬t[2]。然而，隨著世界經濟一體化的發(fā)展，蔗糖產業(yè)受國內和國際兩個市場的影響，以及淀粉糖的發(fā)展等因素，我國蔗糖產業(yè)競爭日趨劇烈。多年來，由于我國制糖企業(yè)產品單一，深加工和副產品利用少，蔗糖產業(yè)一直未成為高附加值產業(yè)，產業(yè)抗風險能力弱。利用酶催化轉化技術和微生物發(fā)酵技術拓寬蔗糖的應用范圍，生產高附加值產品，延伸蔗糖產業(yè)鏈成為研究熱點。

蔗糖磷酸化酶（EC2.4.1.7）屬于糖基水解酶13家族，催化蔗糖與磷酸進行反應[3]。蔗糖磷酸化酶能以蔗糖為主要底物，催化合成多種高附加值產品，如2-O-D-吡喃糖基-L-抗壞血酸[4]、甘油葡萄糖苷[5]、α-熊果苷[6]、寡糖曲二糖[7]、葡萄糖基阿洛酮糖[8]、葡萄糖基丙二醇[9]等。根據文獻報道該酶主要存在于腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）[10]、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）[11]、長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）[12]、變異鏈球菌（Streptococcus mutans）[13]等微生物中。

α-熊果苷除了作為一種國際通用的高效的安全美白增效劑外，還具有抑菌等作用，可用作抗炎藥物；還是一種新型燙傷藥的主要成分能夠快速止痛消除紅腫具有愈合快不留疤的特點；作為一種止咳藥可以祛痰、鎮(zhèn)咳、平喘等[14]。熊果苷的制備方法主要有植物提取法[15]、植物組織培養(yǎng)法[16]、化學合成法[17]、微生物細胞轉化法[18]和酶合成法[19]。而利用微生物來源的酶催化合成α-熊果苷是近年的研究熱點，如王秀捧等[20]進行了Xanthomonas maltophiliaBT-112菌體生物合成產物的條件研究，α-熊果苷轉化率高達86.7%；候顧偉等[21]利用腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）G123產生的蔗糖磷酸化酶催化合成α-熊果苷，產量達到20 g/L；魏盟[22]利用黃單胞菌液為催化反應體系，固定化對苯二酚為底物催化合成α-熊果苷，產物產量是底物未固定化前的1.75倍。雖然利用微生物來源的酶催化α-熊果苷的合成已有相關報道，產物產量較高，但原始菌株的酶活偏低，如能篩選到高產蔗糖磷酸化酶的微生物，提高酶催化合成α-熊果苷的轉化率，對α-熊果苷的進一步開發(fā)具有非常重要的意義。

本研究旨在從廣西來賓甘蔗地土壤中分離篩選蔗糖磷酸化酶的新產生菌，鑒定活性菌株并優(yōu)化其產酶條件，并將其應用在催化合成α-熊果苷中，可豐富蔗糖磷酸化酶的來源，為進一步研究以蔗糖為底物，利用蔗糖磷酸化酶生產α-熊果苷奠定基礎，拓寬蔗糖的應用范圍，提高蔗糖的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

玉米粉、黃豆粉：市售；蛋白胨、牛肉膏、酵母粉（均為生化試劑）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他試劑均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司；α-熊果苷標準品：合肥博美生物科技有限責任公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌株分離用PS培養(yǎng)基[23]：0.5 g蔗糖、0.02 g KH2PO4、0.61 g Na2HPO4、0.1 g NH4Cl、0.05 g MgSO4·7H2O、0.01 g酵母膏、0.5 mg高鐵檸檬酸銨和0.5 mg CaCl2，100 mL蒸餾水，pH7.0。

霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基：200.0 g馬鈴薯、20.0 g葡萄糖、1 000 mL蒸餾水，pH值自然。

1.2 儀器與設備

Tu21800紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；HH-s數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；FE20 Five Easy實驗室pH計、AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SPX-15OB-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選及鑒定（1）樣品預處理

取蔗糖富集的土壤1 g加入裝有9 mL的無菌生理鹽水中，制成10-1濃度的樣品液，振蕩混勻后逐級稀釋到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度，靜置備用。

（2）菌株分離和初篩

取后3個稀釋度，采用涂布法在PS培養(yǎng)基平板上進行菌種分離，在平板上劃線分離，反復純化，從而得到分離菌株的純培養(yǎng)物。平板置于4 ℃冰箱保存，備用。

（3）菌株復篩

將初篩得到的菌株接種到PS液體培養(yǎng)基或PDA液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，按照10%（V/V）的接種量將種子液接種到PS液體培養(yǎng)基或PDA液體培養(yǎng)基中，裝液量100 mL/250 mL，37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)72 h，10 000 r/min離心20 min，取上清液，參照1.3.2測定酶活。

（4）菌株鑒定

將篩選及純化好的菌種委托上海生工生物工程有限公司進行鑒定。

1.3.2 蔗糖磷酸化酶酶活測定

（1）果糖標準曲線繪制[24]

根據所獲得的不同果糖標準品質量濃度（x）的吸光度值（y），繪制果糖標準曲線。果糖標準曲線的線性回歸方程及相關系數(shù)為y=1.870 3x+0.032 7，R2=0.999 3，說明線性關系良好。

（2）蔗糖磷酸化酶酶活測定

參考文獻[25]，略有修改。反應體系：20%蔗糖溶液1mL，蔗糖磷酸化酶酶液或緩沖液（空白對照）100 μL，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）900 μL，30 ℃準確反應10 min后，立即加入3.0 mL 3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）沸水浴15 min，540 nm下測定吸光度值，計算反應液中生成果糖的含量（以空載為對照組，其他條件不變）。

酶活定義：將每分鐘水解蔗糖生成1 μmol的果糖所需酶量定義為蔗糖磷酸化酶的一個酶活力單位（U）。

1.3.3α-熊果苷標準曲線繪制及摩爾產率計算

（1）α-熊果苷標準曲線繪制

配制濃度為1%的α-熊果苷標準液，經紫外-可見分光光度計全波長掃描得α-熊果苷標準液的最大吸收峰為300 nm。配制質量濃度分別為0、0.02 g/L、0.04 g/L、0.06 g/L、0.08 g/L、0.10 g/L的熊果苷標準液，在波長300 nm下測量吸光度值并繪制標準曲線。α-熊果苷標準曲線的線性回歸方程及相關系數(shù)為y=7.5x+0.009 6、R2=0.999 6，說明該曲線線性關系良好。

（2）α-熊果苷摩爾產率的計算公式如下：

式中：M1是加入到反應液中氫醌的摩爾量；M2為生成α-熊果苷的摩爾量。

1.3.4 產酶條件的優(yōu)化

分別考察不同碳源（淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖）、不同蔗糖含量（3%、5%、7%、9%、11%）、不同氮源（黃豆粉、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、玉米粉）、不同酵母粉含量（3%、5%、7%、9%、11%）、不同初始pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）、不同接種量（6%、8%、10%、12%、14%）、不同發(fā)酵溫度（28 ℃、30 ℃、32 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃）、不同發(fā)酵時間（60 h、72 h、84 h、96 h、108 h）對蔗糖磷酸化酶酶活的影響。

1.3.5 響應面優(yōu)化設計

依據單因素試驗結果，選擇蔗糖添加量、蛋白胨添加量、接種量、pH、發(fā)酵時間為自變量，根據中心組合試驗設計（Box-Behnken）設計，進行5因素3水平的響應面分析試驗，以蔗糖磷酸化酶酶活為響應值，利用Design Expert 8.06軟件對數(shù)據進行分析，因素水平設計見表1。

表1 產酶條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface design for enzyme production conditions optimization

1.3.6α-熊果苷合成正交試驗設計

根據預試驗的結果，以α-熊果苷摩爾轉化率為評價指標，以酶添加量、氫醌添加量、反應pH、反應溫度為影響因素，以α-熊果苷摩爾轉化率為評價指標，進行4因素4水平正交試驗。

1.3.7 數(shù)據統(tǒng)計分析

本文作圖采用函數(shù)繪圖軟件（OriginPro 8.5），響應面分析設計采用Design Expert 8.0.6軟件；正交設計及數(shù)據分析采用正交設計助手ⅡV3.1專業(yè)版軟件。

2 結果與分析

2.1 產蔗糖磷酸化酶菌株分離及篩選結果

從甘蔗地土壤中共分離純化得到5株細菌，6株霉菌，編號分別為：細菌SLLSM1-SLLSM5，霉菌：XXMSM1-XXMSM6。接種發(fā)酵后測定11株菌株的蔗糖磷酸化酶活力，結果見圖1。由圖1可知，11株菌株中，菌株SLLSM2所產蔗糖磷酸化酶活力最高，為23.12 U/mL。因此，選取蔗糖磷酸化酶活力最高的菌株SLLSM2為目標菌株進行下一步優(yōu)化。

圖1 11株菌所產蔗糖磷酸化酶活力的測定結果Fig.1 Determination results of sucrose phosphorylase activity of 11 strains

2.2 產蔗糖磷酸化酶菌株鑒定

菌株SLLSM2的菌落形態(tài)及菌體形態(tài)見圖2。由圖2可知，菌株SLLSM2在分離培養(yǎng)基上生長迅速，37 ℃培養(yǎng)72 h，菌落直徑為3～4 cm，菌落呈白色，粗糙且邊緣不規(guī)則。

圖2 菌株SLLSM2的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain SLLSM2

將測定的菌株的16S rDNA序列用核酸比對軟件Blast與核酸序列數(shù)據庫Genebank中已報道的16S rDNA序列進行同源性比較發(fā)現(xiàn)，菌株的16S rDNA序列與在Genebank登記的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）的16S rDNA序列的同源性達到99%；選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA7.0軟件中的鄰接（neigh bor-joining，NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹[26]，結果見圖3。結果表明，菌株SLLSM2的序列同源性與Bacillus velezensis16S rDNA序列同源性達99%，因此確定該菌株為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

圖3 菌株SLLSM2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain SLLSM2

2.3 產酶條件單因素優(yōu)化結果

2.3.1 碳源對產酶的影響

以PS培養(yǎng)基為基礎，加入5%的不同碳源配制培養(yǎng)基，其他條件相同，接種發(fā)酵培養(yǎng)。按照1.3.2的方法測定酶活，以考察碳源對產酶的影響，結果見圖4。由圖4可知，當以淀粉、乳糖為碳源時，酶活力較低；以麥芽糖為單一碳源時，酶活力有較大的提高；而以蔗糖、葡萄糖為碳源時，酶活比其他碳源有大幅度的提高，其中蔗糖為碳源時所產酶活力在所選擇碳源中最高；因此采用蔗糖作為產酶的碳源。

圖4 不同碳源對蔗糖磷酸化酶酶活的影響Fig.4 Effect of different carbon source on sucrose phosphorylase activity

2.3.2 碳源添加量對產酶的影響

不同蔗糖添加量對產酶的影響見圖5。由圖5可知，當蔗糖在添加量低范圍時，隨著添加量的增加，所產酶活力逐漸提高，當用量達到7%時，酶活力達到最高，蔗糖用量再繼續(xù)增加，影響到培養(yǎng)環(huán)境中的滲透壓，抑制菌株的生長，酶活力逐漸降低；故本試驗選擇蔗糖最佳用量為7%。

圖5 不同蔗糖添加量對蔗糖磷酸化酶酶活的影響Fig.5 Effect of different sucrose addition on sucrose phosphorylase activity

2.3.3 氮源對產酶的影響

在確定最佳碳源及碳源添加量的基礎上，加入7%的不同氮源配制培養(yǎng)基，其他條件相同，接種發(fā)酵培養(yǎng)。按照1.3.2的方法測定酶活，以考察氮源對產酶的影響，結果見圖6。由圖6可知，當以玉米粉為單一氮源時，酶活力較低；以蛋白胨為氮源時，菌體生長較旺盛且重組酶的產量也達到較大值；故選擇蛋白胨作為氮源進行下一步實驗。

圖6 不同氮源對蔗糖磷酸化酶酶活的影響Fig.6 Effect of different nitrogen source on sucrose phosphorylase activity

2.3.4 氮源添加量對產酶的影響

不同蛋白胨添加量對產酶的影響見圖7。由圖7可知，菌株產酶活力隨蛋白胨添加量的增加先增加后減小。當?shù)鞍纂颂砑恿繛?%時，酶活力最大為98.70 U/mL。故選擇最佳蛋白胨添加量為9%。

圖7 不同蛋白胨添加量對蔗糖磷酸化酶酶活的影響Fig.7 Effect of different peptone addition on sucrose phosphorylase activity

2.3.5 初始pH值對產酶的影響

培養(yǎng)基的pH值的大小影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分解離，進而影響微生物細胞對營養(yǎng)物質的吸收利用，改變微生物代謝途徑和代謝產物的性質?？刂婆囵B(yǎng)基的pH值，對酶的產生和活力的大小都有影響，不同培養(yǎng)基pH值對產酶的影響見圖8。由圖8可知，蔗糖磷酸化酶的活力隨pH值增加，先增加后減小，當pH值為6時，酶活力達到最大值108.24 U/mL。故選擇最佳pH值為6。

圖8 不同pH值對蔗糖磷酸化酶酶活的影響Fig.8 Effect of different pH on sucrose phosphorylase activity

2.3.6 菌種接種量對產酶的影響

接種量的大小影響菌體的生長周期、代謝途徑和代謝產物的多少。不同接種量對蔗糖磷酸化酶活力的影響見圖9。結果表明，酶活大小隨著接種量的增加先升高后降低，接種量為10%時酶活力最大為97.98 U/mL，故選擇最佳接種量為10%。

圖9 不同接種量對蔗糖磷酸化酶酶活的影響Fig.9 Effect of different inoculum on sucrose phosphorylase activity

2.3.7 發(fā)酵溫度對產酶的影響

溫度是影響微生物生長和存活的主要環(huán)境因素之一，對發(fā)酵的影響很大。溫度的高低影響氧的溶解和傳遞速率、菌體生長和產物合成等。通過改變發(fā)酵溫度，其他條件相同，以考察發(fā)酵溫度對產酶的影響，結果見圖10。由圖10可知，37 ℃發(fā)酵時蔗糖磷酸化酶酶活最高，101.49 U/mL。28 ℃發(fā)酵時酶活最低，說明28 ℃時菌株生長緩慢，菌量比較少，分泌酶的量就相應少。溫度過高，雖然菌種生產速度加快，但也有可能營養(yǎng)成分消耗過快，導致酶分泌量下降；也可能溫度過高抑制了菌株的生長。故選擇37 ℃為發(fā)酵溫度。

圖10 發(fā)酵溫度對蔗糖磷酸化酶酶活的影響Fig.10 Effect of fermentation temperature on sucrose phosphorylase activity

2.3.8 發(fā)酵時間對產酶的影響

發(fā)酵時間對產酶的影響結果見圖11。由圖11可知，隨著發(fā)酵時間的延長，酶活逐漸提高，在接種發(fā)酵96 h時酶活最高；繼續(xù)延長發(fā)酵時間，酶活下降明顯。發(fā)酵時間不僅影響微生物的生長速率和生長量，且影響微生物的代謝強度和代謝物的多寡；菌種在繁殖初期數(shù)量少，之后大量繁殖，酶分泌量增加；發(fā)酵后期，營養(yǎng)成分逐漸降低，菌種自溶，酶分泌量下降，前期分泌的酶被自溶分泌的蛋白酶降解，酶活下降。故選擇最佳發(fā)酵時間為96 h。

圖11 發(fā)酵時間對蔗糖磷酸化酶酶活的影響Fig.11 Effect of fermentation time on sucrose phosphorylase activity

2.4 響應面優(yōu)化試驗

2.4.1 響應面試驗結果

綜合參考文獻[27]對該菌屬生長特性的描述，本研究響應面試驗方案及試驗結果見表2，回歸模型方差分析見表3。對表3中數(shù)據進行回歸擬合，得到自變量蔗糖添加量（A）、蛋白胨添加量（B）、pH值（C）、接種量（D）、發(fā)酵時間（E）與酶活（Y）的二次多項回歸方程為：

表2 產酶條件優(yōu)化響應面試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of response surface design for enzyme production conditions optimization

試驗的各因素方差分析如表3所示。由表3可知，該回歸模型P＜0.01，方程模型達到極顯著，失擬項P=0.249 6＞0.05，不顯著；該回歸模型的總決定系數(shù)R2=0.963 9，調整決定系數(shù)R2Adj=0.935 0，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=7.41%，以上參數(shù)均說明該模型擬合程度好，試驗誤差小，故該回歸方程模型成立，可以用此模型對蔗糖磷酸化酶產酶條件進行分析及預測。模型一次項A、B對結果影響極顯著（P＜0.01），C、D、E對結果影響不顯著（P＞0.05）；所有二次項處于極顯著水平（P＜0.01）；各交互項均不顯著（P＞0.05）。在各影響因素中，B（蛋白胨添加量）因素對蔗糖磷酸化酶的酶活的影響最大，其次是A（蔗糖添加量）、C（pH）、D（接種量）和發(fā)酵時間（E）。在總的作用因素中，一次項和平方項的影響較大，而交互項的影響較小。

表3 擬合二次多項式模型的方差分析Table 3 Variance analysis for fitting quadratic polynomial model

通過Design-Expert 8.0.6 Trial及回歸方程得出蔗糖磷酸化酶的產酶條件為：蔗糖添加量7.20%，蛋白胨添加量8.84%、接種量10.00%，pH值6.04，發(fā)酵時間96.01 h。在此條件下蔗糖磷酸化酶的酶活預測值為113.86 U/mL。

2.4.2 驗證試驗

為檢驗響應面法優(yōu)化后的工藝可靠性，在回歸模型求解方程并考慮實際操作的可行性，修正得出蔗糖磷酸化酶發(fā)酵的最佳條件為：蔗糖添加量7.5%，蛋白胨添加量9.0%、接種量10%，pH值6.0，發(fā)酵時間96 h，進行3組平行試驗，所得蔗糖磷酸化酶的酶活均值為120.07 U/mL，與理論預測值的相對誤差為5.45%，說明運用響應面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準確可靠，能真實地反應各因素對蔗糖磷酸化酶產酶發(fā)酵的影響。

2.5 α-熊果苷合成條件優(yōu)化正交試驗

通過參考文獻[28-30]可知，蔗糖磷酸化酶的在溫度20～65 ℃和在pH4.0～8.0范圍內具有較高的酶活，α-熊果苷蔗糖磷酸化酶催化合成的條件為：氫醌添加量1%～5%，反應pH3～8，反應時間8～36 h，結合預實驗的結果，α-熊果苷合成條件正交試驗方案及結果見表4，方差分析見表5。

表4 合成條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for synthetic conditions optimization

表5 正交試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal tests results

由表4的正交試驗極差值可知，對α-熊果苷合成影響因素的次序為B＞C＞A＞D，即底物氫醌濃度、反應溫度對α-熊果苷合成影響較大；酶添加量對α-熊果苷合成影響較小；pH對α-熊果苷合成的影響最小。由表5方差分析中可看出，因素B（氫醌添加量）對結果影響極顯著（P＜0.01），因素C（反應溫度）對結果影響顯著（P＜0.05），因素A（酶添加量）、因素D（pH）對結果影響不顯著（P＞0.05）。由表5可知，發(fā)酵條件最佳的組合為A2B3C3D3，即酶添加量150 U，氫醌添加量4%，反應溫度45 ℃，pH6.0。經驗證在最優(yōu)條件下，α-熊果苷合成轉化率最高，達44.09%。

2.6 討論

本研究通過單因素和響應面試驗法對自行篩選的貝萊斯芽孢桿菌菌株SLLSM2的產酶條件進行了初步的優(yōu)化，酶活比優(yōu)化前有大幅度的提升；也利用此酶進行了α-熊果苷催化合成條件的優(yōu)化。另外，進行α-熊果苷催化合成利用的是粗酶液，還酶液進行酶的純化及酶學性質的研究[23-24]，產物的結構還沒有進一步的確定；下一步的實驗計劃對該菌株的產酶條件進一步優(yōu)化，對該酶進行純化和酶學性質的研究；對催化合成α-熊果苷的結構進行分離純化及鑒定。

3 結論

本實驗從來賓甘蔗地土壤中分離篩選出一株能分泌蔗糖磷酸化酶的菌株SLLSM2，經過16S rDNA鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。通過對菌株的產酶條件進行優(yōu)化后，蔗糖磷酸化酶酶活為120.07 U/mL。利用此酶催化合成α-熊果苷，α-熊果苷合成轉化率為44.09%。該研究為蔗糖磷酸化酶酶制劑的工業(yè)化生產和α-熊果苷酶法合成提供新的候選菌株，并為蔗糖附加值的提高奠定基礎。