釀酒酵母蔗糖關(guān)鍵代謝途徑基因的敲除及其生長特性的變化分析

韓 麗，肖成志，韓丹亞，王麗嬌，何培新，2

（1.鄭州輕工業(yè)大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450066；2.鄭州輕工業(yè)大學 食品生產(chǎn)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450053）

蔗糖是一種可再生的低碳資源，可以從植物中獲得，如熱帶地區(qū)的甘蔗和溫帶地區(qū)的甜菜等[1]。由于蔗糖是一種低廉的碳源，且大部分的微生物都可以利用蔗糖作為碳源進行生長，因此，目前常利用微生物發(fā)酵蔗糖合成一些大眾化工品以及高附加值的化合物[2-3]，如乙醇、乙酸、丙酮酸、氨基酸以及一些萜烯類化合物等[4-6]。

目前，可利用蔗糖的微生物主要有大腸桿菌（Escherichia coli）、酵母菌（Saccharomyces）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等，大腸桿菌主要發(fā)酵蔗糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣[7]；酵母菌在工業(yè)上主要利用蔗糖生產(chǎn)乙醇[8]，枯草芽孢桿菌可發(fā)酵蔗糖產(chǎn)氨基酸等[9]，其中，能夠利用蔗糖快速生長的最主要的微生物是酵母菌[8]。酵母菌可通過蔗糖水解酶的作用，使蔗糖分解成葡萄糖和果糖，從而被利用，有報道證實酵母菌利用蔗糖的速度較其他微生物更快[8，10]。在酵母菌中，釀酒酵母（Sacchromyces cerevisiae）具有遺傳操作簡單、操作技術(shù)與方法更成熟、基因組小、研究方便等優(yōu)點[11]，其常被作為模式菌株來進行蔗糖消耗途徑的研究[12]。釀酒酵母以兩種形式來代謝利用蔗糖：一種是通過由Suc基因家族編碼的細胞外蔗糖轉(zhuǎn)化酶，其屬于β-半乳糖苷酶類蔗糖水解酶，被分泌到細胞外并將蔗糖水解成葡萄糖和果糖[8，13-14]；另一種形式是蔗糖可以通過質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運蛋白的作用進入細胞，并在胞質(zhì)溶膠中被釀酒酵母代謝麥芽糖的酶麥芽糖酶及胞內(nèi)的蔗糖轉(zhuǎn)化酶水解[8，15]。其中蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因Suc2[16-18]、麥芽糖滲透酶基因MALx1、麥芽糖酶基因MALx2以及一些調(diào)節(jié)基因MALx3是釀酒酵母中蔗糖消耗途徑中的關(guān)鍵基因[8]。有研究表明，除蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因Suc2外，釀酒酵母中的MAL12、MAL22以及MAL32基因主要參與蔗糖的水解，而MAL11、MAL21及MAL31等基因負責蔗糖的轉(zhuǎn)運，這些MAL基因在不同釀酒酵母菌株中的位置以及拷貝數(shù)不同[8，19]。有研究表明，同時敲除蔗糖的一些轉(zhuǎn)運蛋白基因及蔗糖水解酶類基因之后，酵母無法在以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上進行生長，而單純敲除Suc2基因，釀酒酵母可以繼續(xù)代謝蔗糖[8，16]。因此，在不敲除轉(zhuǎn)運蛋白基因的情況下，阻斷釀酒酵母中一些重要的蔗糖水解酶基因，其對釀酒酵母代謝蔗糖方面的影響還需進一步研究。同時，由于釀酒酵母中的重要水解酶基因MAL12、MAL22以及MAL32具有較高的同源性，其位于不同的染色體上，如何利用Crispr-Cas9的技術(shù)對其進行精確的敲除具有一定的研究價值及理論意義[20-21]。

因此，本研究以釀酒酵母IMX581為出發(fā)菌株，利用Crispr-Cas9基因編輯[22-23]的方法敲除其蔗糖消耗途徑中的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因Suc2和麥芽糖酶基因MAL32、MAL12、MAL22，并對其生長特性及蔗糖消耗情況進行分析，為后續(xù)在釀酒酵母中研究蔗糖代謝及調(diào)控提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及引物

本研究所用菌株見表1，引物均由江蘇金唯智生物科技有限公司合成，見表2。

表1 本研究所用的菌株Table 1 Strains used in the study

表2 本研究所用的引物Table 2 Primers used in the study

1.1.2 試劑

蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、氯化鈉（均為分析純或生化試劑）：上海生工生物工程有限公司；瓊脂糖（分析純）：北京全式金生物科技有限公司；無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）、尿嘧啶省卻培養(yǎng)物：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；尿嘧啶、乙酸鋰、聚乙二醇3350（均為分析純）：北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基[24]：酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，pH 7.0。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。固體培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂粉。

SC-Ura營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基[24]：YNB 6.7 g/L、尿嘧啶省卻培養(yǎng)物1.4 g/L、葡萄糖20 g/L、亮氨酸（10 g/L）10 mL/L、組氨酸（10 g/L）2 mL/L、色氨酸（10 g/L）2 mL/L，pH 7.0。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。固體培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂粉。

5-氟乳清酸（5-fluoroorotic acid，5-FOA）固體培養(yǎng)基[25]：YNB 6.9 g/L、尿嘧啶省卻培養(yǎng)物0.77 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉20 g/L、尿吡啶2 g/L、5-FOA 1 g/L，pH 7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

最小液體培養(yǎng)基[25]：（NH4）2SO47.5 g/L、KH2PO414.4 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、金屬溶液（乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraaceticacid，EDTA）15.0 g/L、ZnSO4·7H2O 0.45 g/L、MnCl2·2H2O 1 g/L、CoCl2·6H2O 0.3 g/L、CuSO4·5H2O 0.3 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.4 g/L、CaCl2·2H2O 0.45 g/L、FeSO4·7H2O 0.3 g/L、H3BO30.1 g/L、KI 0.1 g/L，pH 4.0）2 mL/L、維生素溶液（生物素0.05 g/L、對氨基苯甲酸0.2 g/L、煙酸1 g/L、泛酸鈣1 g/L、吡哆醇1 g/L、硫胺素1 g/L、肌醇25 g/L）1 mL/L。pH 6.5。121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。固體培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂粉。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1290高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫公司；DH-400型恒溫培養(yǎng)箱：上海鴻都電子科技有限公司；LX-C50立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋：合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；C1000梯度聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Bio-Rad公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度計：德國艾本德公司；SW-CJ-2D雙人超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；TGL-16G離心機：上海安亭科學儀器廠；DYCZ-24KF四板垂直電泳儀：北京六一生物科技有限公司；UV Bluestar A紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 釀酒酵母IMX581中蔗糖水解酶基因MAL32、MAL12、MAL22的分析

有文獻報道，釀酒酵母IMX581與釀酒酵母CEN.PK 113-7D的親緣關(guān)系最近[7，26]。因此，首先，在美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）中檢索釀酒酵母CEN.PK 113-7D的基因組序列。然后，結(jié)合文獻[25]報道的蔗糖水解酶基因MAL32、MAL12及MAL22在釀酒酵母CEN.PK 113-7D中的染色體序號，對釀酒酵母CEN.PK 113-7D的染色體基因序列分別檢索，確定MAL32、MAL12以及MAL22所在的位置及基因序列信息，并確定其左（起始密碼子前100 bp）右（終止密碼子后100 bp）邊界基因序列信息。最后，利用DNAMAN軟件對MAL32、MAL12以及MAL22基因序列以及其左右邊界基因序列進行比對，確定MAL32、MAL12以及MAL22基因序列以及其邊界基因序列的同源性。

1.3.2 基因敲除質(zhì)粒及repair片段的構(gòu)建

Suc2基因的敲除引導核糖核酸（ribose nucleic acid，RNA）序列（guideRNA，gRNA）及重組修復（repair）片段的設(shè)計主要根據(jù)參考文獻[22]進行。MAL32、MAL12及MAL22基因敲除guideRNA的設(shè)計則根據(jù)比對結(jié)果選取同源部分序列進行：采用網(wǎng)站（http：//www.e-crisp.org/E-CRISP/）設(shè)計gRNA序列，repair片段選取MAL32、MAL12及MAL22基因左右邊界同源部分進行設(shè)計，設(shè)計方法見圖1。

圖1 釀酒酵母IMX581中基因MAL12、MAL22及MAL32的guideRNA和repair片段的設(shè)計Fig.1 Design of guideRNA and repair fragments of gene MAL12,MAL22 and MAL32 of Saccharomyces cerevisiae IMX581

以實驗室保存的用于釀酒酵母基因敲除的質(zhì)粒ΔPex31-gRNA為模板，采用引物對gRNA-Suc2-R和pgRNAf1-F以及gRNA-Suc2-F和pgRNA-f1-R，通過PCR擴增得到Suc2基因敲除組件gRNA-Suc2-F1和gRNA-Suc2-F2，PCR產(chǎn)物通過膠回收試劑盒純化片段。通過Gibson組裝連接構(gòu)建質(zhì)粒gRNA-Suc2。

以ΔPex31-gRNA為模板，采用引物對gRNA-MAL-R和pgRNA-f1-F以及gRNA-MAL-F和pgRNA-f1-R，通過PCR擴增得到MAL基因敲除組件gRNA-MAL-F1和gRNA-MAL-F2，PCR產(chǎn)物通過膠回收試劑盒純化片段。通過Gibson組裝連接構(gòu)建質(zhì)粒gRNA-MAL。

通過NEBuilder HiFi DNA Assembly方法，將兩條互補的單鏈suc2-repair-FW和suc2-repair-RV以1∶1摩爾比混合，加熱到95 ℃，然后冷卻到室溫，合成suc2-repair片段。同理，將兩條互補的單鏈MAL-repair-FW和MAL-repair-RV以1∶1摩爾比混合，加熱到95 ℃，然后冷卻到室溫，合成MAL-repair片段。

1.3.3Suc2、MAL32、MAL12和MAL22基因的敲除

通過醋酸鋰化學轉(zhuǎn)化法[27]，將基因敲除質(zhì)粒gRNA-Suc2和Suc2-repair片段轉(zhuǎn)入釀酒酵母IMX581中，涂布于SC-Ura營養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)2 d。從中隨機挑選轉(zhuǎn)化子，提取基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），采用引物Suc2-dg-FW和Suc2-dg-RV進行PCR驗證。將驗證正確的菌株劃線于5-FOA固體培養(yǎng)基，30 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d，待培養(yǎng)基上出現(xiàn)單菌落，挑選單菌落于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12～16 h，提取基因組DNA進行陽性檢測。將鑒定正確的菌株IMX581ΔSuc2劃線于SC-Ura營養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)2 d沒有單菌落出現(xiàn)，說明質(zhì)粒gRNA-Suc2丟失成功。

將基因敲除質(zhì)粒gRNA-MAL和MAL-repair片段轉(zhuǎn)入釀酒酵母IMX581ΔSuc2中，涂布于SC-Ura營養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)2 d。從中隨機挑選轉(zhuǎn)化子，提取基因組DNA，采用引物對MAL-dg1-FW、MAL-dg1-RV和MAL-dg2-FW、MAL-dg2-RV進行PCR驗證。將驗證正確的菌株劃線于5-FOA固體培養(yǎng)基，30 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d，待培養(yǎng)基上出現(xiàn)單菌落，挑選單菌落于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)12～16 h，提基因組DNA進行陽性檢測。將鑒定正確的菌株IMX581ΔSuc2ΔMAL32ΔMAL12 ΔMAL22劃線于SC-Ura營養(yǎng)缺陷型固體培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)2 d沒有單菌落出現(xiàn)，說明質(zhì)粒gRNA-MAL丟失成功。

1.3.4 釀酒酵母生長特性的測定

將釀酒酵母IMX581、IMX581ΔSuc2和IMX581ΔSuc2 ΔMAL32ΔMAL12ΔMAL22劃線于YPD培養(yǎng)基，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)2～3 d，挑單菌落接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h。按初始OD600nm值為0.1的接種量接種到含20 g/L蔗糖（葡萄糖）、2 g/L尿嘧啶的最小液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，每隔4 h取樣，采用紫外可見分光光度計在波長600 nm處測定OD600nm值。以發(fā)酵時間（x）為橫坐標，OD600nm值（y）為縱坐標繪制生長曲線。

分別挑取釀酒酵母IMX581、IMX581ΔSuc2和IMX581 ΔSuc2ΔMAL32ΔMAL12ΔMAL22的單菌落接種于含20 g/L葡萄糖、2 g/L尿嘧啶的最小液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，得到3個菌株的種子液。將種子液按照10-1、10-2和10-3三個梯度進行稀釋，分別取1.5 μL點接到含20 g/L蔗糖（葡萄糖）、2 g/L尿嘧啶的最小固體培養(yǎng)基上，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h，觀察3個菌株在平板中的生長情況。

1.3.5 釀酒酵母中蔗糖消耗的測定

分別挑取釀酒酵母IMX581、IMX581ΔSuc2和IMX581 ΔSuc2ΔMAL32ΔMAL12ΔMAL22的單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)12～16 h，得到種子液。按照初始OD600nm值為0.1的接種量接種到含20 g/L葡萄糖、2 g/L尿嘧啶的最小液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h，再分別按照初始OD600nm值為0.1、5.0、10.0接種量接種到含20 g/L蔗糖、2 g/L尿嘧啶的最小液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，分別在發(fā)酵24 h、48 h、72 h和96 h取1 mL發(fā)酵液，8 000 r/min離心2 min，收集上清并過膜制備樣品。利用高效液相色譜分析樣品中蔗糖的含量[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母IMX581中蔗糖水解酶基因MAL32、MAL12、MAL22的分析

釀酒酵母IMX581中蔗糖水解酶基因MAL32、MAL12、MAL22的同源性比對結(jié)果見圖2。由圖2可知，MAL12、MAL22以及MAL32基因的同源性高達99%，3個基因的左右邊界基因序列同源性分別達99%、99.3%，因此，根據(jù)這3個基因的特點，按照圖1設(shè)計得到共同的gRNA引導序列（5'-TATAAGGAACTTATGATTTA-3'）以及repair片段序列（5'-TTAAGCAGTTTTTTTGATAATCTCAAATGTACATCAGTCAAGCGTAACTAAAATACATAAAATTAGTGCCGACTTTTTTTTAGCGCGTACTTTAACGAAATAACAGATGATTTTTCACAT-3'）。

圖2 釀酒酵母IMX581中基因MAL12、MAL22及MAL32的序列比對分析結(jié)果Fig.2 Sequence alignment analysis results of gene MAL12, MAL22 and MAL32 in Saccharomyces cerevisiae IMX581

2.2 Suc2、MAL32、MAL12及MAL22基因敲除菌株的構(gòu)建及其鑒定

Suc2及Suc2、MAL32、MAL12、MAL22基因敲除菌株IMX581ΔSuc2和IMX581ΔSuc2ΔMAL32ΔMAL12ΔMAL22的鑒定結(jié)果見圖3。

由圖3可知，未敲除Suc2基因的對照菌株IMX581的PCR擴增產(chǎn)物堿基長度為3 000 bp左右，而敲除Suc2基因的菌株IMX581ΔSuc2的PCR擴增產(chǎn)物堿基長度為900 bp左右；未敲除MAL32、MAL12及MAL22基因的對照菌株IMX581的PCR擴增產(chǎn)物堿基長度為3 000 bp左右，而敲除MAL32、MAL12及MAL22基因的工程菌株IMX581ΔSuc2 ΔMAL32ΔMAL12ΔMAL22的PCR擴增產(chǎn)物堿基長度為750 bp左右，結(jié)果表明，Suc2、MAL32、MAL22以及MAL12基因被敲除成功。

圖3 菌株IMX581ΔSuc2、IMX581ΔSuc2ΔMAL32ΔMAL12ΔMAL22的PCR驗證結(jié)果Fig.3 PCR identification results of strains IMX581ΔSuc2 and IMX581ΔSuc2ΔMAL32ΔMAL12ΔMAL22

2.3 菌株IMX581、IMX581ΔSuc2及IMX581ΔSuc2ΔMAL32 ΔMAL12ΔMAL22的生長情況分析

菌株IMX581、IMX581ΔSuc2和IMX581ΔSuc2ΔMAL32 ΔMAL12ΔMAL22在以葡萄糖或蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中的生長情況見圖4。

由圖4可知，以葡萄糖為唯一碳源進行培養(yǎng)時，菌株IMX581、IMX581ΔSuc2和IMX581ΔSuc2ΔMAL32ΔMAL12 ΔMAL22均可以生長，但是敲除Suc2基因后，釀酒酵母的生長明顯受到限制，進一步敲除MAL32、MAL12以及MAL22基因后，釀酒酵母的生長速率明顯降低，且平穩(wěn)期OD600nm值只有4.4。此外，當以蔗糖為唯一碳源對各菌株進行培養(yǎng)時，菌株IMX581ΔSuc2ΔMAL32ΔMAL12ΔMAL22幾乎不生長，而菌株IMX581ΔSuc2在前12 h生長緩慢，之后進入指數(shù)生長期，平穩(wěn)期的OD600nm值可達4.3，但其與對照菌株IMX581相比，生長受到較明顯的影響。為了進一步觀察3個菌株在以葡萄糖或蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上的生長情況，選擇在最小固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，結(jié)果表明，在以葡萄糖為唯一碳源的最小固體培養(yǎng)基中，菌株IMX581 ΔSuc2ΔMAL32ΔMAL12ΔMAL22的生長明顯受到影響，而單獨敲除Suc2基因的菌株IMX581ΔSuc2的生長影響較?。辉谝哉崽菫槲ㄒ惶荚吹淖钚」腆w培養(yǎng)基中，菌株IMX581 ΔSuc2ΔMAL32ΔMAL12ΔMAL22幾乎不生長，而敲除Suc2基因的菌株IMX581ΔSuc2相比之下受到的影響較小。結(jié)果表明，敲除Suc2、MAL32、MAL12以及MAL22基因后，釀酒酵母IMX581ΔSuc2ΔMAL32ΔMAL12ΔMAL22消耗蔗糖的途徑大部分被阻斷，而釀酒酵母IMX581ΔSuc2利用蔗糖的能力受到一定影響，但仍然可以利用蔗糖。

為進一步驗證敲除不同蔗糖消耗途徑中的基因?qū)τ诮湍咐谜崽堑挠绊?，考察不同初始OD600nm值條件下各釀酒酵母菌株對20 g/L蔗糖的消耗情況，結(jié)果見圖5。由圖5可知，當初始OD600nm值為0.1時，培養(yǎng)72 h后，菌株IMX581 ΔSuc2、IMX581ΔSuc2ΔMAL32ΔMAL12ΔMAL22的蔗糖消耗率分別為28.5%、7.0%，而對照菌株IMX581消耗蔗糖的速度較快，24 h已經(jīng)全部消耗完。而當初始OD600nm值提高到5.0時，菌株IMX581ΔSuc2和IMX581ΔSuc2ΔMAL32 ΔMAL12ΔMAL22消耗蔗糖的能力都比之前有所增加，培養(yǎng)72h后，蔗糖消耗率分別為35.5%、18.5%，對照菌株IMX581培養(yǎng)12 h就可以完全消耗蔗糖。繼續(xù)提高初始OD600nm值到10.0時，其結(jié)果與初始OD600nm值為5.0時各菌株消耗蔗糖的情況相似，菌株IMX581ΔSuc2和IMX581ΔSuc2ΔMAL32 ΔMAL12ΔMAL22在培養(yǎng)72 h后，蔗糖消耗率分別為38.5%、23.0%。結(jié)果表明，釀酒酵母IMX581只敲除Suc2基因仍可進行部分蔗糖的利用，而敲除Suc2、MAL32、MAL12、MAL22基因的酵母在低濃度培養(yǎng)時幾乎不消耗蔗糖，而高濃度培養(yǎng)時可以進行部分蔗糖的消耗，這可能是高濃度培養(yǎng)條件下，酵母體內(nèi)基因的表達量增加，個別受蔗糖調(diào)控的基因表達之后而參與了部分蔗糖的分解，這與于平等[9]對MAL11和MAL12基因的馴化實驗結(jié)果相一致。研究不同初始OD600nm值條件下各釀酒酵母菌株對20 g/L蔗糖的消耗情況，有助于為以釀酒酵母為宿主細胞進行生物轉(zhuǎn)化蔗糖從而合成蔗糖基化合物提供理論基礎(chǔ)。

圖5 不同初始OD600nm值條件下菌株IMX581、IMX581ΔSuc2和IMX581ΔSuc2ΔMAL32ΔMAL12ΔMAL22對蔗糖的消耗情況Fig.5 Sucrose consumption by strains IMX581,IMX581ΔSuc2 and IMX581ΔSuc2ΔMAL32ΔMAL12ΔMAL22 under different initial OD600nm value

3 結(jié)論

本研究通過Crispr-Cas9基因編輯的方法，對釀酒酵母IMX581的蔗糖代謝途徑進行改造，敲除了與蔗糖水解相關(guān)的4個基因，成功構(gòu)建了菌株IMX581ΔSuc2和IMX581ΔSuc2 ΔMAL32ΔMAL12ΔMAL22。當初始OD600nm值為0.1時，菌株IMX581ΔSuc2在以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上仍能夠生長，但培養(yǎng)56 h時，OD600nm值是出發(fā)菌株IMX581的52%；而菌株IMX581ΔSuc2ΔMAL32ΔMAL12ΔMAL22幾乎不能生長。同時，進一步考察不同初始OD600nm值（0.1、5.0、10.0）條件下菌株IMX581ΔSuc2和IMX581ΔSuc2ΔMAL32ΔMAL12 ΔMAL22對蔗糖的消耗情況，發(fā)現(xiàn)菌株IMX581ΔSuc2和IMX581ΔSuc2ΔMAL32ΔMAL12ΔMAL22的蔗糖消耗率較出發(fā)菌株IMX581均顯著降低，培養(yǎng)72 h后，蔗糖消耗率分別為28.5%、35.5%、38.5%和7.0%、18.4%、22.5%?？梢缘贸鼍闕MX581只敲除Suc2基因后，在低濃度接種條件下，仍可消耗部分蔗糖；敲除Suc2、MAL32、MAL12和MAL22四個基因后，在低濃度接種條件下，幾乎不消耗蔗糖。而高濃度接種條件下，酵母體內(nèi)基因的表達量增加，個別受蔗糖調(diào)控的基因表達之后而參與了部分蔗糖的分解?？傮w而言，敲除Suc2、MAL32、MAL12和MAL22四個基因，可使釀酒酵母幾乎不能利用蔗糖，這為后續(xù)釀酒酵母利用蔗糖轉(zhuǎn)化合成一些新的化合物奠定基礎(chǔ)。