體外評估乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7免疫調節(jié)作用的影響

葉望娟，周佳豪，劉成國，羅 潔，張 鋒，唐 霞，周 輝*

（1.湖南農業(yè)大學 食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.皇氏集團湖南優(yōu)氏乳業(yè)有限公司，湖南 長沙 410205）

巨噬細胞是由外周血單核細胞分化而來的重要的免疫效應細胞，其在先天和獲得性免疫應答中發(fā)揮關鍵作用，可以通過吞噬、細胞毒性和細胞內防御能力識別和消除病原體[1-3]。巨噬細胞既分泌促炎細胞因子（腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6），又分泌抗炎細胞因子（轉化生長因子-α（transforming growth factor-α，TGF-α）和IL-10），在免疫應答過程中扮演多種角色[4-7]。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是指一類能在可利用的碳水化合物發(fā)酵過程中產生乳酸的細菌[8]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)乳酸菌具有多種益生特性，如免疫調節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、降膽固醇等[9-11]。有研究表明，乳酸菌能通過誘導增強單核細胞和巨噬細胞的活性、提高活性氧、活性氮含量和吞噬能力，也能通過巨噬細胞抗原加工并遞呈至T、B淋巴細胞，引起體液免疫和細胞免疫，從而調節(jié)機體的非特異性和特異性免疫功能[12-14]。BISWARANJAN P等[15]研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）MTCC-10307和克勞斯芽孢桿菌（Bacillus clausii）MTCC-8326在調節(jié)小鼠巨噬細胞的天然免疫反應和保護細胞免受鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）誘導的細胞毒性方面表現(xiàn)出顯著的作用；蒙月月等[16]通過小鼠脾淋巴細胞和巨噬細胞體外評估10株乳桿菌對免疫細胞活性的影響，結果表明植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）KLDS 1.0318具有較高的免疫調節(jié)活性。然而，不同的益生菌菌株調節(jié)免疫細胞的能力不同[17-19]。

因此，本研究以商業(yè)菌株鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus）LGG為陽性對照菌株，體外評估本實驗室保藏的5株乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7細胞活性、吞噬活性以及炎癥因子釋放水平的影響，篩選具有良好免疫調節(jié)作用的乳桿菌，以期為后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)支持和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與細胞

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）12E、植物乳桿菌（L.plantarum）15E、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）24E、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）260、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）83：由湖南農業(yè)大學食品科技學院乳品加工實驗室分離保存；鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamno sus）LGG（ATCC53103）：本實驗室保存；巨噬細胞RAW264.7（ATCC TIB-71）：長沙隆和化玻實驗用品有限公司。

1.1.2 試劑

TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒：廈門侖昌碩生物科技有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒：美國Promega公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）：美國Sigma公司；胎牛血清、胰蛋白酶溶液：以色列貝特哈梅克生物工業(yè)公司；超高靈敏細胞增殖CCK-8試劑盒：上海尚寶生物科技有限公司;乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性檢測試劑盒：北京普利萊基因技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM）：以色列貝特哈梅克生物工業(yè)公司。

1.2 儀器與設備

GZ-400-S恒溫培養(yǎng)箱：韶關市廣智科技設備有限公司；Multiskan GO全波長酶標儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺：蘇州凈化限公司；BKQ-B50II全自動高壓蒸汽滅菌鍋：山東博科科學儀器有限公司；HH-601超級恒溫水浴鍋：常州市萬豐儀器制造有限公司；HR/T16M臺式高速冷凍離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；HF90二氧化碳培養(yǎng)箱：力康生物醫(yī)療科技控股有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳桿菌菌懸液的制備

將甘油管中保存的受試菌株及商業(yè)菌株鼠李糖乳桿菌LGG（陽性對照菌）接種于1 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，活化2代。將活化2代后的菌株接種至5 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，菌體濃度為106CFU/mL，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min條件下離心2 min，棄上清，將菌體沉淀用無菌生理鹽水洗滌兩次后于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中重懸，調整菌體濃度為1×108CFU/mL，備用。

1.3.2 巨噬細胞RAW264.7的培養(yǎng)

將細胞復蘇后，置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)；當細胞長至80%～90%融合時，采用磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2～3次，加入1 mL胰蛋白酶溶液進行消化，加入1 mL DMEM培養(yǎng)基終止消化；消化液于800 r/min條件下離心5 min，棄掉上清液，加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞后分裝，每瓶1 mL；每瓶加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下傳代培養(yǎng)，傳至3～4代時，800 r/min離心5 min，棄掉上清液，重懸細胞；使用血球計數(shù)板計數(shù)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調整細胞濃度為1×106個/mL備用[20]。

1.3.3 巨噬細胞RAW264.7細胞活性的測定

巨噬細胞RAW264.7的處理：參考文獻[21-22]稍作修改。將巨噬細胞RAW264.7接種于96孔板，每孔細胞懸液（細胞濃度為1×104個/mL）100 μL。37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，細胞貼壁生長，棄培養(yǎng)液。設空白調零組（加100 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于空白孔中）、乳酸菌調零組（加菌體濃度分別為1×104CFU/mL、1×105CFU/mL和1×106CFU/mL菌懸液100 μL于空白孔中）、陰性對照組（加100 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于細胞貼壁孔中）、陽性對照組（加100 μL含1 μg/mL LPS、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于細胞貼壁孔中）和實驗組（分別加100 μL菌體濃度為1×104CFU/mL、1×105CFU/mL和1×106CFU/mL的菌懸液于細胞貼壁孔中，即使不同乳酸菌菌體濃度與初始細胞濃度以1∶1、10∶1、100∶1的比例共培養(yǎng)），每組6個副孔，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h。

巨噬細胞RAW264.7細胞增殖率的測定：采用超高靈敏細胞增殖CCK-8試劑盒測定細胞增殖率，向每孔中加入CCK-8溶液10 μL，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4 h；充分混勻后用酶標儀測定其在波長490 nm處的光密度值（optical density，OD490nm），并計算巨噬細胞RAW264.7的細胞增殖率，其計算公式如下：

式中：OD1為陰性對照組的OD490nm值；OD2為乳酸菌調零組的OD490nm值；OD3為實驗組的OD490nm值；OD4為空白調零組的OD490nm值。

乳酸脫氫酶活性的測定：采用LDH活性檢測試劑盒測定培養(yǎng)上清液的LDH活性，反應細胞膜的完整性。

1.3.4 巨噬細胞RAW264.7吞噬活性測定

參考占萌[20]的方法稍作修改。設陰性對照組、陽性對照組和實驗組，按方法1.3.3處理巨噬細胞RAW264.7，培養(yǎng)12 h后，加0.072%中性紅液100 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)30 min后棄去中性紅，PBS洗滌2次，每孔加入細胞裂解液（乙醇∶乙酸=1∶1，V/V）100 μL，放置4 ℃冰箱過夜，細胞完全溶解后，采用酶標儀測定波長540 nm處的光密度值，計算吞噬活性，其計算公式如下：

式中：OD1為陰性對照組的OD540nm值；OD2為實驗組的OD540nm值。

1.3.5 巨噬細胞RAW264.7分泌NO、IL-10和TNF-α能力的測定

將巨噬細胞RAW264.7接種于24孔板，每孔細胞懸液（細胞濃度為5×105個/mL）1 mL，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)18 h，細胞貼壁生長，棄培養(yǎng)液，設陰性對照組（加1 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于細胞貼壁孔中）、陽性對照組（加1 mL含1 μg/mL LPS、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于細胞貼壁孔中）和實驗組（分別加1 mL菌體濃度為5×105CFU/mL、5×106CFU/mL和5×107CFU/mL菌懸液于細胞貼壁孔中，即使不同乳酸菌菌體濃度與初始細胞濃度以1∶1、10∶1、100∶1的比例共培養(yǎng)），每組4個副孔，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)液于4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min，收集細胞上清液，采用試劑盒測定共培養(yǎng)上清液中NO、IL-10和TNF-α的含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計分析，以SPSS Statistics 21.0進行方差分析（analysis of variance，ANOVA）；使用Origin 2021軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7細胞活性的影響

2.1.1 乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7增殖的影響

由圖1可知，與陰性對照組相比，陽性對照組巨噬細胞RAW264.7的增殖率[（163.24±4.28）%]顯著升高（P＜0.05）；不同乳桿菌均可在一定程度上誘導巨噬細胞RAW264.7的體外增殖，但對細胞刺激增殖能力表現(xiàn)出菌株差異性，不同乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7的增殖率范圍為82%～253%。與陰性對照組相比，當乳桿菌活菌數(shù)與初始細胞濃度的比例為1∶1時，干酪乳桿菌83能顯著促進巨噬細胞RAW264.7的增殖（P＜0.05），細胞增殖率為（165.98±5.03）%；當乳桿菌活菌數(shù)與初始細胞濃度的比例為10∶1時，干酪乳桿菌83、鼠李糖乳桿菌260及鼠李糖乳桿菌LGG均能顯著促進巨噬細胞RAW264.7的增殖（P＜0.05），細胞增殖率分別為（161.41±18.14）%、（160.92±22.99）%、（204.47±32.96）%；當乳桿菌活菌數(shù)與初始細胞濃度的比例為100∶1時，干酪乳桿菌83、鼠李糖乳桿菌260、植物乳桿菌12E及鼠李糖乳桿菌LGG均能顯著促進巨噬細胞RAW264.7的增殖（P＜0.05），其中，鼠李糖乳桿菌LGG對巨噬細胞RAW264.7的增殖效果最好，細胞增殖率為（253.20±30.00）%，其次為鼠李糖乳桿菌260，細胞增殖率為（196.62±14.76）%。與陽性對照組相比，僅有鼠李糖乳桿菌LGG菌體濃度與初始細胞濃度為100∶1時，細胞增殖率顯著升高（P＜0.05）。

圖1 不同乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7增殖的影響Fig.1 Effect of different Lactobacillus on the proliferation of macrophages RAW264.7

2.1.2 乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7乳酸脫氫酶釋放量的影響

由圖2可知，與陰性對照組相比，陽性對照組能顯著降低巨噬細胞RAW264.7的LDH釋放量（P＜0.05），LDH釋放量為（854.72±2.57）U/100 mL；不同乳桿菌均可在一定程度上抑制巨噬細胞RAW264.7釋放LDH，不同乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7的LDH釋放量范圍為554～1 084 U/100 mL。與陰性對照組相比，當乳桿菌活菌數(shù)與初始細胞濃度的比例為1∶1時，鼠李糖乳桿菌260和鼠李糖乳桿菌LGG均能顯著降低巨噬細胞RAW264.7的LDH釋放量（P＜0.05），LDH釋放量分別為（829.89±8.67）U/100 mL、（865.33±9.90）U/100 mL；當乳桿菌活菌數(shù)與初始細胞濃度的比例為10∶1時，干酪乳桿菌83、鼠李糖乳桿菌260和鼠李糖乳桿菌LGG均能顯著降低巨噬細胞RAW264.7的LDH釋放量（P＜0.05），其中鼠李糖乳桿菌LGG降低效果最好，LDH釋放量為（832.78±27.71）U/100 mL，其次為鼠李糖乳桿菌260，LDH釋放量為（829.70±10.41）U/100 mL；當乳桿菌活菌數(shù)與初始細胞濃度的比例為100∶1時，除短乳桿菌24E外，其余菌株均能顯著降低巨噬細胞RAW264.7的LDH釋放量（P＜0.05），其中鼠李糖乳桿菌260降低效果最好，LDH釋放量為（554.36±6.74）U/100 mL，其次為植物乳桿菌15E，LDH釋放量為（765.13±8.62）U/100 mL。短乳桿菌24E和在低濃度情況下的干酪乳桿菌83、植物乳桿菌12E與巨噬細胞RAW264.7共培養(yǎng)后，LDH釋放量均有不同程度的升高，分析原因可能是乳桿菌使巨噬細胞RAW264.7的細胞膜損傷，LDH大量釋放至胞外[23-25]。與陽性對照組相比，僅有鼠李糖乳桿菌260菌體濃度與初始細胞濃度為100∶1時，巨噬細胞RAW264.7的LDH釋放量顯著降低（P＜0.05）。

圖2 不同乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7乳酸脫氫酶釋放量的影響Fig.2 Effect of different Lactobacillus on the release amount of lactate dehydrogenase from macrophages RAW264.7

2.2 乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7吞噬活性的影響

由圖3可知，與陰性對照組相比，陽性對照組巨噬細胞RAW264.7的吞噬活性顯著提高（P＜0.05），吞噬活性為（134.12±1.52）%；不同乳桿菌均可在一定程度上提高巨噬細胞RAW264.7的吞噬活性，且具有劑量依賴性，隨著乳桿菌活菌數(shù)的增加，巨噬細胞RAW264.7的吞噬活性也隨之增大，吞噬活性在105%～184%范圍內。與陰性對照組相比，當乳桿菌活菌數(shù)與初始細胞濃度的比例為10∶1時，鼠李糖乳桿菌260及鼠李糖乳桿菌LGG均能顯著提高巨噬細胞RAW264.7的吞噬活性（P＜0.05），吞噬活性分別為（128.78±3.19）%、（183.79±20.63）%；當乳桿菌活菌數(shù)與初始細胞濃度的比例為100∶1時，干酪乳桿菌83、鼠李糖乳桿菌260、植物乳桿菌12E及鼠李糖乳桿菌LGG均能顯著提高巨噬細胞RAW264.7的吞噬活性（P＜0.05），其中，鼠李糖乳桿菌LGG對提高巨噬細胞RAW264.7的吞噬活性效果最好，吞噬活性為（158.50±24.74）%，其次為鼠李糖乳桿菌260，吞噬活性為（136.86%±7.82）U/100 mL。與陽性對照組相比，僅有鼠李糖乳桿菌LGG菌體濃度與初始細胞濃度分別為10∶1和100∶1時，吞噬活性顯著提高（P＜0.05）。

圖3 不同乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7吞噬活性的影響Fig.3 Effect of different Lactobacillus on the phagocytic activity of macrophages RAW264.7

2.3 乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7分泌NO水平的影響

由圖4可知，與陰性對照組相比，陽性對照組巨噬細胞RAW264.7的NO分泌量顯著提高（P＜0.05），NO分泌量為（28.39±1.05）μmol/L；不同乳桿菌均能在一定程度上提高巨噬細胞RAW264.7的NO分泌量，但作用效果均顯著低于陽性對照組（P＜0.05），且有明顯的菌株依賴性，NO分泌量在2.07～14.65 μmol/L范圍內。與陰性對照組相比，當乳桿菌活菌數(shù)與初始細胞濃度的比例為1∶1時，干酪乳桿菌83、鼠李糖乳桿菌260和鼠李糖乳桿菌LGG均能顯著提高巨噬細胞RAW264.7的NO分泌量（P＜0.05），其中鼠李糖乳桿菌LGG效果最好，NO分泌量為（14.65±0.27）μmol/L；當乳桿菌活菌數(shù)與初始細胞濃度的比例為10∶1時，干酪乳桿菌83、植物乳桿菌12E和植物乳桿菌15E均能顯著提高巨噬細胞RAW264.7的NO分泌量（P＜0.05），其中干酪乳桿菌83效果最好，NO分泌量為（16.22±0.87）μmol/L；當乳桿菌活菌數(shù)與初始細胞濃度的比例為100∶1時，僅有短乳桿菌24E能顯著提高巨噬細胞RAW264.7的NO分泌量（P＜0.05），NO分泌量為（5.88±0.82）μmol/L。

圖4 不同乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7分泌NO水平的影響Fig.4 Effect of different Lactobacillus on the NO secretion level of macrophages RAW264.7

2.4 乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7分泌IL-10和TNF-α水平的影響

由圖5可知，與陰性對照組相比，陽性對照組巨噬細胞RAW264.7的IL-10、TNF-α分泌量均顯著提高（P＜0.05），分別為（11.85±0.22）pg/mL、（80.25±1.64）pg/mL。不同乳桿菌均能在一定程度上提高巨噬細胞RAW264.7的IL-10、TNF-α分泌量水平，作用效果有明顯的菌株依賴性，且部分菌株在特定濃度下的作用效果高于陽性對照組，IL-10、TNF-α分泌量分別在7.08～18.34 pg/mL、32.38～62.38 pg/mL范圍內。其中，植物乳桿菌12E對提高巨噬細胞RAW264.7的IL-10分泌量的作用效果最好，當乳桿菌活菌數(shù)與初始細胞的比例為1∶1時，IL-10分泌量最高為（18.34±0.55）pg/mL；干酪乳桿菌83對提高巨噬細胞RAW264.7的TNF-α分泌量的作用效果最好，當乳桿菌活菌數(shù)與初始細胞濃度的比例為100∶1時，TNF-α分泌量最高為（63.37±1.2）pg/mL，在此濃度下，兩菌株的作用效果均顯著高于陽性對照組（P＜0.05）。此外，鼠李糖乳桿菌260、鼠李糖乳桿菌LGG、植物乳桿菌12E和植物乳桿菌15E均能同時促進IL-10和TNF-α的分泌，更有利于維持免疫平衡。

圖5 不同乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7分泌IL-10（a）及TNF-α（b）水平的影響Fig.5 Effect of different Lactobacillus on the IL-10 (a) and TNF-α (b)secretion level of macrophages RAW264.7

3 結論

本研究通過研究不同乳桿菌對巨噬細胞RAW264.7細胞活性、吞噬活性以及NO、IL-10和TNF-α分泌水平的影響發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌83、鼠李糖乳桿菌260和鼠李糖乳桿菌LGG在高濃度情況下能顯著提高巨噬細胞RAW264.7細胞增殖和吞噬活性以及維持細胞膜完整性（P＜0.05）；所有乳桿菌在特定濃度下均能提高巨噬細胞RAW264.7的NO分泌量；鼠李糖乳桿菌260、鼠李糖乳桿菌LGG、植物乳桿菌12E和植物乳桿菌15E在各濃度情況下均能促進IL-10和TNF-α的分泌。綜合而言，鼠李糖乳桿菌260具有更優(yōu)的免疫調節(jié)潛力。