HPLC-DAD-ELSD法同時(shí)測(cè)定養(yǎng)心氏片中11個(gè)成分的含量

蔡睿婧，陸 黎璟

（南京市中醫(yī)院 藥劑科，江蘇 南京 210000）

養(yǎng)心氏片源于著名中醫(yī)周次清的臨床經(jīng)驗(yàn)方，現(xiàn)收載于《中華人民共和國(guó)藥典》2020版一部，是由黃芪、人參、淫羊霍、黨參、丹參、葛根、山楂、地黃、當(dāng)歸、黃連、醋延胡索、靈芝和炙甘草組成的復(fù)方制劑。養(yǎng)心氏片具有扶正固本，益氣活血，行脈止痛的功效，用于氣虛血瘀型冠心病、心絞痛、心肌梗塞及合并高血脂、高血糖等癥見(jiàn)有上述證候者，是治療氣虛血瘀所致胸痹心痛的有效藥物[1]。有研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)心氏片可通過(guò)升高血清和海馬中5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NA）、多巴胺（DA）的水平，改善和緩解慢性不可預(yù)知的刺激性抑郁及缺血再灌注誘導(dǎo)的血管性抑郁癥狀[2]。

現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅以黃芪中的黃芪甲苷為定量指標(biāo)評(píng)價(jià)養(yǎng)心氏片，指標(biāo)較為單一，未對(duì)主藥人參、丹參、葛根等其他成分進(jìn)行定量控制，無(wú)法完整準(zhǔn)確地反映中藥制劑的復(fù)雜性和多樣性，且養(yǎng)心氏片具有“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的特點(diǎn)，因此建立符合中藥配伍理論，能有效檢測(cè)多成分含量的質(zhì)量控制方法是有必要的。已有文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定養(yǎng)心氏片中葛根素、大豆苷、丹參素、蘆丁、延胡索乙素、淫羊藿苷、芹菜素、人參皂苷Rd、阿魏酸的含量[3-4]，君藥人參中的皂苷類成分的含量測(cè)定尚未報(bào)道。本研究采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)-蒸發(fā)光散射檢測(cè)（HPLC-DAD-ELSD）串聯(lián)法，同時(shí)測(cè)定黃芪中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷，人參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1，丹參中丹酚酸B，淫羊藿中淫羊藿苷，葛根中葛根素，黃連中鹽酸小檗堿，當(dāng)歸中阿魏酸，延胡索中延胡索乙素11個(gè)指標(biāo)性成分，從而更加全面地控制養(yǎng)心氏片的質(zhì)量，為該制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)和作用機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

賽默飛DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀（包括四元高壓溶劑梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、Chromeleon?Dionex色譜工作站、Alltech 3300 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、二極管陣列檢測(cè)器）；ABS-135S型電子天平（d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司）；KQ-500E型數(shù)據(jù)超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品：毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)：111920-201606，含量：97.6 %），黃芪甲苷（批號(hào)：110781-201717，含量：96.9 %），葛根素（批號(hào)：110752-201816，含量：95.4 %），鹽酸小檗堿（批號(hào)：110713-202015，含量：85.9 %），阿魏酸（批號(hào)：110773-201614，含量：99.0 %），丹酚酸B（批號(hào)：111562-201917，含量：96.6 %），淫羊藿苷（批號(hào)：110737-202017，含量：98.1 %），延胡索乙素（批號(hào)：110726-201819，含量：99.8 %），人參皂苷Rg1（批號(hào)：110703-201933，含量：93.4 %），人參皂苷Re（批號(hào)：110754-202028，含量：93.9 %），人參皂苷Rb1（批號(hào)：110704-202028，含量：93.1 %），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；養(yǎng)心氏片11批（S1～S11，批號(hào)分別為181021，190311，190404，190417，190723，190811，191102，191224，200314，200415，200409，上海醫(yī)藥集團(tuán)青島國(guó)風(fēng)藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格為0.3 g/片）；甲醇、乙腈均為色譜純（德國(guó)默克公司），其他試劑均為分析純，水為超純水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Sunfire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1 %甲酸水溶液，梯度洗脫（0～5 min，8 %A；5～10 min，8 %→20 %A；10～15 min，20 %→35 %A；15～25 min，35 %→65 %A；25～40 min，65 %A；40～45 min，65 %→80 %A；45～50 min，80 %→8 %A）；流速為1.0 ml/min；DAD檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm（檢測(cè)葛根素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷），278 nm（檢測(cè)延胡索乙素、丹酚酸B、淫羊藿苷），316 nm（檢測(cè)阿魏酸），345 nm（檢測(cè)鹽酸小檗堿）；黃芪甲苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1使用ELSD檢測(cè)器：漂移管溫度110 ℃，氣體流量2.5 L/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、延胡索乙素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得濃度分別為0.528，0.148，0.372，1.476，0.536 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，備用。精密稱取黃芪甲苷、阿魏酸、淫羊藿苷對(duì)照品適量，置5 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得濃度分別為4.976，2.244，2.460 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，備用。精密稱取葛根素、鹽酸小檗堿、丹酚酸B對(duì)照品適量，置100 ml量瓶中，分別加入上述兩種對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 ml，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液5 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇，制成每1 ml分別含毛蕊異黃酮葡萄糖苷2.64 μg、黃芪甲苷24.88 μg、葛根素45.06μg、鹽酸小檗堿109.42 μg、阿魏酸11.22 μg、丹酚酸B 122.82 μg、淫羊藿苷12.30 μg、延胡索乙素0.74 μg、人參皂苷Rg11.86 μg、人參皂苷Re 7.38 μg、人參皂苷Rb12.68 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品20片，除去包衣，置研缽中研細(xì)，精密稱取細(xì)粉約1.0 g，置具塞稚形瓶中，精密加入70 %甲醇溶液25 ml，密塞，稱定重量，超聲（500 W，40 kHz）40 min，取出放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取續(xù)濾液5 ml，置10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按養(yǎng)心氏片處方比例，分別制備缺黃芪、缺人參、缺淫羊霍、缺丹參、缺葛根、缺當(dāng)歸、缺黃連、缺醋延胡索的陰性對(duì)照樣品，按2.2.2項(xiàng)方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μl，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，理論塔板數(shù)按阿魏酸色譜峰計(jì)大于8000；毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、葛根素、鹽酸小檗堿、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、延胡索乙素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5，對(duì)稱因子在0.95～1.38之間；各陰性樣品溶液色譜圖在相應(yīng)待測(cè)組分保留時(shí)間處未見(jiàn)色譜峰，說(shuō)明其他成分對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 養(yǎng)心氏片HPLC-DAD色譜圖

圖2 養(yǎng)心氏片HPLC-ELSD色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品溶液2，4，8，12，16，20 ml，分別置25 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，按2.1項(xiàng)色譜條件依次進(jìn)樣，記錄色譜圖。以各對(duì)照品質(zhì)量濃度（X，mg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制毛蕊異黃酮葡萄糖苷、葛根素、鹽酸小檗堿、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、延胡索乙素回歸曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)；以對(duì)照品質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值（X）為橫坐標(biāo)，峰面積的對(duì)數(shù)值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制黃芪甲苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的回歸曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，各待測(cè)組分在試驗(yàn)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 11個(gè)有效成分的回歸方程及線性范圍

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取每1 ml含毛蕊異黃酮葡萄糖苷2.64 μg、黃芪甲苷24.88 μg、葛根素45.06 μg、鹽酸小檗堿109.42 μg、阿魏酸11.22 μg、丹酚酸B 122.82 μg、淫羊藿苷12.30 μg、延胡索乙素0.74 μg、人參皂苷Rg11.86 μg、人參皂苷Re 7.38 μg、人參皂苷Rb12.68 μg的混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖及各組成色譜峰峰面積。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、葛根素、鹽酸小檗堿、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、延胡索乙素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積RSD分別為1.23 %，1.09 %，1.22 %，0.47 %，1.03 %，1.57 %，0.72 %，1.34 %，1.26 %，1.14 %，0.84 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取養(yǎng)心氏片供試品（批號(hào)：181021），按2.2.2項(xiàng)方法處理后0，4，8，12，16，20，24 h，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖及各色譜峰峰面積。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、葛根素、鹽酸小檗堿、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、延胡索乙素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積RSD分別為1.19 %，1.31 %，1.77 %，1.56 %，1.92 %，0.62 %，1.34 %，0.81 %，0.42 %，1.52 %，0.71 %（n=7），表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取養(yǎng)心氏片供試品（批號(hào)：181021）6份，分別按2.2.2項(xiàng)方法處理，按2.1項(xiàng)色譜條件分析，記錄色譜圖及各色譜峰峰面積。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、葛根素、鹽酸小檗堿、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、延胡索乙素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1平均含量分別為0.115，1.257，2.269，5.422，0.595，6.133，0.609，0.031，0.089，0.371，0.126 mg/g，RSD分別1.22 %，0.79 %，1.36 %，0.94 %，1.18 %，1.90 %，0.37 %，1.54 %，1.87 %，1.36 %，1.43 %（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的養(yǎng)心氏片供試品（批號(hào)：181021）9份，每份約0.5 g，精密稱定，分成3組，分別精密加入含毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.023 mg/ml、黃芪甲苷0.252 mg/ml、葛根素0.455 mg/ml、鹽酸小檗堿1.088 mg/ml、阿魏酸0.119 mg/ml、丹酚酸B 1.231 mg/ml、淫羊藿苷0.122 mg/ml、延胡索乙素0.006 mg/ml、人參皂苷Rg10.018 mg/ml、人參皂苷Re 0.074 mg/ml、人參皂苷Rb10.025 mg/ml的混合對(duì)照品溶液3.0，2.5，2.0 ml，按2.2.2項(xiàng)方法處理，按2.1項(xiàng)色譜條件分析。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、葛根素、鹽酸小檗堿、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、延胡索乙素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1平均加樣回收率分別為101.8 %，96.4 %，99.0 %，103.4 %，102.7 %，95.1 %，108.5 %，100.9 %，101.7 %，99.9 %，103.6 %，RSD分別為1.09 %，0.82 %，1.33 %，2.25 %，1.13 %，1.84 % ，0.58 %，2.10 %，1.56 % ，1.82 %，1.11 %（n=9），具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度良好。

表2 （續(xù)）

表2 （續(xù)）

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品含量測(cè)定

取11批養(yǎng)心氏片供試品，按2.2.2項(xiàng)方法處理，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖及各色譜峰峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算各組分含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 養(yǎng)心氏片11個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)的確定

養(yǎng)心氏片方中黃芪、人參為君藥，主大補(bǔ)元?dú)?、安神定志、補(bǔ)氣生血、健脾養(yǎng)心[5-6]；黨參、靈芝、葛根、當(dāng)歸主健脾益氣、生津養(yǎng)血、化痰通脈、安神定悸[7-10]，丹參、延胡索、山楂主活血祛痰、化濁降脂、通脈止痛，共為臣藥[11-13]；黃連主清熱瀉肝、寧心止悸[14]，淫養(yǎng)霍、地黃主溫腎助陽(yáng)、補(bǔ)腎滋陰、養(yǎng)血通脈[15-16]，共為佐藥；甘草益氣通脈、緩急止痛、養(yǎng)心安神[16]，為使藥。養(yǎng)心氏片所含皂苷類成分，如黃芪甲苷、人參皂苷等均有增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)血液循環(huán)、改善心肌缺血、保護(hù)心血管的作用，黃酮類成分如葛根素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷等具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、保護(hù)心肌損傷的作用；酚酸類成分如丹酸酸B、阿魏酸等具有活血化瘀、抗動(dòng)脈粥樣硬化、收縮血管、抗腫瘤的作用；生物堿類成分如延胡索乙素、鹽酸小檗堿等具有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗病毒等作用，因此為有效控制制劑質(zhì)量，根據(jù)中藥復(fù)方制劑君臣佐使理論及中國(guó)藥典各藥材標(biāo)準(zhǔn)，本研究選擇11個(gè)有效成分作為養(yǎng)心氏片質(zhì)量控制指標(biāo)。

3.2 檢測(cè)器的選擇及條件優(yōu)化

養(yǎng)心氏片中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1等皂苷類成分的紫外吸收均為末端吸收，紫外吸收波長(zhǎng)為203 nm，靈敏度低，基線噪音大，在ELSD條件下色譜峰響應(yīng)值更大，且人參皂苷Rg1和人參皂苷Re分離效果更好；黃芪甲苷紫外吸收較弱，雜質(zhì)干擾較大，其含量多采用ELSD測(cè)定，既保證基線平穩(wěn)，又提高了靈敏度；毛蕊異黃酮葡萄糖苷、葛根素、淫羊藿苷為黃酮類成分，阿魏酸、丹酚酸B為酚酸類成分，鹽酸小檗堿、延胡索乙素為生物堿類成分，分子結(jié)構(gòu)中均含共軛結(jié)構(gòu)，具有較好的紫外吸收，適用于DAD檢測(cè)器，故本文采用DAD-ELSD串聯(lián)測(cè)定11個(gè)有效成分的含量。

采用DAD檢測(cè)器190～400 nm全波長(zhǎng)掃描對(duì)照品溶液和供試品溶液，確定采用254 nm（葛根素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷），278 nm（延胡索乙素、丹酚酸B、淫羊藿苷），316 nm（阿魏酸），345 nm（鹽酸小檗堿）分段波長(zhǎng)檢測(cè)法。采用ELSD檢測(cè)器分析黃芪甲苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1，考察不同漂移管溫度（90、100、110 ℃）對(duì)峰響應(yīng)值的影響，結(jié)果顯示ELSD的響應(yīng)值隨漂移管溫度升高而增大，為保證高水相流動(dòng)相的蒸發(fā)，選擇110 ℃為漂移管溫度；考察不同氮?dú)饬魉伲?.0，2.5，3.0 L/min）對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果表明氮?dú)饬魉贋?.5 L/min時(shí)基線較為平穩(wěn)，ELSD的響應(yīng)值高，因此選擇2.5 L/min為最終條件。

3.3 樣品提取方法優(yōu)化

本研究采用正交試驗(yàn)分別考察提取溶劑（甲醇水溶液、乙醇水溶液）及濃度（50 %，70 %，90 %）、提取溶劑用量（25，30，35 ml）、提取時(shí)間（40，50，60 min）對(duì)供試品溶液中11個(gè)化學(xué)成分提取率的影響，綜合正交試驗(yàn)結(jié)果及經(jīng)濟(jì)環(huán)保考慮，確定1.0 g樣品采用25 ml 70 %甲醇溶液超聲提?。?00 W，40 kHz）40 min。

3.4 流動(dòng)相條件優(yōu)化

本研究分別考察乙腈-水溶液、乙腈-0.1 %甲酸溶液、甲醇-0.1 %甲酸溶液、甲醇-水溶液幾種流動(dòng)相梯度洗脫系統(tǒng)，結(jié)果顯示有機(jī)相乙腈對(duì)色譜峰的洗脫能力優(yōu)于甲醇，水相中加入0.1 %甲酸時(shí)，黃芪甲苷色譜峰峰型顯著改善，采用梯度洗脫，各色譜峰峰形和分離度均可達(dá)到要求，故選用乙腈-0.1 %甲酸水溶液為流動(dòng)相系統(tǒng)。

4 結(jié)論

本研究采用HPLC-DAD-ELSD串聯(lián)技術(shù)可同時(shí)測(cè)定養(yǎng)心氏片中11個(gè)成分的含量，方法快速準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單穩(wěn)定，可用于養(yǎng)心氏片的質(zhì)量控制。