冬凌草甲素的藥理活性及作用機(jī)制研究

付 玉，王淑靜，張家寧*

（1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；2. 廈門醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建 廈門 361023）

冬凌草甲素（oridonin）是唇形科香茶菜屬冬凌草的主要成分。大量研究表明，冬凌草甲素具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗炎、神經(jīng)保護(hù)及抗菌等。其較強(qiáng)的抗腫瘤活性成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素對口腔癌[1]、卵巢癌[2]、結(jié)腸癌[3]及乳腺癌[4]等有顯著的抑制作用，其對急性髓細(xì)胞白血病的治療已進(jìn)入臨床試驗階段[5]。

1 冬凌草甲素的理化性質(zhì)

冬凌草甲素是一種貝殼杉烷型二萜類化合物。分子式為C20H28O6，相對分子質(zhì)量為364.44。為無色棱柱狀結(jié)晶，味道極苦，不溶于水，微溶于乙醚、甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑。冬凌草甲素有良好的穩(wěn)定性，在人體內(nèi)有良好的吸收、分布、代謝、排泄和安全性（ADME/Tox）。研究表明，冬凌草甲素化學(xué)結(jié)構(gòu)中，與環(huán)外亞甲基共軛的環(huán)戊烷酮結(jié)構(gòu)為其抗癌活性中心（結(jié)構(gòu)見圖1），此活性中心的環(huán)外雙鍵變成飽和鍵或裂環(huán)時，則抗癌作用消失[6]。

圖1 冬凌草甲素活性中心結(jié)構(gòu)

2 冬凌草甲素的藥理作用

冬凌草甲素是冬凌草的主要成分，1967年首次被鑒定，1973年合成[7]。大量研究表明，冬凌草甲素在腫瘤治療、抗炎及神經(jīng)保護(hù)等方面取得了重大進(jìn)展[8]。

2.1 抗腫瘤作用

研究表明，冬凌草甲素對腫瘤有很強(qiáng)的治療作用，且不易產(chǎn)生耐藥性[9]。其具有廣譜抗腫瘤活性，可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬、抑制腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移等。

2.1.1 抑制腫瘤細(xì)胞增殖 腫瘤細(xì)胞在人體內(nèi)具有持續(xù)增殖性，無限增殖是惡性腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性之一，是區(qū)別于正常細(xì)胞和良性腫瘤細(xì)胞最顯著的生物學(xué)特征。冬凌草甲素可通過調(diào)控細(xì)胞周期來阻斷多種腫瘤細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期中G1到S和G2到M是調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長最為重要的兩個階段，這兩個階段的分子水平變化復(fù)雜活躍，易受多種因素影響。冬凌草甲素可將胃癌細(xì)胞SGC-7901阻滯在G2/M期，抑制SGC-7901細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬[10]。黃坷坷等[11]研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素可將食管癌細(xì)胞KYSE-150、KYSE-450阻滯在G2/M期，抑制食管癌細(xì)胞增殖。此外，冬凌草甲素可通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路誘導(dǎo)雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞PC3和DU145的G2/M細(xì)胞周期阻滯[12]。其還可通過阻斷Akt活性，誘導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）細(xì)胞阻滯于G2/M期，抑制ESCC細(xì)胞的生長[13]。研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素依賴于半胱天冬蛋白酶（caspase）的激活來切割人體抑癌基因p53誘導(dǎo)的E3泛素-蛋白連接酶（Mdm2）以產(chǎn)生Mdm2-p60，Mdm2-p60的產(chǎn)生穩(wěn)定了p53，并導(dǎo)致p53的積累，使p53持續(xù)激活，誘導(dǎo)兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤（NB）細(xì)胞周期阻滯[14]。

2.1.2 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡途徑通常包括線粒體凋亡途徑、死亡受體凋亡途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑。研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可通過多種信號通路及作用機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。最常見的是線粒體凋亡途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。

張亞男等[15]發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素作用于人宮頸癌He1a細(xì)胞后，促凋亡蛋白（Bax）以及細(xì)胞色素c（Cyt-c）表達(dá)增加，抗凋亡蛋白（Bcl-2）表達(dá)和Bcl-2/Bax比值降低，從而誘導(dǎo)依賴caspase-3的線粒體凋亡途徑。冬凌草甲素還可降低肝癌細(xì)胞HepG2線粒體膜電位，提高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)HepG2凋亡[16]。冬凌草甲素通過誘導(dǎo)聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP，一種DNA修復(fù)酶）的裂解，促進(jìn)HepG2細(xì)胞線粒體發(fā)生氧化還原變化，進(jìn)而導(dǎo)致HepG2細(xì)胞凋亡[17]。

冬凌草甲素可上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、磷酸化蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（p-PERK）、磷酸化真核翻譯起始因子eIF2的α亞基（p-eIF2α）和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CHOP）的表達(dá)水平，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑發(fā)揮促進(jìn)人喉癌細(xì)胞Hep-2和TU212的凋亡作用，4-苯基丁酸（4-PBA，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑）或CHOP基因敲除可拮抗其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[18]。曹世杰等[19]研究發(fā)現(xiàn)其與西妥昔單抗聯(lián)用，可通過ROS介導(dǎo)線粒體凋亡途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑誘導(dǎo)人喉癌細(xì)胞Tu212凋亡。

此外，冬凌草甲素還可通過激活磷酸化c-Jun氨基末端激酶/原癌基因c-Jun（p-JNK/c-Jun）通路，誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞HGC-27的凋亡[20]；可激活腺苷酸激活蛋白激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（AMPK/Akt/mTOR）信號通路，誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞A549的凋亡并降低其對順鉑的耐藥性[21]。

2.1.3 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬 研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素能通過促進(jìn)或抑制腫瘤細(xì)胞自噬過程發(fā)揮抗腫瘤作用。冬凌草甲素通過降低自噬效應(yīng)蛋白Beclin-1的表達(dá)水平，顯著抑制卵巢癌細(xì)胞（A2780CP和SKOV3/DDP）自噬，并提高卵巢癌細(xì)胞對順鉑誘導(dǎo)凋亡的敏感性[22]。體內(nèi)與體外研究表明，冬凌草甲素可通過增加自噬標(biāo)志物Beclin-1、LC3-II蛋白表達(dá)水平，并降低自噬相關(guān)蛋白LC3-I、p62蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)自噬過程，調(diào)控腺苷酸激活蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/人自噬相關(guān)蛋白1（AMPK/mTOR/ULK1）信號通路，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-1凋亡。使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）后，則阻止自噬，降低了冬凌草甲素對DLD-1細(xì)胞的增殖抑制作用[23]。冬凌草甲素還可通過激活c-Jun N-末端激酶途徑和抑制PI3K信號傳導(dǎo)增加Beclin-1、LC3-II蛋白表達(dá)水平，誘導(dǎo)胰腺癌自噬介導(dǎo)的細(xì)胞死亡[24]。

2.1.4 抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移 冬凌草甲素可通過抑制上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要原因，EMT具有上皮標(biāo)志物E-鈣黏素（E-cad）的丟失和間充質(zhì)標(biāo)志物波形纖維蛋白（vimentin）的獲得兩大特征。史國軍等[25]研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素通過增強(qiáng)E-cad蛋白表達(dá)，下調(diào)vimentin蛋白表達(dá)，從而抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖、遷移和侵襲。冬凌草甲素通過抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β（PI3K/Akt/GSK-3β）信號通路，阻斷了黑色素瘤A375細(xì)胞的遷移和侵襲；抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號通路，阻斷人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1975的遷移、侵襲和黏附；阻斷mTOR信號通路的磷酸化，降低了卵巢癌細(xì)胞SKOV3的遷移和侵襲[26-27, 2]。

2.1.5 調(diào)控腫瘤細(xì)胞能量代謝 腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞能量代謝不同，腫瘤細(xì)胞即使在氧氣充足的情況下也傾向于糖酵解供能，即有氧糖酵解（Warburg效應(yīng)）[28]。Warburg效應(yīng)產(chǎn)生與缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）過度表達(dá)、癌基因（cMyc，Ras）激活、腫瘤抑制因子[突變型p53、突變型抑癌基因PTEN、微小RNA（miRNA）和具有抑制功能的去乙?；竤irtuin]功能喪失等腫瘤微環(huán)境的改變有關(guān)，并依賴于激活PI3K/Akt/mTOR或失活抑癌基因/腺苷酸激活蛋白激酶（LKB1/AMPK）信號通路[29]。

HIF-1α可通過上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（如GLUT1和GLUT3），調(diào)控糖酵解酶[己糖激酶2（HK2）、磷酸果糖激酶（PFK）等）]及單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（MCT4）等的表達(dá)，抑制氧化磷酸化（OXPHOS），進(jìn)一步增加糖酵解通量，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存和生長[30]。因此，HIF-1α是腫瘤能量代謝的重要靶點。研究表明，冬凌草甲素通過降低HIF-1α的表達(dá)，抑制糖酵解通量，同時降低血管內(nèi)皮因子的表達(dá)，發(fā)揮抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和4T1的血管生成，從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖作用，此機(jī)制同樣也存在于冬凌草甲素抑制膽囊癌細(xì)胞GBC-SD上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞遷移中[31-32]。

PI3K/Akt信號通路的異?；罨悄[瘤糖代謝改變的主要機(jī)制，PI3K/Akt信號通路下游的轉(zhuǎn)錄蛋白調(diào)控糖代謝的多個進(jìn)程，PI3K/Akt在細(xì)胞因子刺激下，上調(diào)GLUT1活性，促進(jìn)葡萄糖的攝取，此外，PI3K/Akt通過抑制HK2和PFK的表達(dá)來調(diào)節(jié)糖酵解速率，在不激活線粒體OXPHOS的情況下促進(jìn)糖代謝[33]。PI3K/Akt信號通路活化后也作用于下游分子mTOR，影響HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解過程。研究表明冬凌草甲素通過增強(qiáng)大鼠心肌細(xì)胞H9c2中的miR-214，調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR通路，抑制HIF-1α的表達(dá)，抑制糖酵解過程，從而誘導(dǎo)缺氧引起的H9c2細(xì)胞凋亡和自噬[34]。冬凌草甲素可通過阻斷mTOR信號通路的磷酸化，降低糖酵解過程而抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3的遷移和侵襲[2]。

此外，冬凌草甲素還能通過在體外和體內(nèi)顯著下調(diào)GLUT1和單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（MCT1）的表達(dá)水平，抑制葡萄糖攝取和減少乳酸輸出，降低糖酵解產(chǎn)能。然而，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)阻斷葡萄糖供應(yīng)時，冬凌草甲素處理的結(jié)直腸癌（CRC）細(xì)胞中的ATP水平并未降低，研究認(rèn)為冬凌草甲素誘導(dǎo)的自噬過程成為癌細(xì)胞中ATP主要來源，LC3-II檢測和透射電子顯微鏡分析結(jié)果證實了自噬產(chǎn)能現(xiàn)象，冬凌草甲素治療后p-AMPK迅速失活，導(dǎo)致GLUT1下調(diào)，也誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬，提示能量代謝與自噬過程等能影響腫瘤細(xì)胞的生理過程，冬凌草甲素可從多個機(jī)制來發(fā)揮抗腫瘤作用[35]。

2.2 抗炎作用

炎癥通常發(fā)生在細(xì)菌、病毒或真菌等感染性微生物侵入人體，寄居于特定組織或在血液中循環(huán)。炎癥也可能在組織損傷、細(xì)胞死亡、癌癥、缺血和變性等過程中發(fā)生。與人類病理狀況相關(guān)的炎性介質(zhì)包括干擾素，白介素（IL），趨化因子，前列腺素，核因子κB（NF-κB）等。常與NF-κB信號通路、Toll 樣受體 4（TLR4）相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。

據(jù)文獻(xiàn)報道，冬凌草甲素發(fā)揮抗炎作用主要與抑制NF-κB、TLR4相關(guān)信號通路，促進(jìn)NLRP3炎癥小體的激活等有關(guān)。冬凌草甲素對糖尿病腎?。―N）的保護(hù)作用與其抗炎作用密切相關(guān)。TLR4是先天免疫和炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)，參與DN的發(fā)展。實驗結(jié)果表明冬凌草甲素通過TLR4/p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和TLR4/NF-κB信號通路，能顯著下調(diào)TLR4的過度表達(dá)，抑制NF-κB抑制蛋白α（IκBα）、p65和p38磷酸化及NF-κB與DNA結(jié)合活性[36]。冬凌草甲素劑量依賴性地降低小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（mEEC）中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)，抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號通路的激活，有效地減輕LPS誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜炎[37]。此外，冬凌草甲素還可通過阻斷TNF-α激活的MAPK信號通路，抑制NF-κB的活化，發(fā)揮抑制血管炎癥的作用[38]。其還可顯著降低d-半乳糖胺（d-GalN）/LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷（ALI）模型中NLRP3、caspase-1、IL-18和IL-1β的表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)作用[39]。

2.3 神經(jīng)保護(hù)作用

神經(jīng)退行性疾病是一組病因多樣的異質(zhì)性疾病，往往與遺傳、環(huán)境、年齡、代謝、感染等相關(guān)[40]。神經(jīng)退行性疾病包括阿爾茨海默?。ˋD）、帕金森?。≒D）、亨廷頓病、多發(fā)性硬化癥和朊病毒病等。神經(jīng)元細(xì)胞損傷或死亡是各種神經(jīng)退行性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要因素。氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致神經(jīng)病變的主要途徑[41]。

大腦中普遍存在高表達(dá)的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）及其受體酪氨酸激酶受體B（TrkB），BDNF/TrkB通路已被證明能介導(dǎo)神經(jīng)元的存活和分化，在學(xué)習(xí)和記憶中起調(diào)節(jié)作用。冬凌草甲素可激活BDNF/TrkB通路，增加AD模型小鼠海馬中磷酸化-環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（p-CREB）的表達(dá)，并增加AD模型小鼠突觸小體中突觸后致密物95（PSD-95）和突觸素的表達(dá)，并促進(jìn)線粒體的活性，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[42]?？得肪甑萚43]采用1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH建立PD模型，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可抑制模型細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。采用MPP+誘導(dǎo)神經(jīng)生長因子（NGF）分化的PC12細(xì)胞建立PD模型，采用紅藻氨酸（KA）誘導(dǎo)NGF分化的PC12細(xì)胞建立癲癇模型，冬凌草甲素預(yù)處理可降低活性氧生成，提高谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶和過氧化氫酶活性，并降低相關(guān)炎性因子的表達(dá)，增加多巴胺和谷氨酰胺的含量，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[44]。NLRP3炎癥小體被認(rèn)為是創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）后炎癥和神經(jīng)元死亡的重要因素，冬凌草甲素能降低NLRP3炎癥小體的釋放，保護(hù)血腦屏障（BBB）的完整性，減輕神經(jīng)功能缺損，有效阻止TBI小鼠的炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡[45]。隨著研究的不斷深入，冬凌草甲素有望成為治療人類神經(jīng)退行性疾病的藥物。

2.4 其他藥理作用

冬凌草甲素具有抗真菌作用。白色念珠菌是一種酵母菌，能引起高死亡率真菌感染，是一種典型的耐唑類真菌。將冬凌草甲素與三種唑類藥物，即氟康唑（FLC）、伊曲康唑（ITR）和伏立康唑（VOR）聯(lián)合應(yīng)用，外排泵抑制試驗顯示FLC、ITR和VOR的最低抑菌濃度（MIC）顯著降低。表明唑類藥物與冬凌草甲素的聯(lián)合應(yīng)用具有很強(qiáng)的協(xié)同作用，能促進(jìn)耐唑類真菌對唑類藥物的敏感性[46]。

冬凌草甲素具有抗菌活性。能通過影響耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的通透性、蛋白質(zhì)代謝及細(xì)胞代謝和形態(tài)，發(fā)揮對MRSA的抗菌活性[47]。

冬凌草甲素具有心肌保護(hù)作用。冬凌草甲素作為NLRP3抑制劑可降低小鼠心肌梗死后IL-1β和IL-18的表達(dá)，改善心肌纖維化，重塑不良心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，達(dá)到心肌保護(hù)作用，維護(hù)心功能[48]。

冬凌草甲素能抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞（RA-FLS）增殖，并通過提高Bax和caspase-3蛋白表達(dá)水平，抑制Beclin-1蛋白水平，誘導(dǎo)RA-FLS凋亡與自噬[49]。

3 小結(jié)

冬凌草甲素由于其廣泛的藥理活性和相對安全性，近年來受到越來越多的關(guān)注。冬凌草甲素具有多種潛在靶點，可通過不同的信號通路，同時發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，對于多種疾病的預(yù)防和治療有重要意義，尤其是其具有廣譜的抗腫瘤特性，可通過多種機(jī)制抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、耐藥，促進(jìn)腫瘤凋亡、自噬等，具有較好的開發(fā)前景。但冬凌草甲素由于水溶性較差、生物利用度較低，應(yīng)用開發(fā)受到一定限制，基于冬凌草甲素的結(jié)構(gòu)特性，許多冬凌草甲素衍生物不斷被設(shè)計、合成，使冬凌草甲素成為癌癥治療候選藥物之一，而且在治療癌癥以外的疾病也顯示出了良好的效果。因此，冬凌草甲素及其衍生物具有較好的臨床應(yīng)用前景及應(yīng)用開發(fā)價值。