一測(cè)多評(píng)法測(cè)定當(dāng)歸丸（濃縮丸）中3種成分的含量

樊磊磊，徐金玲，婁玉霞，閆洪建

（1. 河南省食品藥品檢驗(yàn)所 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450018；2.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450018；3. 仲景宛西制藥股份有限公司，河南 西峽 474550）

中成藥當(dāng)歸丸（濃縮丸）現(xiàn)收載于《衛(wèi)生部中藥成方制劑第十七冊(cè)》，其功能與主治為補(bǔ)血活血，調(diào)經(jīng)止痛，用于血虛所致的月經(jīng)不調(diào)，行經(jīng)腹痛[1-2]。當(dāng)歸的“補(bǔ)血”作用主要作用于造血系統(tǒng)，通過(guò)刺激與造血相關(guān)的細(xì)胞、分子等發(fā)揮對(duì)造血系統(tǒng)的作用；其“活血”作用主要作用于循環(huán)系統(tǒng)，通過(guò)抑制血小板凝聚等作用達(dá)到“活血”的效果[3]。當(dāng)歸含揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖、黃酮等多種化學(xué)成分[4-10]，其藥理作用廣泛，涉及機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)。當(dāng)歸含多種有機(jī)酸類(lèi)化合物，其代表為阿魏酸，阿魏酸能抑制血小板凝聚[11]，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，阿魏酸對(duì)閉塞性動(dòng)脈粥樣硬化癥也具有顯著療效[12]。當(dāng)歸中的苯酞類(lèi)化合物是當(dāng)歸揮發(fā)油的主要成分，包括Z-藁本內(nèi)酯、E-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯I、E-丁烯基苯酞、Z-丁烯基苯酞等成分[13]。當(dāng)歸及其揮發(fā)油具有調(diào)節(jié)血管生成、抑制心肌細(xì)胞肥大和抗心律失常作用[14]。

中成藥多指標(biāo)控制模式近年逐步應(yīng)用于產(chǎn)品的質(zhì)量控制，但存在對(duì)照品不易獲得、使用量大、檢驗(yàn)成本高等諸多不足。一測(cè)多評(píng)法利用藥品各成分之間的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)一個(gè)對(duì)照品易得成分的測(cè)定，實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分的含量測(cè)定，可大大降低檢驗(yàn)成本[15-21]?，F(xiàn)行當(dāng)歸丸（濃縮丸）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)含量測(cè)定控制項(xiàng)，本研究采用一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定當(dāng)歸丸（濃縮丸）中的阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I和藁本內(nèi)酯3種成分的含量，從而控制本品質(zhì)量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），工作站：Empower；Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），工作站：Agilent ChemStation；Mettler Toledo XPE205電子天平（瑞士Mettler Toledo）；KQ-00VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；色譜柱：XSelect?CSH?C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 材料

阿魏酸對(duì)照品（美國(guó)Phenchem公司，批號(hào)：KL2510EW，含量：99.09 %）；洋川芎內(nèi)酯I對(duì)照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：WK20032304，含量：98.40 %）；藁本內(nèi)酯對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量：100 %，批號(hào)：111737-201608）；當(dāng)歸丸（濃縮丸）（仲景宛西制藥股份有限公司，批號(hào)：190101，190102，180201，180202，180401，180402）。乙腈、甲酸均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1 %甲酸（B），梯度洗脫（0～10 min，20 %A→58 %A；10～25 min，58 %A→68 %A；25～33 min，68 %A→68 %A；33～40 min，68 %A→95 %A；40～41 min，95 % A→20 % A；41～50 min，20 %A→20 %A）；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；流速1.0 ml/min；進(jìn)樣量10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取阿魏酸對(duì)照品7.82 mg，洋川芎內(nèi)酯I對(duì)照品 4.34 mg，藁本內(nèi)酯對(duì)照品21.8 mg，分別置入25，25，20 ml量瓶，分別加甲醇配制成阿魏酸，洋川芎內(nèi)酯I，藁本內(nèi)酯濃度為309.9，170.8，1090 μg/ml 的儲(chǔ)備液。分別吸取阿魏酸儲(chǔ)備液0.1，0.1，0.1，0.2，0.4，0.6 ml，洋川芎內(nèi)酯I儲(chǔ)備液0.25，0.25，0.25，0.5，1.0，1.5 ml及藁本內(nèi)酯儲(chǔ)備液1.0，1.0，1.0，2.0，4.0，6.0 ml，分別置入50，25，10，10，10，10 ml量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，配制系列混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取當(dāng)歸丸（濃縮丸）粉末約1 g，精密稱(chēng)定，置入150 ml具塞錐形瓶，精密加75 %甲醇50 ml，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理20 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用75 %甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 本品只含當(dāng)歸一味藥材，故取制備供試品溶液時(shí)所用75 %甲醇溶液作為陰性對(duì)照溶液。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下3種溶液（其中混合對(duì)照品溶液含阿魏酸6.2 μg/ml，洋川芎內(nèi)酯I 8.5 μg/ml，藁本內(nèi)酯218.0 μg/ml），分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果供試品溶液色譜圖中，在與對(duì)照品溶液色譜圖相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I和藁本內(nèi)酯峰形對(duì)稱(chēng)，與相鄰色譜峰分離度＞1.5，理論塔板數(shù)按各成分計(jì)均≥4000，陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 專(zhuān)屬性考察HPLC圖譜

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液10 μl，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰面積，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算回歸方程。結(jié)果表明3種成分在相應(yīng)范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好，見(jiàn)表1。

表1 3種成分線(xiàn)性關(guān)系

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一混合對(duì)照品溶液（含阿魏酸6.2 μg/ml，洋川芎內(nèi)酯I 8.5 μg/ml，藁本內(nèi)酯218.0 μg/ml），連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯I、阿魏酸峰面積積分值，計(jì)算RSD，結(jié)果各成分峰面積的RSD分別為1.11 %，1.28 %和1.18 %，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批當(dāng)歸丸（濃縮丸）（批號(hào)：190101）粉末約1 g，共6份，精密稱(chēng)定，分別按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、藁本內(nèi)酯含量分別為0.27，0.29，9.12 mg/g，RSD分別為1.61 %，1.56 %，1.91 %。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批當(dāng)歸丸（濃縮丸）（批號(hào)：190101）供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果表明阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.89 %，0.89 %，0.59 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的供試品（批號(hào)：190102）約0.5 g，精密稱(chēng)定，分別加入一定量的對(duì)照品溶液，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明當(dāng)歸丸（濃縮丸）中上述3種成分的平均加樣回收率分別為96.79 %，97.95 %，98.25 %，RSD分別為1.27 %，1.52 %，1.69 %，表明方法準(zhǔn)確度良好，見(jiàn)表2。

表2 3種成分的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 相對(duì)校正因子的計(jì)算

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液（含阿魏酸6.2 μg/ml，洋川芎內(nèi)酯I 8.5 μg/ml，藁本內(nèi)酯218.0 μg/ml）1，2，5，8，10，15，25 μl，注入高效液相色譜儀，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄各成分的峰面積，以藁本內(nèi)酯為內(nèi)參物，按公式fk/m=fk/fm=(Wk×Am)/(Wm×Ak)（Ak為內(nèi)參物峰面積，Wk為內(nèi)參物的質(zhì)量或濃度，Am為其他成分m的峰面積，Wm為其他成分m的質(zhì)量或濃度）[22]，計(jì)算其他成分與內(nèi)參物的相對(duì)校正因子。結(jié)果表明，以藁本內(nèi)酯為內(nèi)參物，其他成分的fk/m值的RSD均小于5 %，見(jiàn)表3。

表3 3種成分相對(duì)校正因子

2.10 耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性評(píng)價(jià)

2.10.1 不同儀器和不同色譜柱考察 取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液（含阿魏酸6.2 μg/ml，洋川芎內(nèi)酯I 8.5 μg/ml，藁本內(nèi)酯218.0 μg/ml），考察Waters2695、Agilent 1260 2種高效液相色譜儀和XSelect?CSH?C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）2種色譜柱對(duì)fk/m值的影響，見(jiàn)表4。結(jié)果表明，各fk/m值之間無(wú)顯著差異，RSD均小于5 %。

表4 不同儀器、色譜柱對(duì)fk/m的影響

2.10.2 不同柱溫的影響 采用Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)，XSelect?CSH?C18柱，考察了柱溫25，30，35，40 ℃時(shí)的fk/m，結(jié)果表明各成分之間fk/m重復(fù)性良好，無(wú)顯著差異，RSD均小于5 %，見(jiàn)表5。

表5 不同柱溫對(duì)fk/m的影響

2.10.3 待測(cè)組分色譜峰定位 取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，采用Waters 2695和Agilent 1260 2種高效液相色譜儀和XSelect?CSH?C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）2種色譜柱，計(jì)算待測(cè)成分的相對(duì)保留時(shí)間，對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行定位[23]，并計(jì)算RSD。結(jié)果各待測(cè)成分的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于5 %，表明采用相對(duì)保留時(shí)間對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行定位是合理的。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同儀器和色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響

2.11 一測(cè)多評(píng)法（QAMS）與外標(biāo)法（ESM）的數(shù)據(jù)比較

取6批當(dāng)歸丸（濃縮丸）樣品，首先采用ESM計(jì)算藁本內(nèi)酯的含量，然后采用ESM和QAMS分別計(jì)算樣品中洋川芎內(nèi)酯I和阿魏酸的含量，并將2種方法的結(jié)果進(jìn)行比較，用相對(duì)誤差（RE）來(lái)表示2種方法的差異[24]，結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可見(jiàn)，RE絕對(duì)值均小于5 %，說(shuō)明建立的QAMS法有較好的準(zhǔn)確性與可行性。

表7 3種成分含量測(cè)定結(jié)果（n=6）

3 討論

3.1 內(nèi)參物的選擇

藁本內(nèi)酯為《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定的當(dāng)歸藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)性成分，性質(zhì)穩(wěn)定、市場(chǎng)流通性強(qiáng)、較易得到，且在2.1項(xiàng)下色譜條件下峰面積較大，分離度良好，結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，證明選擇其作為內(nèi)參物，建立當(dāng)歸丸（濃縮丸）的QAMS法可行。

3.2 流動(dòng)相及柱溫的考察

比較甲醇和乙腈作為有機(jī)相、不同濃度的甲酸水溶液和磷酸水溶液作為水相的梯度洗脫效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1 %甲酸水溶液梯度洗脫分離效果較好，達(dá)到基線(xiàn)分離，所以選擇乙腈-0.1 %甲酸水溶液梯度洗脫系統(tǒng)為流動(dòng)相。同時(shí)還對(duì)4種不同的柱溫：25，30，35，40 ℃進(jìn)行了考察，根據(jù)其對(duì)分離效果的影響及對(duì)色譜柱壽命的影響，選擇柱溫為30 ℃，此溫度下，各成分分離效果和峰形均較好。

3.3 提取溶劑及提取時(shí)間的考察

分別考察了25 %甲醇水溶液、50 %甲醇水溶液、75 %甲醇水溶液、甲醇4種提取溶劑，結(jié)果表明75 %甲醇作為提取溶劑時(shí)提取效果最好；對(duì)超聲提取時(shí)間進(jìn)行考察，分別超聲提取10，20，30，45 min，結(jié)果表明，超聲提取20 min時(shí)，提取完全。

本研究選用對(duì)照品相對(duì)易得且化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定的藁本內(nèi)酯為內(nèi)參物，建立了當(dāng)歸丸（濃縮丸）中該成分與洋川芎內(nèi)酯I和阿魏酸的fk/m。并通過(guò)對(duì)6批樣品的測(cè)定，驗(yàn)證了當(dāng)歸丸（濃縮丸）中藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯I和阿魏酸QAMS含量測(cè)定的準(zhǔn)確性，為當(dāng)歸丸（濃縮丸）的質(zhì)量控制提供了參考方法。