蒽環(huán)類藥物致心臟毒性潛在的生物標(biāo)志物研究

趙恒 譚琦 杜曉宇 谷澤慧 王亞帝

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院，遼寧 錦州 121000； 2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院病理科，遼寧 錦州 121000；3.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)科，遼寧 錦州121000)

乳腺癌以蒽環(huán)類藥物(阿霉素、表阿霉素和吡南阿霉素等)為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療通常是一線治療的標(biāo)準(zhǔn)方案，其療效確切，不可或缺，但常由于心臟毒性副作用的產(chǎn)生，使患者不得不中止蒽環(huán)類藥物的使用，從而影響乳腺癌的治療效果[1]。通過臨床研究和實踐觀察發(fā)現(xiàn)，心臟毒性作為蒽環(huán)類藥物最嚴(yán)重的毒副作用，往往呈現(xiàn)進(jìn)展性和不可逆性，特別是初次使用蒽環(huán)類藥物的乳腺癌患者就可能造成其心臟損傷[2]。目前對于此類患者缺乏較好的治療策略，而如今的診斷手段和治療水平也不能有效地降低該類患者心臟損傷的發(fā)生率，究其原因主要在于蒽環(huán)類藥物導(dǎo)致的心臟毒性是多因素和多步驟的復(fù)雜過程，目前的研究尚不足以完全揭示其發(fā)生和發(fā)展機(jī)制。所以尋求早期特異性診斷指標(biāo)及有效判斷預(yù)后的方法顯得尤為重要。

本研究通過對蒽環(huán)類藥物所致乳腺癌患者產(chǎn)生心臟毒性的微陣列芯片表達(dá)數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異分析，獲得乳腺癌經(jīng)蒽環(huán)類藥物化療后所致心臟毒性相關(guān)差異表達(dá)基因，通過生物信息學(xué)預(yù)測其相關(guān)的靶向微小RNA(microRNA，miRNA)并加以驗證，從分子層面闡述miRNA在蒽環(huán)類藥物致心臟毒性過程中發(fā)揮的生物學(xué)功能及主要作用機(jī)制，對全面分析蒽環(huán)類藥物致心臟毒性的相關(guān)作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)挖掘與分析

GEO數(shù)據(jù)庫挖掘與芯片數(shù)據(jù)集獲取：從美國國家生物技術(shù)信息中心的GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)進(jìn)行芯片樣本篩選(登錄號GSE76314)，芯片通過使用阿霉素誘導(dǎo)乳腺癌患者的特異性人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞源性心肌細(xì)胞(hiPSC-CMs)重現(xiàn)個人對阿霉素引起的心臟毒性過程中信使RNA(messenger RNA，mRNA)的不同表達(dá)情況進(jìn)行研究，從分子角度解釋乳腺癌患者使用阿霉素引起心臟毒性過程的機(jī)制。該研究使用1 μmol阿霉素誘導(dǎo)6例乳腺癌患者的hiPSC-CMs細(xì)胞24 h，檢測其mRNA的差異表達(dá)情況。對于每一個樣本，所有探針的基因表達(dá)值簡化為一個相對確定的平均基因表達(dá)值。而后估算缺失數(shù)據(jù)以及進(jìn)行四分位的數(shù)據(jù)規(guī)范化。為避免多測試問題所導(dǎo)致的假陽性結(jié)果，應(yīng)用本杰明·霍赫貝格法來修正原發(fā)P值為錯誤發(fā)現(xiàn)率，錯誤發(fā)現(xiàn)率<0.05為臨界點(diǎn)。

1.2 基因本體分析

基因本體(gene ontology，GO)分析用來生成一個動態(tài)的受控詞匯(字符表)應(yīng)用于所有的真核生物基因組研究中。GO分析常用于研究和分析大規(guī)模的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)根據(jù)表達(dá)趨勢的不同被分為上調(diào)和下調(diào)組，然后使用基因集執(zhí)行分析工具包進(jìn)行GO分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 京都基因和基因組百科全書信號通路富集分析

對于差異表達(dá)基因的功能注釋，京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路的富集表達(dá)使用KAAS界定。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 明顯差異表達(dá)基因的靶向miRNA預(yù)測

使用TargetScan 7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/)和miRanda(http://www.miranda.org/) 對明顯差異表達(dá)基因的靶向miRNA進(jìn)行預(yù)測，為降低預(yù)測的假陽性率，對兩個數(shù)據(jù)庫結(jié)果取交集后進(jìn)行后續(xù)篩選。

1.5 qPCR驗證預(yù)測

使用0 μmol、5 μmol吡柔比星對人心肌細(xì)胞誘導(dǎo)24 h后，使用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增(94 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，采集熒光信號40～45個循環(huán))，檢測目標(biāo)miRNA的相對表達(dá)量，采用2﹣△△CT表示，其中ΔΔCT=ΔCT(標(biāo)準(zhǔn)基因)-ΔCT(目的基因)。引物序列見表1。

表1 miR-1273g-3p引物序列

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因及其生物學(xué)功能分析

通過對GSE76314數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異表達(dá)基因的分析及篩選，發(fā)現(xiàn)共有差異表達(dá)基因21 615個，其中上調(diào)表達(dá)基因9 814個，下調(diào)表達(dá)基因8 985個，無變化的基因2 816個。其中P<0.05的基因共有636個，上調(diào)表達(dá)基因287個，下調(diào)表達(dá)基因349個，界定|FC|>2為明顯差異表達(dá)基因并列出，見表2和表3。

表2 表達(dá)上調(diào)的差異基因列表

表3 表達(dá)下調(diào)的差異基因列表

2.2 基因功能分析

對686個差異基因進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)，這些基因的生物學(xué)進(jìn)程主要集中在細(xì)胞-細(xì)胞黏附、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)和脂質(zhì)分解代謝過程等(圖1)；細(xì)胞組成主要包括：細(xì)胞質(zhì)、核碎片和細(xì)胞-細(xì)胞黏附連接等(圖2)；分子功能主要富集于鈣黏著蛋白結(jié)合、細(xì)胞黏附及磷脂結(jié)合等功能(圖3)。

注:a為上調(diào)靶基因生物學(xué)進(jìn)程富集圖,b為下調(diào)靶基因生物學(xué)進(jìn)程富集圖。圓形大小代表該生物學(xué)進(jìn)程中富集基因占比量,圓形越大代表富集的基因越多;顏色代表P值大小,顏色越黃代表P值越小。

注:a為上調(diào)靶基因細(xì)胞組成富集圖,b為下調(diào)靶基因細(xì)胞組成富集圖。圓形大小代表該細(xì)胞組成中富集基因占比量,圓形越大代表富集的基因越多;顏色代表P值大小,顏色越黃代表P值越小。

注:a為上調(diào)靶基因分子功能富集圖,b為下調(diào)靶基因分子功能富集圖。圓形大小代表富集基因占比量,圓形越大代表富集基因越多;顏色代表P值大小,顏色越黃代表P值越小。

2.3 信號通路分析

通過KEGG信號通路富集發(fā)現(xiàn)，表達(dá)上調(diào)的靶基因主要富集在色氨酸代謝、PPAR信號通路、范科尼貧血通路、氨酰tRNA生物合成、p53信號通路、脂肪細(xì)胞脂解的調(diào)控和哺乳動物的壽命調(diào)節(jié)途徑等。表達(dá)下調(diào)的靶基因主要富集在萜類主鏈生物合成，甾體生物合成，硫酸軟骨素/硫酸皮膚素的糖胺聚糖生物合成，細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用，酮體的合成與降解，糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，黏著斑信號通路和N-聚糖生物合成等(圖4)。

注:a為上調(diào)靶基因信號通路富集圖,b為下調(diào)靶基因信號通路富集圖。圓形大小代表該通路中富集基因占比量,圓形越大代表富集基因越多;顏色代表P值大小,顏色越黃代表P值越小。

2.4 差異基因的miRNA預(yù)測

使用miRanda、TargetScan 7.2數(shù)據(jù)庫對選出顯著上調(diào)[SNORD97、CSRP3、ANGPTL4、PDK4、金屬硫蛋白1F(MT1F)、SLC25A48、MYLK3、EDA2R、TNFRSF10C和TECRL]和下調(diào)的基因[EPAS1、PDLIM2、ACAT2、S期激酶相關(guān)蛋白2(SKP2)、C5orf46、KIAA1199和OSR1]進(jìn)行靶向miRNA預(yù)測，納入Score>170，Energe<-30的miRNA進(jìn)行后續(xù)研究，發(fā)現(xiàn)miR-1273g-3p是MT1F與SKP2的共同靶向miRNA，說明miR-1273g-3p可能在蒽環(huán)類藥物致心肌毒性過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。詳見表4和表5。

2.5 hsa-miR-1273g-3p驗證

qPCR結(jié)果顯示，與正常對照組相比，人心肌細(xì)胞經(jīng)過吡柔比星誘導(dǎo)后，細(xì)胞中miR-1273g-3p表達(dá)明顯上升(P<0.05)(圖5)。

3 討論

蒽環(huán)類藥物作為乳腺癌、消化道腫瘤和淋巴瘤等實體惡性腫瘤聯(lián)合治療的一線治療方案藥物，常由于心臟毒性副作用的產(chǎn)生，使患者不得不終止對蒽環(huán)類藥物的使用，從而影響治療效果[1]。

目前，蒽環(huán)類藥物所致心臟毒性的具體機(jī)制尚未完全明了，現(xiàn)有的證據(jù)表明其主要機(jī)制可能與蒽環(huán)類藥物作用人體后所產(chǎn)生的自由基密切相關(guān)，大量自由基的產(chǎn)生可導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化和心肌線粒體DNA的損傷[3-6]。其他機(jī)制包括：藥物毒性代謝產(chǎn)物的形成、核苷酸及蛋白質(zhì)合成的抑制、血管活性胺的釋放以及影響特異性基因的表達(dá)等[7-8]。新近的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與調(diào)節(jié)心臟的生長發(fā)育、機(jī)械重構(gòu)和電重構(gòu)等過程密切相關(guān)，并與心臟疾病也有密切關(guān)系[9]。例如，在心肌中由于應(yīng)激作用，miRNA-21表達(dá)水平可明顯升高，進(jìn)而通過靶向抑制Ras/MEK/ERK信號通路的抑制因子萌芽RTK信號拮抗劑1(SPRY1)的表達(dá)，從而激活胞外ERK/MAPK信號通路，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增殖和心肌間質(zhì)纖維化[10]。同樣，Terentyev等[11]的研究表明，miRNA-1還可通過作用于蛋白磷酸酶2調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞膜L2型鈣通道以及導(dǎo)致肌質(zhì)網(wǎng)蘭尼堿受體2活化的Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ磷酸化，從而增加Ca2+的釋放，加速心律失常的發(fā)生。楊寶峰等[12]應(yīng)用特異性miRNA轉(zhuǎn)基因小鼠模型，通過功能獲得與功能缺失等方法研究miRNA在心肌纖維化中的作用，發(fā)現(xiàn)該miRNA可直接靶向轉(zhuǎn)化生長因子-β受體，促進(jìn)Ⅰ型與Ⅱ型受體復(fù)合物的形成并激活轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路后誘導(dǎo)膠原分泌量增加，而反義寡核苷酸可消除該作用。

表4 表達(dá)上調(diào)的差異基因miRNA預(yù)測

表5 表達(dá)下調(diào)的差異基因miRNA預(yù)測

注:CON為正常對照組,THP為吡柔比星組;?表示與CON組比較,P<0.05。

本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE76314基因芯片原始數(shù)據(jù)，并使用軟件包分析差異表達(dá)的mRNA，分析顯示，對hiPSC-CMs使用1 μmol阿霉素誘導(dǎo)24 h后，有明顯差異表達(dá)基因17個，其中上調(diào)基因10個，下調(diào)基因7個。對這些基因進(jìn)行靶向miRNA預(yù)測發(fā)現(xiàn)，上調(diào)mRNA中MT1F和下調(diào)mRNA中的SKP2具有相同靶向miRNA，即miR-1273g-3p，說明miR-1273g-3p可能為參與蒽環(huán)類藥物所致心臟毒性產(chǎn)生過程中的核心miRNA。目前針對miR-1273g-3p的研究主要集中在腫瘤方向，例如Mazza等[13]發(fā)現(xiàn)，血漿中高表達(dá)的miR-1273g-3p在胰腺癌中可作為候選致癌miRNA，且與胰腺癌的分期密切相關(guān)。Guo等[14]通過研究發(fā)現(xiàn)，乳腺導(dǎo)管癌患者血漿中miR-1273g-3p表達(dá)水平顯著高于健康人，且在早期乳腺導(dǎo)管癌中具有一定診斷效力。上述研究提示miR-1273g-3p與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，但miR-1273g-3p在心臟疾病領(lǐng)域仍未見系統(tǒng)性研究，那么miR-1273g-3p是通過何種途徑調(diào)控MT1F和SKP2，進(jìn)而對心臟疾病產(chǎn)生影響的呢？

首先，通過對miR-1273g-3p的靶基因進(jìn)行生物學(xué)功能和信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)其主要參與細(xì)胞-細(xì)胞黏附、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)和脂質(zhì)分解代謝等過程，KEGG信號通路富集發(fā)現(xiàn)，這些靶基因主要通過影響PPAR、p53等信號通路發(fā)揮生物學(xué)功能。最終，筆者預(yù)測出miR-1273g-3p可通過上調(diào)MT1F在蒽環(huán)類所致心臟毒性過程中產(chǎn)生重要作用。MT1F基因?qū)儆诮饘倭虻鞍准易逯饕蓡T之一，其表達(dá)與炎癥、應(yīng)激、重金屬解毒和必需微量元素穩(wěn)態(tài)有關(guān)[15-16]。Alonso-Herranz等[17]發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后7 d內(nèi)金屬硫蛋白1表達(dá)明顯升高，進(jìn)而調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶1激活轉(zhuǎn)化生長因子-β通路，最終導(dǎo)致心肌梗死后的心肌纖維化和不良重構(gòu)發(fā)生。同時，miR-1273g-3p還可下調(diào)SKP2，而SKP2是調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的關(guān)鍵因子[18]。目前相關(guān)研究認(rèn)為SKP2的表達(dá)與腫瘤關(guān)系密切[19-20]，還參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)[21]、循環(huán)系統(tǒng)機(jī)械性損傷和修復(fù)過程。Tamamori-Adachi等[22]通過對Wistar大鼠進(jìn)行冠狀動脈結(jié)扎構(gòu)建大鼠缺血再灌注損傷模型，隨后過表達(dá)/沉默大鼠體內(nèi)的SKP2基因后發(fā)現(xiàn)，大鼠體內(nèi)過表達(dá)的SKP2可顯著改善左心室功能，促進(jìn)心肌缺血后心功能的改善。另有研究[23]發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的SKP2可通過調(diào)控哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路抑制心肌細(xì)胞自噬與心肌肥大的產(chǎn)生。在乙醇所致的心臟收縮功能障礙中，心臟經(jīng)乙醇刺激后通過促進(jìn)單磷酸腺苷活化蛋白激酶磷酸化，抑制下游基因SKP2的表達(dá)，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬[24]。然而SKP2在蒽環(huán)類藥物所致的心肌損傷中鮮有報道。本文通過驗證miR-1273g-3p在蒽環(huán)類藥物所致心臟毒性中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)吡柔比星誘導(dǎo)心肌損傷組中miR-1273g-3p表達(dá)水平明顯高于對照組。推測在蒽環(huán)類藥物所致心臟毒性產(chǎn)生的過程中，miR-1273g-3p過表達(dá)可上調(diào)MT1F，下調(diào)SKP2，該過程的發(fā)生可能與有毒物質(zhì)反應(yīng)和心肌細(xì)胞增殖有關(guān)。

總之，本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)篩選出乳腺癌患者蒽環(huán)類藥物致心臟毒性相關(guān)差異表達(dá)mRNA，分析了其生物學(xué)功能和調(diào)控通路，并針對明顯差異表達(dá)mRNA預(yù)測出具有核心功能的miR-1273g-3p，為后期實驗研究提供數(shù)據(jù)和基礎(chǔ)，但miR-1273g-3p能否通過調(diào)控SKP2和MT1F實現(xiàn)心臟保護(hù)作用尚需進(jìn)一步研究。