p300誘導的乙?；揎梾⑴c脂多糖誘導的炎癥介質合成

在嚴重急性呼吸道綜合征（SARS）和新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）2次重大呼吸道病毒感染爆發(fā)過程中，全身炎癥反應綜合癥（SIRS）造成的多器官功能障礙綜合征(MODS)是死亡的重要原因。目前臨床處理SIRS時一般會應用激素，雖然在一定程度上可以降低死亡率，但帶來的副作用同樣不可忽視，亟待醫(yī)學界探索出其他可行的方案。與炎癥啟動和發(fā)展關聯(lián)的分子環(huán)節(jié)當中，經(jīng)典以及非經(jīng)典核因子(NF-kb)家族成員于目前仍占有核心地位。除此之外，絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、Toll樣受體（TLRs）、絡氨酸激酶/信號轉導和轉錄激活子（JAK/STAT3）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、Hippo通路乃至細胞焦亡相關通路都被證實起到了積極作用。上述通路的相關小分子抑制劑多數(shù)在實驗室條件下表現(xiàn)出一定的抑炎效果，但在成果轉化方面仍少見報道，提示炎癥發(fā)生發(fā)展的分子機制仍然未被充分挖掘。研究表明當堿基或組蛋白發(fā)生表觀遺傳修飾時，染色質構像將發(fā)生改變，從而影響轉錄因子與靶基因啟動子區(qū)域的結合，使得基因表達發(fā)生變化。譬如輔助激活因子p300就是通過誘導組蛋白H3第27位賴氨酸（H3K27）發(fā)生乙酰化修飾，從而松弛染色質結構和激活相關基因表達。p300誘導的表觀遺傳修飾是否介入了脂多糖（LPS）誘導的炎癥介質合成過程，現(xiàn)有研究還未見詳細報道。

基于以上背景，我們采用有關實驗技術路線，探究出LPS 刺激條件下RAW246.7 內p300 合成的變化規(guī)律，并且驗證了p300與炎癥基因啟動子存在結合現(xiàn)象以及由此結合產(chǎn)生的乙?；揎椬饔迷谡T導炎癥基因表達過程中的積極作用，提示干預p300與炎癥基因啟動子的結合能力或與之相關的乙?；揎椈钚?，很可能成為逆轉臨床炎癥失衡的全新策略。

1 材料和方法

1.1 細胞株及主要試劑

小鼠巨噬細胞、RPMI 1640培基由南京華奧生物技術有限公司提供。安捷倫G3 平臺小鼠表達譜芯片（Agilent Sureprint G3 Mouse Gene Expression v2 8x60K Microarray）由Agilent和John Rinn 實驗室共同設計，涵蓋39 430條Entrez Gene RNAs以及16 251條lincRNA。兔抗小鼠RFX、Runt、Far1、Tmem176b、Ttc24、Tmem163、Csf3、Src、p65、p300、c-myb以及二抗均購自博大泰克公司。高表達p65、p300、c-myb蛋白的細胞提取物（以HEK293為載體，制備步驟詳見參考文獻［21］）以及pEGFp-L1-p300和各干擾質粒均由武漢生工股份有限公司合成。

1.2 安捷倫G3小鼠表達譜芯片篩選與LPS刺激強度相關的轉錄因子

復蘇后的Raw264.7細胞于RPMI 1640內培養(yǎng)，根據(jù)不同LPS刺激濃度以及時間分為以下4組：（1）1μg/mL LPS刺激6 h；（2）10μg/mL LPS刺激12 h；（3）100μg/mL LPS刺激12 h；（4）對照組：采用等體積培基加入。刺激結束后，MTT檢測細胞活性，80%以上的對象進行微陣列芯片雜交實驗，委托上海歐意生物醫(yī)學科技有限公司完成。主要步驟為總RNA提取后進行純化，后反轉錄成cDNA，再轉錄合成cRNA，樣品片段化處理后進行熒光標記以及芯片雜交（65 ℃10 r/min滾動18 h）。結束后進行清洗及掃描，得到雜交圖片。掃描后通過Feature Extraction 軟件抽提數(shù)據(jù)，生成的原始數(shù)據(jù)經(jīng)Genespring 標準化。將mRNA 表達差異倍數(shù)≥2，且＜0.05的定義為差異表達基因（DEGs）并進行GO功能分析。篩選其中10個代表性基因的蛋白產(chǎn)物進行WB檢測，以驗證芯片結果的可靠性。

1.3 Raw264.7內p300與c-myb的免疫共沉淀檢測

用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液提取Raw264.7蛋白，將蛋白樣品分為免疫共沉淀、無關對照以及裂解液組（作為input）。于免疫共沉淀組加入兔抗小鼠多克隆c-myb抗體，無關對照組中加入兔抗小鼠IgG，混入蛋白A/G瓊脂糖，4 ℃孵育過夜。清洗沉淀復合物以去除非特異結合的蛋白，將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物用2×Loading Buffer 重懸，95℃水浴5 min，100 g/L SDSpAGE 凝膠電泳，利用Western blot方法檢測p300表達。

1.4 電泳遷移率實驗（EMSA）確定鼠IL-6以及TNF-α基因結構上的轉錄因子結合位點

安捷倫G3平臺小鼠表達譜芯片顯示LPS刺激下RAW246.7內共有850個基因表達上調，676個基因表達下調（＜0.05）。對差異表達基因進行GO功能分析，提示與LPS刺激有關的分子功能變化最為突出的是“蛋白結合”，而生物學過程改變則以“炎癥反應”最為顯著（圖2A）。圖2B為對照以及不同LPS刺激條件下芯片篩選的部分差異表達基因的熱圖。

作以邊長為a的正方形ABCD，連接對角線BD，并以BD為邊長作正方形BEFD，設其邊長為b，如圖所示，則有b2=2a2

1.5 Chip-qPCR法檢測RAW246.7胞內相關分子與炎癥基因啟動子的結合

復蘇成功的RAW264.7進行c-myb表達干預（質粒轉染步驟詳見1.6），同時設立分非干預組。搜集活力理想的細胞10個，Chip-qPCR 主要步驟見下：（1）蛋白-DNA交聯(lián)：1%甲醛溶液固定，甘氨酸溶液終止反應；（2）超聲斷裂染色質：按100 W，10 s/次，間隔30 s的方式斷裂細胞裂解液中的染色質，共5次；（3）免疫共沉淀：加入p65以及p300單克隆抗體（10 μg/管），4 ℃搖床孵育12 h，使用蛋白G-瓊脂糖小珠吸附免疫沉淀復合物；（4）蛋白-DNA解交聯(lián)：加入5 mol/L NaCl溶液，65 ℃水浴過夜，DNA純化柱回收；（5）Real-time PCR分析結合啟動子片段的相對含量：其中PCR引物應滿足：（1）覆蓋至少1個轉錄因子結合位點；（2）擴增區(qū)域位于EMSA實驗寡聚核苷酸引物附近（分別對應圖1中a、b區(qū)域），上下不超過200 bp范圍。反應條件為94 ℃5 s，60 ℃30 s，共40個循環(huán)。

1.6 Western blotting法檢測胞內p65、p300以及c-myb的含量

于培養(yǎng)板各孔準備RAW246.7 10個，按不同干預條件分為9 組：（1）pEGFp-L1-p300 轉染組；（2）p65SiRNA轉染組；（3）pEGFp-L1-p300+p65SiRNA聯(lián)合轉染組；（4）pEGFp-L1-p300+c-mybSiRNA轉染組；（5）LPS 組（10 μg/mL 刺激12 h，以下同）；（6）LPS+p65SiRNA聯(lián)合干預組；（7）LPS+p300SiRNA聯(lián)合干預組；（8）LPS+c-mybSiRNA聯(lián)合干預組；（9）對照組：加入RPMI 1640，使培基總體積等于前面干預組。轉染前將Lipofectamine 2000與Opti-MEM混合，靜置5 min，再與經(jīng)Opti-MEM稀釋的過表達或干擾質?；靹颍o置20 min后緩慢加入RAW246.7，4 h后加入LPS，繼續(xù)于37 ℃、5%CO條件下培養(yǎng)48～72 h。搜集活力理想細胞數(shù)量5×10個，根據(jù)《分子克隆實驗指南》進行胞核蛋白提取、SDS-PAGE轉膜以及封閉操作。分別加入兔抗小鼠p65和p300單克隆抗體（稀釋度1∶1000）以及c-myb以及β-actin單克隆抗體（稀釋度1∶2000），4 ℃孵育過夜；TBST洗膜5 min×3次，再加入HRP標記的二抗（稀釋度1∶1000），室溫孵育2 h；洗膜后ECL顯影。AlphaEase FC Version 4 軟件檢測蛋白條帶的吸光度（）值，A目的蛋白/AGAPDH的比值視為表達水平。

1.7 染色質免疫沉淀-測序（Chip-seq）技術分析炎癥基因相應區(qū)域H3K27乙?；揎椧约稗D錄因子的結合水平

各干預組選取5×10個RAW 264.7細胞（經(jīng)MTT檢測活力在80%以上），采用甲醛固定以及甘氨酸終止固定。室溫搖晃5 min后，4 ℃離心并用預冷PBS清洗，后使用1 mL含有抑制劑的緩沖液裂解，冰上孵育10 min。冰上超聲（功率設置為50 W，共計8次，每次1 min，間隔1 min）打斷DNA 片段至100～500 bp 大小，4 ℃、14 000 r/min離心10 min，保留上清。均分成2管，其中1管加入2 μg IgG抗體作為Chip 樣品，另1管加入2 μg兔抗小鼠p65、p300 或者乙?；疕3K27 單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。之后4 ℃、14 000 r/min離心15 min，棄上清。elutionbuffer進行2次洗脫，振蕩15min，14000r/min離心10 min后搜集上清。后利用DNA 快速PCR 純化試劑盒進行DNA純化，賽默飛200 超微量分光光度計檢測DNA濃度。篩選出100～200 bp產(chǎn)物，3'端連接A堿基以及測序接頭，委托上海歐意生物醫(yī)學科技有限公司進行高通量測序。利用CisGenome v2.0軟件將測序數(shù)據(jù)格式化為wig文件，上傳IGV_2.9.4系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)可視化。重點分析EMSA驗證的結合位點的附近范圍，對比基因組序列為mouse_mm10，錯配不超過2個堿基的數(shù)據(jù)可被利用，最后得到p65、p300 以及乙?；疕3K27結合峰（peak）的圖像結果。

1.8 RAW246.7分泌IL-6 以及TNF-α水平測定

2.3.1 p65、p300以及c-myb在RAW246.7胞內的表達無相互影響 Western blot 對各干預組RAW246.7 胞內p65、p300 以及c-myb 的檢測結果顯示（圖7A～D），pEGFp-L1-p300以及各種干擾質粒均可以上調或者遏制相應蛋白的表達（＜0.05）；然而p65、p300以及c-myb各自的表達均互不干涉。

1.9 統(tǒng)計學分析

而企業(yè)之間的合并也分多種，比如中國遠洋和中國海運合并為中遠海運集團，屬于國企之間的合并重組，比如順豐與夏輝合并為新夏輝，屬于中外合資。

2 結果

2.1 RAW246.7胞內p300的表達與LPS刺激強度存在顯著關聯(lián)

聯(lián)合UCSC數(shù)據(jù)庫（http://genome.ucsc.edu/）以及轉錄因子結合位點鑒別工具PROMO 網(wǎng)站（http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3）對鼠IL-6以及TNF-α的基因結構以及啟動子部位的轉錄因子結合位點進行預測，顯示存在較為密集的為核因子p65以及MYB類轉錄因子成員c-myb的結合位點，而未見p300結合位點（圖1）。根據(jù)string生物信息學數(shù)據(jù)庫以及免疫共沉淀檢測結果，推測輔助激活因子p300是通過c-myb的介導才能夠結合于IL-6以及TNF-α啟動子，而并非直接結合。據(jù)此為p65以及c-myb各設計出2條寡聚核苷酸引物（分別對應圖1中a、b區(qū)域，p300與c-myb共用相關寡聚核苷酸引物），覆蓋了至少1個轉錄因子結合位點，同時根據(jù)轉錄起始位點（TSS）之后的內含子（對應圖1中c區(qū)域）序列，設計1條大小相當?shù)锤采w轉錄因子結合位點的引物，另外還準備了標準陽性引物作為參照,全部序列信息見表1。配置好SDS-pAGE（50 g/L），按順序加入寡聚核苷酸、標準陽性引物、近紅外染料（IRDye-680）以及p65、p300或者c-myb純蛋白提取物。室溫下避光孵育30 min后點入凝膠點樣孔中，80 V恒定電壓下電泳1.5 h，待染料接近凝膠底部時停止，紅外熒光成像系統(tǒng)掃描，選擇650 nm波長讀取結果。

隨著社會的變化與發(fā)展，動物疫病的流行趨勢也發(fā)生了一定的變化，這使得許多疫病以及病毒如果采用常規(guī)的方法，則難以檢查出來，等到疫病爆發(fā)后，再采取相應的防治方法，那么就會對社會造成巨大的危害。而采用動物疫病監(jiān)測，就能夠對一些難以發(fā)現(xiàn)的疫病進行提前監(jiān)測，使相關部門能夠進行提前預防，以便對疫病的危害進行控制。

2.2 p300可在c-myb介導下結合于炎癥基因啟動子

免疫共沉淀結果表明c-myb抗體能夠提取到p300的蛋白成分，與input組結果類似，而IgG則無法獲取，明確了p300與c-myb在RAW246.7核內的結合（圖4）。

Western blotting法對10 個代表基因蛋白產(chǎn)物的表達水平驗證結果顯示與基因芯片檢測結果吻合，即隨著LPS刺激強度增加，p65與p300的表達逐步上升（圖3A、B，＜0.05）。

正態(tài)分布的定量資料均采用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用最小顯著差異法（LSD）。利用IBM SPSS Statistics 25軟件進行分析，＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

Hermann Gretsch說：“我們不再提供那些讓消費者購買一段時間后，就因為產(chǎn)品不實用、過時及退流行而棄置不用的產(chǎn)品”。他的設計觀念在今天看來依舊如新?？梢?，實用功能是其設計的根本。無裝飾是包豪斯的風格，因此陶瓷傾向簡潔純白。格羅佩斯生前最后設計委托案TAC 一號茶具，雖然線條柔和許多，仍屬包豪斯風格，符合簡潔幾何外形、“形式追隨功能”等原則。整套茶具以圓為主，握把像細長的門把，蓋紐設計成鉤子的造型，這并非是無用的裝飾，極具功能性，使用時，用大拇指可以輕易地拉起壺蓋和壺內的過濾器，避免倒水時，壺蓋掉落得尷尬，使用非常方便。該設計造型簡潔明快，沒有任何多余的裝飾，充分表達了包豪斯的精神。

EMSA檢測相應的p65、p300以及c-myb的純蛋白提取物與IL-6以及TNF-α相應部位的結合情況，顯示同陽性參照，以2基因啟動子a，b區(qū)域為模板合成的有關探針與p65以及c-myb均能夠結合，而內含子c區(qū)域則不能結合（圖5A、C，圖5D、F）；且p300不能結合于上述a，b區(qū)域（圖5B、E）。Chip-qPCR證實當c-myb存在時，p65以及p300抗體均能夠沉淀和擴增得到炎癥基因啟動子a、b區(qū)域附近的片段（圖6A，上排）；c-myb被表達抑制時，p65抗體仍然能夠沉淀和擴增而獲得相應片段，但p300抗體不能獲得（圖6B，下排）。

2.3 P300誘導的乙?；揎梾⑴cLPS誘導的炎癥介質合成

采用ELISA 法檢測培基中IL-6 以及TNF-α質量濃度。在酶標包被板上設置標準品孔、待測樣本孔，分別加入標準以及待測樣本各10 μL，37 ℃下孵育30 min。酶標工作液洗板3 次后加入顯色劑，37 ℃避光顯色15 min，后加入終止液。采用酶標儀測定吸光度值，再根據(jù)標準曲線求得各待測孔的質量濃度。

2.3.2 p300可促進炎癥基因啟動子區(qū)域H3K27乙?；瑥亩谆痯65結合和激活轉錄 Chip-seq對各處理組炎癥基因相應區(qū)域（IL-6為第5號染色體的30 003 000～30 015 000；TNF-α為第17 號染色體的35 195 000～35 200 000范圍）p65、p300以及乙?；疕3K27結合水平的分析結果（圖8A、B），ELISA對各組炎癥介質合成水平的檢測結果顯示各干預組炎癥基因啟動子區(qū)域p65、p300和乙?；疕3K27的結合量以及IL-6和TNF-α表達水平的變化規(guī)律基本一致（圖9）。相比于對照組，p300過表達質粒轉染以及LPS刺激均可導致炎癥基因啟動子部位結合的p300和H3K27乙?；揎椝皆黾?，從而促進p65與啟動子的結合和炎癥基因轉錄（＜0.05）。然而c-myb 被表達抑制時，p300 過表達以及LPS刺激誘導的炎癥基因啟動子部位p65、p300以及乙酰化H3K27結合水平改變和炎癥介質合成均被遏制（＜0.05）。在p65干擾相關組別中，p65與啟動子的結合以及炎癥基因轉錄同樣被遏制（＜0.05），但未對p300的結合以及H3K27的乙酰化修飾水平造成影響。

隨著越來越多的立法者加入其中，2015年國會要求NIH為阿爾茨海默病的研究準備一份“專業(yè)判斷”的預算，這也是一份實現(xiàn)2025年目標所需要的愿望清單，該清單會繞過聯(lián)邦預算程序，直接提交給總統(tǒng)和國會。此前，只有癌癥和艾滋病的研究才能享受這種特殊待遇。

3 討論

隨著生物醫(yī)學研究技術的不斷進步，表觀遺傳修飾與人類疾病的關聯(lián)被逐步揭示，很多不能夠利用孟德爾遺傳法則解釋的發(fā)病現(xiàn)象，卻可以被DNA甲基化以及組蛋白修飾等效應加以解釋；且相關的修飾激動或者抑制策略，同樣可能應用于臨床疾病的干預，提示學術界需要更多從表觀遺傳修飾的角度來探討相關疾病的發(fā)生機制。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，武陵山片區(qū)道地藥材血藤果之中的提取物山姜素可激活組蛋白去乙?；窰DAC1以及DNA甲基轉移酶DNMT3A，從而誘導炎癥基因IL-6啟動子部位的H3K9以及CpG二核苷酸分別發(fā)生去乙酰化和甲基化修飾，導致IL-6的合成抑制。以上發(fā)現(xiàn)表明相關表觀遺傳修飾介入了炎癥介質表達的過程，因此在經(jīng)典刺激物質LPS所造成的炎癥激活過程中，表觀遺傳修飾可能同樣扮演了重要角色。

在導致基因表達激活的表觀遺傳修飾當中，H3K27乙酰化修飾研究得比較深入，其多由輔助激活因子p300誘導。因為乙?；鶊F的加入干擾了核小體中堿性氨基酸與DNA之間的靜電吸引力，使相鄰核小體之間的聚集力減少，導致染色質開放，有利于轉錄因子結合于順式作用元件，從而激活基因轉錄。本次研究中，我們利用LPS刺激RAW246.7，并采用小鼠表達譜芯片進行差異表達基因的“GO”分析，證實了LPS刺激可造成RAW246.7胞內炎癥反應活化。聯(lián)合WB技術，提示除了經(jīng)典核因子p65，尚有p300的表達與LPS刺激強度呈顯著關聯(lián)，表明后者可能在LPS誘導的炎癥介質合成過程中起到重要作用。

The azimuth DOA hk;l(t) and elevation DOA uk;l(t) can be expressed as

為了進一步揭示p300誘導炎癥介質合成的分子機制，我們論證了p300 與炎癥基因啟動子存在結合現(xiàn)象。根據(jù)已有報道提示，p300獨立存在時穩(wěn)定性較差，多數(shù)情況下是與其它分子伴侶結合后才可定位于靶基因以發(fā)揮表達調節(jié)作用，其中報道較多的為CREB結合蛋白（CBP），據(jù)此推測p300/CBP復合物才是真正發(fā)揮乙?；揎椬饔玫姆肿?。還有研究報道在造血或腫瘤干細胞中，p300通過與輔助激活因子c-myb結合的方式以激活某些原癌基因表達，故p300/c-myb復合物可能與腫瘤的惡性分化有關。接下來我們利用PROMO數(shù)據(jù)庫預測到IL-6以及TNF-α啟動子部位均存在p65以及c-myb結合位點，但并無p300結合位點，故推測p300與炎癥基因啟動子的結合可能依賴于cmyb介導，而接下來的免疫共沉淀則恰好證實了p300與c-myb在RAW246.7內的結合。另外EMSA還證實了炎癥基因啟動子相關序列與p65以及c-myb蛋白提純物存在結合現(xiàn)象，而p300 卻不能結合；并且ChipqPCR亦證明當c-myb表達被抑制時，p300抗體不能沉淀和擴增得到相應的炎癥基因啟動子序列片段。綜上，研究結果支持在RAW246.7內，p300通過與c-myb結合后再定位于炎癥基因啟動子部位，從而實現(xiàn)對基因轉錄的調控作用。

我們進一步采用過表達或干擾質粒轉染策略以及WB和ELISA檢測方法，聯(lián)合熱門的蛋白質-DNA互作實驗技術-chip-seq，揭示了p300誘導的乙酰化修飾參與LPS 誘導的炎癥介質合成過程。首先通過對RAW246.7轉染p65、p300以及c-myb 過表達以及干擾質粒，證實了3者均不干涉對方表達。雖然轉染p300過表達質粒不影響p65合成，但過表達的p300結合于炎癥基因啟動子部位并造成附近H3K27發(fā)生乙?；揎?，從而易化p65與啟動子結合和促進炎癥介質合成，產(chǎn)生與LPS刺激類似的效果。同時發(fā)現(xiàn)當c-myb缺失時，p300與炎癥基因啟動子的結合、H3K27的乙?；揎椧约皃65的結合水平均被遏制，因此逆轉了LPS刺激或p300過表達質粒對炎癥介質合成的促進效果。另外在p65干擾相關組別中，p65與啟動子的結合以及炎癥基因合成均被抑制，但卻未對p300的結合以及H3K27的乙?；揎椝皆斐捎绊憽＞C上我們推測，LPS誘導的p65以及p300合成均參與了炎癥介質的表達調控，但兩者的作用機制存在較大差異：p65結合于炎癥基因啟動子部位后可直接發(fā)揮轉錄激活作用；而p300需要在cmyb介導下才能結合，進一步的轉錄激活效應則依賴于乙?；疕3K27后造成的染色質結構松弛，使p65更易結合而得以實現(xiàn)。

綜上所述，本研究證實了p300在LPS誘導RAW246.7炎癥介質合成過程中起到了積極作用，提示逆轉p300與炎癥基因啟動子的結合或干預其乙酰化修飾能力，同樣可能成為逆轉與LPS關聯(lián)的炎癥失衡的有效方法。鑒于巨噬細胞并非人體內唯一的炎癥細胞種類，下一步還應考慮在中性粒細胞以及肥大細胞等對象中開展類似研究，探討p300是否通過同樣機制介導LPS誘導的炎癥介質合成；此外還應利用疾病動物模型來驗證上述作用機制的可重復性，為證明p300在臨床炎癥紊亂領域的干預價值提供更多可靠依據(jù)。