皖南蝮蛇毒抑瘤組分-Ⅰ通過MMP2抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞體外血管生成擬態(tài)

三陰性乳腺癌（TNBC）是雌激素受體、孕激素受體和人類表皮生長因子受體-2表達(dá)均為陰性的一類乳腺癌。與其他類型的乳腺癌相比，TNBC在年輕女性群體中的發(fā)病率高，惡性程度高，患者的預(yù)后差，患者死亡的主要原因是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，采取有效的預(yù)防及治療TNBC的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為乳腺癌治療的關(guān)鍵。

血管生成擬態(tài)（VM）是一種腫瘤微循環(huán)模式，是高侵襲性腫瘤細(xì)胞為了滿足自身的血供，通過自身變形和細(xì)胞外基質(zhì)重塑而形成的一種不需要內(nèi)皮細(xì)胞參與生成的腫瘤血管。臨床研究已經(jīng)證實(shí)TNBC組織中存在VM，且VM陽性表達(dá)率與腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移情況相關(guān)。開發(fā)新型有效的藥物抑制TNBC中血管擬態(tài)的出現(xiàn)，對于預(yù)防與治療TNBC的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。作為基質(zhì)金屬蛋白酶的重要成員，基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）被證實(shí)不僅與乳腺癌的分級和浸潤有關(guān)，更被發(fā)現(xiàn)與乳腺癌組織內(nèi)的VM形成密切相關(guān)。

班干部是班主任開展工作的得力助手，是形成班集體的核心力量。班風(fēng)建設(shè)是否順利和卓有成效，很大程度上取決于班干部的能力。因而，選擇和培養(yǎng)班干部，是班主任必須認(rèn)真做好的一項(xiàng)工作，不能魯莽行事，要三思而行。班干部是要通過學(xué)生自薦、班主任考察、候選人發(fā)表自己對班干部工作的見解，再經(jīng)同學(xué)們投票選出，最后根據(jù)個人的能力和特長，再任命各班委成員，使這些班委成員充滿信心，充分發(fā)揮自己的才能，做好自己的本職工作。

第三，閩商團(tuán)隊(duì)協(xié)作往往因?yàn)殚}商注重逐利、講求實(shí)用的經(jīng)營觀念而容易受到懷疑、歧視、排擠，影響團(tuán)隊(duì)整體形象和利益。閩商的商品經(jīng)濟(jì)意識較濃，具有靈活的商務(wù)頭腦，強(qiáng)調(diào)實(shí)用主義，注重逐利。然而重商務(wù)實(shí)走到極端就是唯利是圖和市儈哲學(xué)，一些閩商慣于利用政策漏洞求發(fā)展，對符合市場利益但違反法規(guī)的生意，向來不視為恥辱。在過去的某些時候，曾經(jīng)有一些閩商鋌而走險，越過了法律和商業(yè)道德的底線。這種將利益凌駕于法律、道德之上的價值觀，向來為傳統(tǒng)社會所不齒。而為了利益，甚至置基本的商業(yè)游戲規(guī)則于不顧，更加重了其它商人對閩商的抵制和歧視，影響了閩商團(tuán)隊(duì)的整體形象，損害了閩商的長遠(yuǎn)利益，也限制了閩商的發(fā)展。

從毒蛇頭部毒腺中分泌出來的蛇毒是由蛋白質(zhì)、多肽、酶類及其它小分子組成的復(fù)雜混合物，其中蛋白和多肽占其干重的約95%。研究證實(shí)蛇毒不僅對普通型的乳腺癌細(xì)胞有殺傷作用，對TNBC細(xì)胞MADMB-231也有細(xì)胞毒性效應(yīng)。雖然蛇毒可以抑制TNBC腫瘤細(xì)胞的增殖，但是其能否通過抑制TNBC腫瘤細(xì)胞的血管擬態(tài)功能減少TNBC的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)尚未見研究。皖南蝮蛇毒抑瘤組分I（AHVAC-I）是皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所自皖南蝮蛇蛇毒中提取得到的組分。本文通過研究AHVAC-I 對TNBC 細(xì)胞MDA-MB-231 的體外血管生成擬態(tài)的影響及作用機(jī)制，初步探討AHVAC-I潛在的抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的抗腫瘤機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 化學(xué)試劑與實(shí)驗(yàn)材料

AHVAC-I為皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所提純制備的凍干粉，臨用前雙蒸水溶解成適用濃度。TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231（中科院細(xì)胞庫），高糖DMEM與0.25%胰酶（GIBICO），胎牛血清（NSERA），CCK8檢測試劑（碧云天），基質(zhì)膠（BD），Trizol、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及定量PCR檢測試劑盒（全式金），MMP2 ELISA試劑盒（Abcam），MMP2抗體（CST）。

1.2 CCK8檢測

ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對照組和5-Fu組相比，AHVAC-I作用24 h后，MDA-MB-231細(xì)胞分泌生成的MMP2降低（圖3A）。定量PCR與Western blot顯示，AHVAC-I作用可抑制MMP2在MDA-MB-231細(xì)胞的表達(dá)，且不同濃度AHVAC-I作用后的MMP2表達(dá)水平的改變呈劑量依賴效應(yīng)（＜0.01，圖3B～D）。

1.3 血管生成擬態(tài)實(shí)驗(yàn)

將AHVAC-I作用24 h后的MDA-MB-231細(xì)胞置于基質(zhì)膠上培養(yǎng)24 h。結(jié)果顯示，陰性對照組細(xì)胞相互連接，呈現(xiàn)出單個環(huán)狀或多個環(huán)狀相連的網(wǎng)狀樣血管結(jié)構(gòu)。相較于空白對照組，AHVAC-I 處理后的MDAMB-231細(xì)胞形成的管道數(shù)目減少（＜0.05），且管道形成數(shù)量的減少呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。10、20 μg/mL AHVAC-I處理后MDA-MB-231細(xì)胞形成的管道數(shù)目低于與5-Fu（50 μg/mL）處理組（＜0.05，圖2A）。

1.4 MDA-MB-231CM中MMP2的含量檢測

收集AHVAC-I作用MDA-MB-231細(xì)胞24 h后的培養(yǎng)上清（MDA-MB-231CM），采用雙抗體酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測MMP2濃度，操作方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 基因表達(dá)水平檢測

使用CCK8檢測不同濃度AHVAC-I（5、10、20、40、80、100 μg/mL）暴露后的MDA-MB-231細(xì)胞，24 h后5、10、20 μg/mL濃度組MDA-MB-231細(xì)胞的活力降低不到30%，但40 μg/mL濃度組細(xì)胞的活力下降53.61%，IC值為32.96 μg/mL（圖1）。根據(jù)IC值將AHVAC-I的作用濃度定為5、10、20 μg/mL。

Analyzed metabolic changes in patient groups are shown in Table 3.

采用OringinPro 8.0統(tǒng)計(jì)軟件處理結(jié)果，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，組間比較采用檢驗(yàn)，以＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

將MDA-MB-231接種于6孔板，對各組細(xì)胞進(jìn)行AHVAC-I處理，24 h后收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞提取蛋白后用BCA試劑盒定量測定蛋白濃度后轉(zhuǎn)至PVDF膜5%脫脂奶粉封閉1 h，按1∶1000比例加入GAPDH、MMP2抗體，4 ℃上孵育過夜，沖洗后，按1∶5000比例稀釋HPR標(biāo)記二抗，室溫下孵育1 h，洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，顯影。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 AHVAC-I抑制MDA-MB-231細(xì)胞活力

Trizol提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行RTPCR檢測。反應(yīng)條件為：90 ℃30 s、90 ℃10 s、55 ℃30 s，進(jìn)行40個循環(huán)。mRNA表達(dá)水平以管家基因GAPDH為內(nèi)參，RT-PCR的結(jié)果用2法分析，每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)。

2.2 AHVAC-I抑制MDA-MB-231細(xì)胞體外血管擬態(tài)的形成

將Matrigel加到預(yù)冷的24孔板中，300 μL/孔，37 ℃下培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min后，在每孔內(nèi)接種等體積的濃度為1×10/mL MDA-MB-231細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化及管道形成情況，計(jì)數(shù)管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量，重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

2.3 AHVAC-I抑制MDA-MB-231細(xì)胞MMP2分泌

收集對數(shù)生長期的內(nèi)皮細(xì)胞，制備成濃度為5×10/mL的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中（100 μL/孔）。按實(shí)驗(yàn)分組（對照組、AHVAC-I實(shí)驗(yàn)組、5-Fu組）將96孔板置于培養(yǎng)箱中37 ℃、5%CO條件下培養(yǎng)24 h 后加入不同濃度AHVAC-I 培養(yǎng)24 h，加入10 μL/孔CCK-8試劑，于培養(yǎng)箱內(nèi)培育1 h后，用酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測溶液光密度。

2 nmol/L 重組MMP2 蛋白處理組加入20 μg/mL AHVAC-I作用細(xì)胞，24 h后置于基質(zhì)膠上培養(yǎng)24 h。結(jié)果顯示，相較于未加入重組MMP2 蛋白的對照組，MDA-MB-231細(xì)胞體外成管的能力提高（＜0.05，圖4）。20 μg/mL AHVAC-I 加入Ad5/MMP2感染后的MDAMB-231細(xì)胞，24 h后置于基質(zhì)膠上培養(yǎng)24 h。相較未加入AHVAC-I的對照組，AHVAC-I組的細(xì)胞體外成管形成的管道數(shù)目受到抑制（＜0.05，圖5）。

2.4 提高M(jìn)MP2 水平有效減弱AHVAC-I 抑制MDAMB-231細(xì)胞體外血管擬態(tài)的功能

作為高中生，面對當(dāng)前社會發(fā)展所存在的環(huán)境污染問題，要能夠予以足夠的重視是。并積極參與各種社會實(shí)踐活動來提高自身環(huán)境保護(hù)意識。只有這樣才能為推動我國社會經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展奠定良好的基礎(chǔ)。對于如何提高我們自身環(huán)境保護(hù)意識，則需要在教師的引導(dǎo)下來參與實(shí)踐活動。具體如下。

3 討論

運(yùn)用內(nèi)皮血管靶向藥物治療TNBC被證實(shí)無法改善TNBC患者的臨床結(jié)局。有研究認(rèn)為這與TNBC組織中高表達(dá)的VM有關(guān)。作為由腫瘤細(xì)胞相互連接形成的不規(guī)則管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，VM在腫瘤早期血液供應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，且隨著腫瘤的不斷增大，VM 可與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，構(gòu)成馬賽克樣的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)排列于TNBC組織VM通道周邊的腫瘤細(xì)胞相較與其它部位的腫瘤細(xì)胞具有高度惡性、可塑性和低分化的特性，這類細(xì)胞可通過分泌蛋白酶降解周邊的結(jié)締組織，介導(dǎo)TNBC的早期轉(zhuǎn)移，且VM陽性的TNBC患者的5 年生存率顯著低于VM陰性者。近年來已經(jīng)有多種新藥被發(fā)現(xiàn)具有抑制TNBC細(xì)胞VM的能力，如馬錢子堿、康普瑞汀、恩替諾特，可見開發(fā)針對乳腺癌細(xì)胞VM 功能的靶向藥已經(jīng)成為研發(fā)有效抑制TNBC轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的研究熱點(diǎn)。

大學(xué)生“蟻?zhàn)濉钡某霈F(xiàn)絕非偶然，該群體是內(nèi)外因素綜合作用下的產(chǎn)物。本文將大學(xué)生“蟻?zhàn)濉碑a(chǎn)生的原因分為內(nèi)因和外因，由此展開討論。

蛇毒作為天然毒性蛋白混合物，其組分被發(fā)現(xiàn)在抗乳腺癌方面具有良好的作用。如有研究從印度眼鏡蛇毒中分離的NN-32蛋白毒素顯示出對TNBC細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231 的顯著細(xì)胞毒性，且呈劑量和時間依賴性。有研究從浙江尖吻蝮蛇毒中分離純化得到的抗腫瘤活性多肽在10 μg/mL濃度時對MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制率可達(dá)到30%～60%。有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，與納米金顆粒偶聯(lián)后的眼鏡蛇蛇毒成分NKCT1，可以有效地抑制TNBC細(xì)胞MCF-7的遷移能力。但是蛇毒是否具有抑制乳腺癌細(xì)胞的VM形成的能力，目前尚未見報道。AHVAC-I是皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所自皖南蝮蛇蛇毒中提取得到的組分，既往研究證實(shí)它對多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制效應(yīng)。本研究通過比較AHVAC-I對于MDA-MB-231細(xì)胞體外三維培養(yǎng)中形成管腔能力的影響，探索AHVAC-I 是否具有抑制TNBC組織中VM形成的功能。研究結(jié)果表明，與對照組相比，AHVAC-I處理后的MDA-MB-231細(xì)胞在基質(zhì)膠中形成的管形，無論是小管的數(shù)量還是小管的面積都顯著降低，且AHVAC-I抑制MDA-MB-231細(xì)胞小管形成能力呈現(xiàn)劑量依賴模式。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，10 μg/mL 的AHVAC-I抑制小管形成的能力強(qiáng)過50 μg/mL的5-Fu的抑制能力。說明AHVAC-I可顯著抑制TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231體外管道形成能力，提示AHVAC-I可通過抑制MDA-MB-231細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，改善患者生存。

MMP2由腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞以酶原形式分泌，活性的MMP2參與到腫瘤生長發(fā)展的各個階段，被廣泛認(rèn)為是惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)攜MMP2靶向超聲造影能夠很好地顯像早期腫瘤，如卵巢癌組織中VM的形成。研究發(fā)現(xiàn)相較于正常的乳腺組織和乳腺良性腫瘤，乳腺癌組織中活性MMP2的表達(dá)水平顯著升高，且在乳腺癌組織中VM形成的早期，MMP2即出現(xiàn)高表達(dá)；下調(diào)腫瘤細(xì)胞中MMP2的生成可顯著抑制乳腺癌VM的形成。本研究結(jié)果表明，AHVAC-I 作用后MDA-MB-231 細(xì)胞分泌生成的MMP2水平顯著下降。這一結(jié)果與研究發(fā)現(xiàn)YAP抑制劑通過抑制MMP2生成抑制腫瘤細(xì)胞管形生成能力相一致。本研究進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提高M(jìn)MP2水平可顯著抑制AHVAC-I 抑制的VM 的能力，提示AHVAC-I 作用可通過抑制MMP2 分泌合成，抑制MDA-MB-231細(xì)胞的VM。

綜上所述，本研究通過探究AHVAC-I抑制腫瘤細(xì)胞分泌生成MMP2，有效抑制TNBC 細(xì)胞MDA-MB-231的體外VM的能力。揭示了利用AHVAC-I靶向抑制MMP2生成抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞VM，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的治療前景，為進(jìn)一步探索天然藥物AHVAC-I的臨床價值提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。