二甲雙胍和LPS通過轉(zhuǎn)錄因子RUNX2調(diào)控NFATc2基因的轉(zhuǎn)錄

T細(xì)胞活化的核因子（NFAT）是一類轉(zhuǎn)錄因子，在T細(xì)胞受體激活后負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)。NFATc2是NFAT家族中的一員。NFATC2約占靜止期T細(xì)胞中總NFAT的80%～90%，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如干擾素γ、白細(xì)胞介素4、IL-5 和IL-13的表達(dá)。NFAT蛋白在靜止期T細(xì)胞中以磷酸化蛋白的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，一旦T細(xì)胞通過T細(xì)胞受體被激活，T細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平持續(xù)升高進(jìn)而使鈣離子依賴性的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶激活。活化的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶進(jìn)一步使NFAT蛋白發(fā)生去磷酸化，并移位至細(xì)胞核，從而驅(qū)動(dòng)細(xì)胞因子和細(xì)胞表面受體等靶基因的表達(dá)。NFAT蛋白隨后被糖原合酶激酶-3重新磷酸化并轉(zhuǎn)移回細(xì)胞質(zhì)。除了在淋巴細(xì)胞中起到關(guān)鍵作用外，NFAT蛋白在心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中也廣泛表達(dá)，對(duì)心肌和骨骼肌的發(fā)育發(fā)揮重要的作用。

首先，重視預(yù)算編制，在預(yù)算編制中，重點(diǎn)關(guān)注經(jīng)費(fèi)支出數(shù)據(jù)，確保這類數(shù)據(jù)編制的合理性和有用性。其次，預(yù)算執(zhí)行過程中，加強(qiáng)對(duì)經(jīng)費(fèi)開支數(shù)據(jù)的監(jiān)控和審核，針對(duì)實(shí)際經(jīng)費(fèi)開支情況與預(yù)算數(shù)進(jìn)行對(duì)比分析，查找原因，及時(shí)提出改進(jìn)建議。最后，重視預(yù)算管理，有條件的事業(yè)單位，比如自收自支型事業(yè)單位，可以將經(jīng)費(fèi)開支情況與績(jī)效考核相掛鉤，嚴(yán)格經(jīng)費(fèi)管控，對(duì)經(jīng)費(fèi)超標(biāo)行為嚴(yán)厲打擊，防止資金浪費(fèi)。

有研究發(fā)現(xiàn)，NFATc2抑制T輔助細(xì)胞（Th2）分泌Th2細(xì)胞因子，減輕Th2介導(dǎo)的過敏性免疫反應(yīng)，同時(shí)抑制NFATC2會(huì)削弱Th2的反應(yīng)，從而緩解化療藥物天冬酰胺酶引起的超敏反應(yīng)。更有學(xué)者指出，NFATc2是人類黑色素瘤的潛在治療靶點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)NFATC2的研究主要聚焦在NFATC2調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能以及NFATC2在腫瘤篩查中診斷價(jià)值，然而有關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控NFATC2轉(zhuǎn)錄表達(dá)的研究鮮有報(bào)道，NFATC2在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控仍然不明確。有研究初步證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子RUNX2 是NFATC2 基因潛在的轉(zhuǎn)錄因子，但RUNX2如何上調(diào)NFATC2基因的表達(dá)以及RUNX2在NFATC2基因上的具體結(jié)合位點(diǎn)尚不清楚。RUNX2對(duì)NFATC2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控仍需進(jìn)一步明確。

圖3為設(shè)計(jì)線寬為100 μm,方阻數(shù)為20的NiCr薄膜電阻的實(shí)際線寬。由圖3可見,制備的薄膜電阻的線寬精度≤±5%。

因此，為更好地闡明NFATc2 表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，本研究通過構(gòu)建人NFATc2基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒pGL3-NFATc2-promoter，并轉(zhuǎn)染到人胚腎上皮細(xì)胞293F中驗(yàn)證其啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步運(yùn)用點(diǎn)突變技術(shù)突變轉(zhuǎn)錄因子RUNX2潛在結(jié)合位點(diǎn)探究二甲雙胍和脂多糖（LPS）對(duì)NFATc2轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

293F細(xì)胞株、pGL3-basic質(zhì)粒、pRL-TK質(zhì)粒、細(xì)菌脂多糖LPS、二甲雙胍由本實(shí)驗(yàn)室保存?；蚪MDNA提取試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞DH5α、凝膠回收試劑盒、超保真DNA聚合酶、一步法克隆試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染脂質(zhì)（Gibco）。限制性內(nèi)切酶Ⅰ和d Ⅲ（NEB）。瓊脂粉（Agar）、胰蛋白胨（Tryptone）、酵母浸出粉（Yeast Extract）（Oxoid）。引合成與測(cè)序由北京擎科生物科技有限公司完成。所用儀器：PCR 儀（Bio-Rad）；電泳儀（北京百晶）；凝膠圖像分析儀Tanon-2500（上海天能公司）；Spectra MAX M5酶標(biāo)儀（Molecular Device）；超微量蛋白核酸分析儀Biodrop（英國(guó)柏楉）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和DNA提取

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次。應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在納入的10篇研究[2-11]中，均報(bào)道了治療的疾病控制率，樣本量共620例：替吉奧組309例，卡培他濱組311例。各研究間具有同質(zhì)性（P=0.98，I2=0%），采用固定效應(yīng)模型。結(jié)果顯示，替吉奧組與卡培他濱組在疾病控制率上無明顯差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[OR=1.18，95%CI：（0.84，1.66），P=0.34]，見圖 1。

其次，這種思維差異體現(xiàn)在句子的時(shí)間順序和邏輯順序上。英語的語法中存在時(shí)態(tài)，可以通過動(dòng)詞形式的變化來表現(xiàn)動(dòng)作發(fā)生的先后順序，同時(shí)還可以使用大量分詞和從句，用法靈活，可前可后。而漢語中不存在英語中的那些手段，敘事多靠并列結(jié)構(gòu)，所以更加依賴句中各成分之間的順序，尤其是漢語中的時(shí)間順序和邏輯順序。其中，較為典型的邏輯順序差異就是：英語句中習(xí)慣“先果后因”，而漢語卻喜歡“先因后果”。因此，在英譯漢時(shí)，我們就需要在理解句意的基礎(chǔ)上，按照事情發(fā)生的先后順序或者根據(jù)事件中所包含的邏輯順序，適當(dāng)?shù)卣{(diào)整譯文的順序，使其更符合漢語思維，如下例：

1.3 PCR擴(kuò)增人NFATC2基因啟動(dòng)子片段和回收純化

在USCS基因數(shù)據(jù)庫中查找人NFATC2基因的啟動(dòng)子序列，選取長(zhǎng)度為2170 bp（-2155 bp～+15 bp）的DNA 序列作為本項(xiàng)目研究的啟動(dòng)子片段。應(yīng)用CE Design V1.04引物設(shè)計(jì)軟件，以Ⅰ和dⅢ為酶切位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)上游引物5'-atttctctatcgataggtaccCCC CAGGCCCCTGCAGTA-3'和下游引物5'-cagtaccggaa tgccaagcttCGCGAGCTTCCTGCTCCG-3'。以基因組DNA為模板擴(kuò)增目的啟動(dòng)子片段：在PCR反應(yīng)管中依此加入ddHO，基因組DNA，上下游引物，2×Phanta Max Buffer，dNTP Mix，PhantaMax超保真DNA聚合酶。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸150 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃徹底延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，在切膠儀上切下目的產(chǎn)物并利用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。同時(shí)用相同的下游引物分別構(gòu)建2077 bp NFATC2 基因啟動(dòng)子片段（上游引物5'-atttct ctatcgataggtaccCTGATGCCTAAGTCCCAACCC-3'）、1802 bp NFATC2 基因啟動(dòng)子片段（上游引物5'-attt ctctatcgataggtaccTGGAATGATGGATGGCTTGG-3'），1651 bp NFATC2基因啟動(dòng)子片段（上游引物5'-atttctct atcgataggtaccCCCGTCTAATCTTCTCATCCTCA-3'），1083 bp NFATC2基因啟動(dòng)子片段（上游引物5'-atttctc tatcgataggtaccTTTAGTTACTGGGTCCTTATGCAGT G-3'）和323 bp NFATC2基因啟動(dòng)子片段（上游引物5'-atttctctatcgataggtaccCTGATGCCTAAGTCCCAACCC-3'）。

1.4 pGL3-basic質(zhì)粒雙酶切及回收純化

應(yīng)用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和dⅢ對(duì)pGL3-basic質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切條件為：pGL3-basic 質(zhì)粒2 μL（2 μg)，Ⅰ(10 U/μL)2 μL，dⅢ（20 U/μL）2 μL，10×CutSmart Buffer 5 μL，ddHO 39 μL，共50 μL。37 ℃酶切4 h，反應(yīng)完成后將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠回收。

1.5 重組和轉(zhuǎn)化

將293F細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d接種2×10細(xì)胞于24孔板中，在37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。直至細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，按照Lipofectamine 3000試劑盒操作說明，分別以0.8 μg/孔pGL3-basic質(zhì)粒（對(duì)照組）和pGL3-NFATC2-promoter質(zhì)粒（實(shí)驗(yàn)組）的劑量瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞，同時(shí)以0.1 μg/孔pRL-TK海腎熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)染效率內(nèi)參照，每組分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）參考《中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南 2014》［4］確診為慢性心力衰竭；（2）參考《室性心律失常中國(guó)專家共識(shí)》［5］確診為室性心律失常；（3）NYHA心功能分級(jí)Ⅲ—Ⅳ級(jí)；（4）左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）≤40%；（4）用藥及隨訪依從性高；（5）對(duì)本研究知情且簽署同意書。

1.6 陽性克隆的鑒定和質(zhì)粒抽提

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后，吸掉培養(yǎng)基，每孔細(xì)胞用PBS洗滌兩次。根據(jù)Vazyme公司的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（Dual Luciferase Reporter Assay Kit）操作說明，加入100 μL/孔細(xì)胞裂解液，室溫下振搖裂解5 min，吹打并吸取細(xì)胞裂解產(chǎn)物至1.5 mL離心管中，12 000 g常溫離心2 min。吸取20 μL細(xì)胞裂解上清至酶標(biāo)板中，加入100 μL/孔Luciferase Substrate，迅速混勻后讀取螢火蟲熒光素酶發(fā)光值。然后再加入100 μL Renilla底物工作液（螢火蟲熒光素酶終止液和海腎熒光素酶的底物），迅速混勻后讀取海腎熒光素酶發(fā)光值。每組細(xì)胞重復(fù)測(cè)量3次，以螢火蟲熒光素酶發(fā)光值與海腎熒光素酶發(fā)光值的比值作為衡量NFATC2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的依據(jù)。

1.7 NFATC2啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞

將回收得到的NFATC2啟動(dòng)子片段與pGL3-basic質(zhì)粒片段應(yīng)用重組克隆試劑盒進(jìn)行重組反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL 重組產(chǎn)物與50 μL 感受態(tài)細(xì)胞DH5α混勻，冰上靜置30 min，42 ℃熱激90 s，冰上放置3 min，加入600 μL LB 培養(yǎng)基（不含抗生素），37 ℃搖菌1 h（220 r/min），5000 r/min離心1 min，加入100 μL培養(yǎng)基重懸，取50 μL 涂于LB 固體培養(yǎng)平板（含Ampicillin）上，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。

1.8 NFATC2啟動(dòng)子活性鑒定

挑取5個(gè)菌落接種于800 μL的LB液體培養(yǎng)基（含Ampicillin）中，37 ℃搖菌4 h，取1 μL菌液進(jìn)行菌液PCR鑒定，挑選菌液PCR鑒定為陽性的菌液送至北京擎科生物科技有限公司測(cè)序進(jìn)一步鑒定。將測(cè)序鑒定正確的陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并提質(zhì)粒。

1.9 二甲雙胍和LPS對(duì)NFATc2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

293F 細(xì)胞轉(zhuǎn)染pGL3-1651 bp NFATC2-promoter質(zhì)粒24 h，分別給予二甲雙胍濃度梯度（2.5、5、10 mmol/L）和LPS濃度梯度（2、5、10、20μg/mL,）處理24 h后收集細(xì)胞測(cè)定各組熒光素酶活性。接著分別將pGL3-1651 bp NFATC2-promoter 質(zhì)粒和pGL3-1651bp NFATC2-promoter突變質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞24 h，接著給予二甲雙胍（10 mmol/L）和LPS（5μg/mL）處理24 h，收集細(xì)胞測(cè)定轉(zhuǎn)錄因子RUNX2結(jié)合位點(diǎn)突變前后各組熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

293F細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基接種至3.5 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞密度達(dá)95%，收集細(xì)胞。按照基因組DNA 提取試劑盒操作說明提取293F 細(xì)胞的基因組DNA，應(yīng)用超微量核酸分析儀Biodrop測(cè)定提取的基因組DNA產(chǎn)物濃度。

2 結(jié)果

2.1 NFATC2啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增

將pGL3-basic 空載質(zhì)粒和pGL3-NFATC2-promoter 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293F 細(xì)胞，24 h 后測(cè)得轉(zhuǎn)染pGL3-basic 空載質(zhì)粒組的熒光數(shù)值為0.18±0.18，轉(zhuǎn)染pGL3-NFATC2-promoter 質(zhì)粒組的熒光數(shù)值為0.55±0.09，pGL3-NFATC2-promoter 質(zhì)粒組比pGL3-basic空載質(zhì)粒組的熒光素酶活性高約3.04倍（=3.178,df=4,=0.0336，圖5）。

2.2 pGL3-NFATC2-promoter載體的構(gòu)建

應(yīng)用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和dⅢ對(duì)pGL3-basic質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，結(jié)果見圖1B，泳道2為未進(jìn)行雙酶切的pGL3-basic質(zhì)粒，泳道3-4為雙酶切的pGL3-basic質(zhì)粒，由于雙酶切破壞質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)，因此酶切的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠中的遷移速度較慢。凝膠回收酶切后的pGL3-basic質(zhì)粒，與NFATC2啟動(dòng)子片段進(jìn)行重組連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑取5個(gè)平板克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定（圖2），5個(gè)克隆均在2000 bp附近可見清晰條帶，與目的片段大小基本一致。挑選陽性克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示NFATC2基因啟動(dòng)子成功插入到pGL3-basic 載體中，所構(gòu)建質(zhì)粒與設(shè)計(jì)相符（圖3），且未發(fā)現(xiàn)堿基突變或缺失。同時(shí)，按照相同的方法利用已構(gòu)建好的pGL3-NFATC2-promoter重組質(zhì)粒為模板，構(gòu)建不同片段長(zhǎng)度的NFATC2基因啟動(dòng)子報(bào)告基因載體，分別為2077 bp（-2062 bp～+15 bp）、1802 bp（-1787 bp～+15 bp）、1651 bp（-1636 bp～+15 bp）、1083 bp（-1068 bp～+15 bp）和323 bp（-308 bp～+15 bp），凝膠電泳結(jié)果顯示各個(gè)片段擴(kuò)增條帶與相應(yīng)目的片段大小一致（圖4）。

2.3 NFATC2啟動(dòng)子報(bào)告基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后熒光素酶表達(dá)

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖1A），在2000 bp附近可見清晰條帶，與NFATC2基因啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增片段大小相符。對(duì)該片段進(jìn)行凝膠回收，測(cè)定濃度為136 ng/μL。

海島是我國(guó)海洋國(guó)土的重要組成部分，也是海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展及國(guó)防建設(shè)的重要基點(diǎn)。海島工業(yè)污染源較少，生活垃圾和生活污水是海島的主要污染來源；隨著海島的開發(fā)和建設(shè)大力推進(jìn)，生活垃圾和污水產(chǎn)量日益增加[1-3]。海島生活垃圾處理方式和設(shè)施的選擇，必須根據(jù)海島生活垃圾產(chǎn)生現(xiàn)狀和理化特征等基本資料和實(shí)際情況進(jìn)行設(shè)計(jì)。國(guó)內(nèi)對(duì)生活污染源的研究主要集中于內(nèi)陸農(nóng)村地區(qū)，海島地區(qū)生活污染物排放規(guī)律、理化特性研究較少。我國(guó)海島大部分面積較小，多為村鎮(zhèn)級(jí)海島。筆者以廣東省2個(gè)村鎮(zhèn)級(jí)海島(外伶仃島、東澳島)為研究地點(diǎn)，對(duì)生活垃圾產(chǎn)生量、理化特性和生活污水排放系數(shù)、污染物濃度進(jìn)行研究。

2.4 NFATC2啟動(dòng)子不同片段長(zhǎng)度的熒光素酶表達(dá)量

為了探究NFATC2啟動(dòng)子上的轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域及其潛在轉(zhuǎn)錄因子，我們構(gòu)建了6 個(gè)不同片段長(zhǎng)度的NFATC2啟動(dòng)子報(bào)告基因載體，分別是pGL3-2170 bp、pGL3-2077 bp、pGL3-1802 bp、pGL3-1651 bp、pGL3-1083 bp、pGL3-323 bp，并將其分別轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞，結(jié)果顯示6組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=121.6,＜0.001）。進(jìn)一步運(yùn)用Dunnett's多重比較檢驗(yàn)，顯示pGL3-1802 bp組與pGL3-2170 bp組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），其余各組與pGL3-2170 bp組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），而且轉(zhuǎn)染pGL3-1651 bp質(zhì)粒達(dá)到最大的熒光素酶表達(dá)量（圖6）。

2.5 LPS和二甲雙胍對(duì)NFATC2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用

將pGL3-1651bp報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293F細(xì)胞，分別使用LPS和二甲雙胍刺激細(xì)胞。LPS組4個(gè)不同濃度之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=6.811,=0.0065），而且均對(duì)NFATC2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性有激活作用，其中以5 μg/mL 的效果最顯著（圖7B）。然而二甲雙胍對(duì)NFATC2 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄具有雙向調(diào)節(jié)作用（=33.10,＜0.0001），低濃度的二甲雙胍（2.5 mmol/L）對(duì)NFATC2的啟動(dòng)子起抑制作用，而中高濃度的二甲雙胍（5、10 mmol/L）則對(duì)NFATC2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄具有激活作用。

為進(jìn)一步探究LPS和二甲雙胍調(diào)控NFATC2轉(zhuǎn)錄的潛在機(jī)制，將pGL3-1651 bp質(zhì)粒上轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變（圖8A），構(gòu)建pGL3-1651 bp突變質(zhì)粒（pGL3-1651bp-Mutation），并將轉(zhuǎn)染到293F細(xì)胞。結(jié)果顯示，RUNX2的結(jié)合位點(diǎn)突變后，LPS和二甲雙胍對(duì)NFATC2的轉(zhuǎn)錄激活作用下調(diào)（=0.0179，圖8B；＜0.0001，圖8C）。

3 討論

NFATc2可以抑制成年動(dòng)物軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，小鼠敲除NFATc2基因后導(dǎo)致關(guān)節(jié)外軟組織中的細(xì)胞自分化形成軟骨，而老年小鼠中一旦NFATc2蛋白喪乏功能將導(dǎo)致軟骨細(xì)胞不受控制地增殖。此外，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中NFATc2的表達(dá)明顯上調(diào)，NFATc2敲低后顯著抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖。由此可見NFATC2 在各種病理生理過程中扮演極其重要的作用。近年來越來越多的研究表明NFATC2與黑色素瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［，提示NFATC2很可能是黑色素瘤的潛在治療靶點(diǎn)。因此，本研究旨在通過構(gòu)建NFATC2熒光素酶報(bào)告基因探討NFATC2在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，為臨床篩查抗腫瘤藥物的分子生物學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本研究成功構(gòu)建了人NFATc2基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因，并在293F細(xì)胞中驗(yàn)證了其轉(zhuǎn)錄活性。與此同時(shí)，本研究構(gòu)建了6個(gè)不同片段長(zhǎng)度的NFATc2基因啟動(dòng)子報(bào)告基因載體，發(fā)現(xiàn)不同片段長(zhǎng)度的NFATc2 基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性不盡相同，與長(zhǎng)度為2170 bp 的NFATc2 基因啟動(dòng)子相比，長(zhǎng)度為1651、1083、323 bp的NFATc2基因啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)錄活性顯著增加，而長(zhǎng)度為2077 bp和1802 bp的NFATc2基因啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)錄活性或降低或不變，這與Kannan等研究結(jié)果基本一致。令人驚喜的是，我們證實(shí)片段長(zhǎng)度為1651 bp的NFATc2基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性最高，提示NFATc2基因啟動(dòng)子-1636 bp～+15 bp的區(qū)域可能為NFATc2基因的轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域。有研究表明骨髓來源的樹突狀細(xì)胞暴露于高劑量LPS可上調(diào)NFATc2的表達(dá)以及核移位，增加細(xì)胞凋亡從而阻止實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎進(jìn)展。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在293F細(xì)胞轉(zhuǎn)染了NFATc2報(bào)告基因24 h后再給予不同濃度的LPS刺激24 h均能增加NFATc2報(bào)告基因的活性，在LPS 5μg/mL的濃度下NFATc2報(bào)告基因的活性最高，當(dāng)LPS濃度提高到10或20μg/mL，NFATc2報(bào)告基因的活性有所下降，說明LPS對(duì)NFATc2轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)的最適劑量是5μg/mL。二甲雙胍是2型糖尿病患者使用最廣泛的降糖藥物，目前國(guó)內(nèi)外還沒有研究闡明二甲雙胍對(duì)NFATc2的調(diào)控作用，我們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對(duì)NFATc2報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性具有雙向調(diào)控作用，2.5 mmol/L的二甲雙胍顯著抑制NFATc2報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性，而5 mmol/L和10 mmol/L的二甲雙胍明顯增加NFATc2報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性，本研究首次證實(shí)二甲雙胍可從基因轉(zhuǎn)錄層面調(diào)控NFATc2的表達(dá)。

RUNX2是成骨細(xì)胞分化必不可少的最上游轉(zhuǎn)錄因子，序列分析揭示NFATC2基因啟動(dòng)子上存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的潛在結(jié)合位點(diǎn)，成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中過表達(dá)RUNX2 顯著增加NFATc2 基因的轉(zhuǎn)錄活性，提示NFATc2 基因可能是RUNX2的潛在下游調(diào)控基因，但RUNX2與NFATC2基因啟動(dòng)子上哪個(gè)位點(diǎn)結(jié)合并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用尚未證實(shí)。因此，我們將NFATc2基因啟動(dòng)子-1636 bp～+15 bp區(qū)域的一個(gè)潛在RUNX2結(jié)合位點(diǎn)（-1632 bp～-1626 bp）進(jìn)行點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)突變前后NFATc2報(bào)告基因活性并沒有明顯變化，然而突變后再給予LPS或二甲雙胍刺激，NFATc2 報(bào)告基因的活性均顯著受到削弱，由此證實(shí)LPS 和二甲雙胍誘導(dǎo)NFATC2 的轉(zhuǎn)錄激活依賴于RUNX2 在NFATC2 啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)（-1632 bp～-1626 bp），提示NFATC2 基因啟動(dòng)子上-1632 bp～-1626 bp的RUNX2結(jié)合位點(diǎn)很可能是RUNX2的一個(gè)主要調(diào)控位點(diǎn)，這在既往研究中未見報(bào)道。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建人NFATC2基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因，并證實(shí)NFATc2 基因啟動(dòng)子-1636 bp～+15 bp的區(qū)域?yàn)镹FATc2基因的轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域。我們首次證實(shí)LPS和二甲雙胍對(duì)NFATc2的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，LPS和二甲雙胍對(duì)NFATc2的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)依賴于轉(zhuǎn)錄因子RUNX2，且依賴于NFATC2基因啟動(dòng)子上-1632 bp～-1626 bp的RUNX2結(jié)合位點(diǎn)。后續(xù)我們將在此報(bào)告基因質(zhì)粒的基礎(chǔ)之上圍繞NFATC2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，深入探討LPS和二甲雙胍在相關(guān)的人類疾病模型中的具體作用及其分子機(jī)制。