甘珀酸增強(qiáng)RSL3對(duì)耐順鉑睪丸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用

睪丸癌是20～34歲男性最常見的實(shí)體腫瘤，且近幾十年來(lái)全球發(fā)病率穩(wěn)步上升。順鉑是臨床上廣泛使用治療睪丸癌的一線化療藥物，雖然睪丸癌患者對(duì)以順鉑為基礎(chǔ)的治療效果好，但仍有一小部分年輕男性由于內(nèi)在的或獲得性耐藥表現(xiàn)出對(duì)傳統(tǒng)的治療方式無(wú)效，最終死于進(jìn)展性疾病。因此，尋找新的藥物或靶點(diǎn)提升睪丸癌患者治愈率具有重要研究意義。

鐵死亡是一類以鐵依賴的、脂質(zhì)過(guò)氧化物積累為特征的死亡形式。RAS選擇性致死化合物3（RSL3）是常用的鐵死亡誘導(dǎo)劑之一，其作用機(jī)制是通過(guò)抑制谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）造成細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化物堆積而導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生。研究表明，鐵死亡誘導(dǎo)劑在多種癌癥類型的模型中顯示出很好的抗腫瘤活性，包括非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤細(xì)胞。急性白血病MOLM13耐藥細(xì)胞株較非耐藥細(xì)胞株對(duì)RSL3 的抑制作用更加敏感，更容易被誘導(dǎo)發(fā)生鐵死亡。鐵死亡誘導(dǎo)劑對(duì)腫瘤細(xì)胞鐵死亡的誘導(dǎo)，為腫瘤治療提供了新的思路。然而，鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3對(duì)耐順鉑睪丸癌的作用尚不明確。

甘珀酸（CBX）是一種半合成藥物，源自天然三萜化合物甘草次酸，能夠誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)抑制，并且甘珀酸可以提高神經(jīng)母細(xì)胞瘤對(duì)依托泊苷和阿霉素的敏感性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，甘珀酸可以影響睪丸癌敏感株I-10對(duì)順鉑的敏感性。然而甘珀酸是否可以影響睪丸癌耐藥株I-10/DDP對(duì)RSL3的敏感性尚未有相關(guān)研究。為此，本文旨在研究RSL3是否可以誘導(dǎo)耐藥睪丸癌細(xì)胞（I-10/DDP）發(fā)生鐵死亡以及是否影響耐順鉑睪丸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，并探討甘珀酸對(duì)RSL3抗耐藥睪丸癌活性的影響及其作用機(jī)制，為鐵死亡誘導(dǎo)劑在睪丸癌治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng)

耐順鉑睪丸癌細(xì)胞株（I-10/DDP）采用濃度遞增法誘導(dǎo)耐藥，后續(xù)通過(guò)檢測(cè)耐藥指數(shù)（RI=耐藥細(xì)胞系IC/親本細(xì)胞系IC）＞3確定其耐藥性。細(xì)胞在含5%CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

RPMI 1640 培養(yǎng)基（Biosharp）；順鉑（DDP）（Gibco）；胎牛血清（杭州四季青）；RSL3、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、甘珀酸（Sigma-Aldrich）；GSH 試劑盒（南京建成）；GPX4 抗體（Abcam）；C11 BODIPY 581/591 熒光探針（賽默飛）；FerroOrange熒光探針（DOjindo）；GAPDH（Proteintech）；胰酶、細(xì)胞裂解液（上海碧云天）；其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析級(jí)。

1.3 細(xì)胞活力測(cè)定-MTT

在Transwell 上室內(nèi)加入50μL 基質(zhì)膠，置于37 ℃恒溫箱中孵育30 min，待膠凝固。收集I-10/DDP細(xì)胞，用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整為含藥的細(xì)胞懸液（2×10/mL），藥物分組為：Control組、甘珀酸（100 μmol/L）組、RSL3（2 μmol/L）組、甘珀酸合用RSL3 組；分別取100μL加入上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液600μL。每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；培養(yǎng)48 h后取出Transwell 小室；用4%多聚甲醛室溫固定30 min，結(jié)晶紫室溫染色30 min。采用光學(xué)倒置顯微鏡（×200）下計(jì)數(shù)侵襲至微孔膜下層的細(xì)胞，每個(gè)樣本觀察5個(gè)視野。

1.4 集落克隆實(shí)驗(yàn)

無(wú)需在Transwell上室內(nèi)鋪基質(zhì)膠，其余步驟同1.6。

使用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組之間均數(shù)比較采用兩樣檢驗(yàn)，兩組以上均數(shù)比較采用單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)圖采用Graphpad Prism 5.0 繪制，＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞以2×10/孔鋪種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合時(shí)，用200 μL 槍頭沿孔板中央劃一條直線，用PBS 清洗去除漂浮細(xì)胞，每孔加入2 mL 含藥無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，藥物分組為：Control 組、甘珀酸（100 μmol/L）組、RSL3（2 μmol/L）組、甘珀酸合用RSL3組；分別在培養(yǎng)0 h、24 h用顯微鏡拍照。劃痕愈合率=（0～24 h的劃痕寬度/0 h的劃痕寬度）×100%。

例如，于干燥、低溫或者風(fēng)沙較大的環(huán)境下，沒牛羊患疥癬類寄生蟲病的可能性會(huì)大幅度提升，這時(shí)由于此類氣候環(huán)境有利于疥癬病原體的生長(zhǎng)和傳播，牛羊在感染此類寄生蟲以后，會(huì)出現(xiàn)全身奇癢、皮膚變厚且逐漸粗糙化、機(jī)體消瘦及脫毛情況嚴(yán)重等癥狀。同時(shí)，此類寄生蟲會(huì)長(zhǎng)時(shí)間的存在于牛羊的體外表層，吸取牛羊機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)，致使患病機(jī)體日益虛弱化，最終因免疫力極具降低而死亡。想要提升牛羊寄生蟲病的預(yù)防及控制質(zhì)量，我們需要注重對(duì)影響各種牛羊寄生蟲的生長(zhǎng)及繁殖條件的因素及其與寄主間存在的關(guān)系加以充分的了解和分析，同時(shí)，也需要對(duì)寄生蟲的生長(zhǎng)及傳播條件等進(jìn)行有效掌握和科學(xué)控制。

1.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（I-10/DDP），以5×10cells/mL密度接種于96孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至約60%后，更換含藥培養(yǎng)液；對(duì)于甘珀酸與RSL3的聯(lián)合實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為單用RSL3組和甘珀酸合用組，RSL3濃度分別為0、1、2、4、8、16、32 μmol/L，甘珀酸濃度為100 μmol/L；對(duì)于鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（Fer-1）聯(lián)合RSL3以及甘珀酸合用RSL3實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為：Control組、Fer-1（2 μmol/L）組、RSL3（4 μmol/L）組、RSL3+Fer-1組、甘珀酸（100 μmol/L）合用RSL3組、甘珀酸+RSL3+Fer-1組繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，添加5 mg/mL MTT溶液（10μl/孔），在37 ℃的黑暗條件下孵育4 h。棄去培養(yǎng)液后每孔加入100 μL DMSO置于37 ℃烘箱中孵育30 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)值。樣品檢測(cè)全程避光操作。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

劉培峰:在提倡傳統(tǒng)工藝振興時(shí),實(shí)用性是一個(gè)根本性的問(wèn)題。民藝學(xué)家張道一指出,實(shí)用性是“造雞蛋”,然后才有藝術(shù)性,即“畫雞蛋”;日本民藝?yán)碚摷伊趷傄舱J(rèn)為,“為實(shí)用服務(wù),才是工藝之根本”。在當(dāng)前保護(hù)和振興傳統(tǒng)工藝的過(guò)程中,應(yīng)如何認(rèn)識(shí)實(shí)用性?

1.7 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞以1500個(gè)/孔接種于六孔板，待細(xì)胞緊貼壁以后，用含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)9 d，藥物分組為：Control組、甘珀酸（100 μmol/L）、RSL3（2 μmol/L）組、甘珀酸合用RSL3組；顯微鏡下觀察集落數(shù)大于50，棄培養(yǎng)液，用PBS清洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min后，再用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，并拍照。

黃岑苷為黃岑莖葉黃酮的主要藥理成分，具有消炎、調(diào)節(jié)免疫功能的作用［9-10］，其對(duì)感染CVB3病毒的Hela細(xì)胞具有保護(hù)作用［11］。黃岑可通過(guò)抑制免疫細(xì)胞活性，降低機(jī)體內(nèi)炎癥因子水平，進(jìn)而緩解患者炎癥反應(yīng)發(fā)展［12］。本研究結(jié)果顯示通過(guò)給予黃岑莖葉黃酮干預(yù)后，小鼠心功能得到緩解，心肌細(xì)胞炎性浸潤(rùn)以及間質(zhì)纖維化比例均降低，說(shuō)明黃岑莖葉黃酮能夠一定程度上緩解VM小鼠心功能以及炎癥反應(yīng)，且高劑量作用效果與利巴韋林效果相似，提示黃岑莖葉黃酮可能為治療VM的新型藥物。

1.8 FerroOrange熒光探針—檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以1×10/mL的密度接種于12孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞密度為60%左右，藥物處理24 h，藥物分組為：Control 組、RSL3（2 μmol/L）組、甘珀酸（100 μmol/L）合用RSL3組；將舊培養(yǎng)液倒掉，用不含血清的培養(yǎng)液清洗細(xì)胞2次，再加入用無(wú)血清培養(yǎng)液配制的1 μmol/L的FerroOrange熒光探針工作液，避光的條件下在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min。將12孔板轉(zhuǎn)移到活細(xì)胞工作站下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度，并每組隨機(jī)選擇視野進(jìn)行拍照。

1.9 Lipid ROS檢測(cè)

將細(xì)胞以2×10/mL的密度接種于六孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%左右，藥物處理24 h后，藥物分組為：Control組、RSL3（2 μmol/L）組、甘珀酸（100 μmol/L）合用RSL3組；加入濃度為5 μmol/L的C11 BODIPY 581/591熒光探針避光染色。在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min后，用無(wú)EDTA的胰酶消化細(xì)胞并收集至10 mL離心管中，1200 r/min離心8 min，再用PBS離心清洗2次。在細(xì)胞沉淀中加入300 μL PBS讓細(xì)胞重懸，轉(zhuǎn)移至流式管中在激發(fā)光為488 nm檢測(cè)氧化態(tài)細(xì)胞數(shù)量，收集數(shù)據(jù)并保存文件，使用Flowjo進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)甘珀酸濃度為100 μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)影響，RSL3呈濃度依賴性降低細(xì)胞存活率，且在RSL3濃度2、4、8 μmol/L 時(shí)，甘珀酸（100 μmol/L）合用RSL3組的細(xì)胞存活率明顯低于單用RSL3組（＜0.05 圖1A）。根據(jù)MTT結(jié)果，為了保證進(jìn)行侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞存活率90%以上，實(shí)驗(yàn)中選用低濃度RSL3（2 μmol/L），后續(xù)實(shí)驗(yàn)包括集落以及鐵死亡相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)也是選用RSL3（2 μmol/L）。在甘珀酸（100 μmol/L）、RSL3（2 μmol/L）或甘珀酸合用RSL3處理后，集落克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)單用RSL3 組集落形成數(shù)明顯低于Control組；與單用RSL3組相比，甘珀酸合用RSL3組集落形成數(shù)顯著進(jìn)一步下降（圖1B）。

1.10 Western blot檢測(cè)

I-10/DDP 細(xì)胞在甘珀酸（100 μmol/L）、RSL3（2 μmol/L）或甘珀酸合用RSL3 處理后，劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，RSL3組劃痕愈合率減小、穿膜細(xì)胞數(shù)減少（=0.012，圖2A；＜0.001，圖2B）；與單用RSL3組相比，甘珀酸合用RSL3組劃痕愈合率進(jìn)一步減小、穿膜細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步減少（=0.005，圖2A；=0.001，圖2B）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與Control 組相比，RSL3 組穿膜細(xì)胞數(shù)減少（＜0.001，圖2C）；與單用RSL3組相比，甘珀酸合用RSL3組穿膜細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步減少（=0.002，圖2C）。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

另外，在特殊技能一欄后面，喬布斯做了專門的解釋：“來(lái)自惠普附近的海灣地區(qū)。”惠普，全球著名的電子信息科技公司。喬布斯這是在告訴看簡(jiǎn)歷的人：他每天和惠普的員工生活在一起，他隨意交談的某個(gè)人可能就是惠普的某位重要工程師，他的周圍充滿的是電子科技信息，耳濡目染，他熟悉這個(gè)行業(yè)，他在這方面一定有獨(dú)特的洞察力，因此值得錄用?！袄锏聦W(xué)院”和“來(lái)自惠普附近的海灣地區(qū)”，似乎都是簡(jiǎn)短而普通的信息，但被喬布斯這樣寫在簡(jiǎn)歷里，就成了他獨(dú)一無(wú)二的優(yōu)勢(shì)和資源。善于挖掘自己的優(yōu)勢(shì)資源，哪怕只是一個(gè)住址，這應(yīng)該是喬布斯這份簡(jiǎn)歷最大的亮點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 甘珀酸增強(qiáng)RSL3抑制I-10/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的作用

不僅如此，科萊恩十分重視可持續(xù)發(fā)展。公司將所有的產(chǎn)品按照可持續(xù)發(fā)展的績(jī)效性、社會(huì)性、環(huán)境性進(jìn)行一個(gè)篩選。經(jīng)過(guò)篩查，公司將不符合可持續(xù)發(fā)展理念的產(chǎn)品進(jìn)行有計(jì)劃的創(chuàng)新，或者尋求替代解決方案，使其獲得可持續(xù)性，而把無(wú)法獲得可持續(xù)性的產(chǎn)品進(jìn)行淘汰。

2.2 甘珀酸增強(qiáng)RSL3抑制I-10/DDP細(xì)胞侵襲、遷移能力的作用

收集細(xì)胞，加適量增強(qiáng)型RIPA，冰上裂解1 h后，離心收集蛋白并定量。配制12%SDS-PAGE凝膠。將定量樣品上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗（GPX4）4 ℃孵育過(guò)夜，二抗（GAPDH）于室溫孵育2 h，TPBS洗膜；ECT發(fā)光試劑盒暗室發(fā)光，顯影；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Bio Imaging system（Gene Genius）掃描灰度值定量分析。

2.3 甘珀酸促進(jìn)RSL3誘導(dǎo)I-10/DDP細(xì)胞的鐵死亡

本實(shí)驗(yàn)選用較高濃度RSL3（4 μmol/L），MTT法觀察發(fā)現(xiàn)鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（Fer-1）可以逆轉(zhuǎn)RSL3（4 μmol/L）、甘珀酸（100 μmol/L）合用RSL3對(duì)I-10/DDP 細(xì)胞的增殖抑制作用（=0.001,＜0.001，圖3A）。I-10/DDP細(xì)胞經(jīng)單用RSL3（2 μmol/L）、甘珀酸（100 μmol/L）合用RSL3處理24 h后，Western blot檢測(cè)出，與Control組相比，單用RSL3組GPX4的表達(dá)水平下降，而與單用RSL3 組相比，甘珀酸合用RSL3 組GPX4的表達(dá)水平明顯下降（=0.001,=0.01，圖3B）；C11 BODIPY 581/591熒光探針處理細(xì)胞后，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比于Control組，單用RSL3組細(xì)胞中l(wèi)ipid ROS的表達(dá)水平增加，而與單用RSL3組相比，甘珀酸合用RSL3 組細(xì)胞中l(wèi)ipid ROS 水平明顯增加（=0.001,=0.001，圖3C）；FerroOrange熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Fe水平，橙色熒光越強(qiáng)代表Fe水平越高，相比于Control 組，單用RSL3 組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，而與單用RSL3組相比，甘珀酸聯(lián)合RSL3處理后細(xì)胞釋放出更強(qiáng)的熒光（圖3D）。

綜上所述，在現(xiàn)當(dāng)代教育模式的大背景下，小學(xué)語(yǔ)文教師要認(rèn)清教學(xué)的困境，輔之以相應(yīng)的解決辦法，提高學(xué)生的語(yǔ)文學(xué)習(xí)能力，為他們未來(lái)的學(xué)習(xí)發(fā)展打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

3 討論

睪丸癌是男性最常見的惡性腫瘤之一，20世紀(jì)70年代在臨床治療中引入了順鉑，使睪丸癌患者的生存率得到了提高，但目前仍然存在限制順鉑治療的兩個(gè)主要因素為藥物引起的包括腎毒性、耳毒性和肝毒性在內(nèi)的不良反應(yīng)，以及腫瘤耐藥性的發(fā)生。因此，探索新的治療方案對(duì)睪丸癌患者至關(guān)重要。

鐵死亡是新近發(fā)現(xiàn)的一種程序性死亡形式，與凋亡、壞死、自噬等死亡程序不同，典型的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞容積皺縮、線粒體嵴減少等。最近的研究表明，激活鐵死亡能有效地阻止腫瘤的進(jìn)展，并能提高靶向治療和化療的療效。然而，睪丸癌與鐵死亡的關(guān)系尚不明了。深入研究鐵死亡與睪丸癌之間的作用關(guān)系可能為治療睪丸癌提供一種全新的思路。RSL3是鐵死亡最常用的誘導(dǎo)劑之一，目前研究表明其可以在多種腫瘤中誘導(dǎo)鐵死亡并抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，包括腎癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等。RSL3是否可以誘導(dǎo)耐藥睪丸癌I-10/DDP細(xì)胞發(fā)生鐵死亡以及是否可以抑制I-10/DDP細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力尚未有研究報(bào)道。我們采用RSL3處理I-10/DDP后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖能力、侵襲和遷移能力顯著降低，這表明RSL3可以抑制睪丸癌耐藥株I-10/DDP細(xì)胞活力。同時(shí)，為了驗(yàn)證RSL3致I-10/DDP細(xì)胞死亡的模式為鐵死亡，我們將鐵死亡抑制劑Fer-1與RSL3聯(lián)用，觀察RSL3對(duì)細(xì)胞的抑制作用是否能被逆轉(zhuǎn)。Fer-1是一種鐵死亡強(qiáng)效抑制劑，可以通過(guò)抑制脂質(zhì)活性氧的生成而抑制鐵死亡的發(fā)生。結(jié)果顯示Fer-1能逆轉(zhuǎn)RSL3降低細(xì)胞存活率的作用，證明RSL3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡模式為鐵死亡。鐵死亡的發(fā)生與Fe水平以及脂質(zhì)活性氧的生成密不可分。細(xì)胞內(nèi)游離的Fe在芬頓反應(yīng)中與過(guò)氧化氫結(jié)合產(chǎn)生過(guò)多的羥基自由基和ROS，從而導(dǎo)致多不飽和脂肪酸被氧化，產(chǎn)生過(guò)多的脂質(zhì)過(guò)氧化物從而導(dǎo)致鐵死亡。GPX4是鐵死亡的主要調(diào)節(jié)因子之一，其利用谷胱甘肽將有毒的脂質(zhì)過(guò)氧化物轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的脂質(zhì)醇，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物積累從而負(fù)性調(diào)控鐵死亡。本實(shí)驗(yàn)在鐵死亡指標(biāo)中，與Control組相比，RSL3可使I-10/DDP細(xì)胞內(nèi)GPX4表達(dá)下降、Lipid ROS和Fe水平升高，以上結(jié)果更進(jìn)一步說(shuō)明RSL3可以誘導(dǎo)I-10/DDP發(fā)生鐵死亡。上述結(jié)果提示鐵死亡誘導(dǎo)劑在睪丸癌患者的臨床治療上具有一定前景。

甘珀酸是一種鹽皮質(zhì)激素激動(dòng)劑，它已被臨床批準(zhǔn)用于治療食管潰瘍。除了抗炎作用外，甘珀酸也存在抗腫瘤作用。甘珀酸通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡抑制蛋白BIRC5/survivin，從而在K562 白血病細(xì)胞中引發(fā)細(xì)胞凋亡，并且可以增強(qiáng)TRAIL 誘導(dǎo)的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。甘珀酸還可以提高神經(jīng)母細(xì)胞瘤對(duì)依托泊苷和阿霉素的敏感性。而甘珀酸是否參與鐵死亡進(jìn)程以及是否也可以增加I-10/DDP細(xì)胞對(duì)RSL3敏感性尚未有研究。我們采用甘珀酸聯(lián)合RSL3共同處理I-10/DDP細(xì)胞，結(jié)果顯示，甘珀酸合用RSL3組與單用RSL3組相比，I-10/DDP細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力明顯進(jìn)一步下降，這表明甘珀酸可以增強(qiáng)RSL3的抗腫瘤活性。為了進(jìn)一步探究甘珀酸是否是通過(guò)促進(jìn)RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡從而增敏RSL3，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Fer-1 能逆轉(zhuǎn)甘珀酸合用RSL3降低細(xì)胞存活率的作用；同時(shí)檢測(cè)鐵死亡相關(guān)指標(biāo)，甘珀酸合用RSL3組與單用RSL3組相比，I-10/DDP細(xì)胞內(nèi)GPX4蛋白表達(dá)水平降低、lipid ROS 水平升高、Fe水平升高，得出甘珀酸促進(jìn)RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡。

綜上所述，RSL3能夠誘導(dǎo)耐藥睪丸癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，并可以抑制耐順鉑睪丸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力；甘珀酸通過(guò)促進(jìn)RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡從而增強(qiáng)RSL3的抑制作用。單用RSL3或者合用甘珀酸可能是一種有前景的治療睪丸癌策略。甘珀酸是否通過(guò)抑制Pannexins通道增加RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡水平，課題組后期將對(duì)此具體機(jī)制進(jìn)行深入研究，從而為睪丸癌的臨床治療提供理論依據(jù)。