CD36基因缺失通過上調PTP1B基因表達降低小鼠肌肉胰島素敏感性

脂肪酸轉位酶（FAT/CD36）是一種促進長鏈脂肪酸（LCFAs）攝取和氧化的跨膜糖蛋白，廣泛表達于脂肪細胞、巨噬細胞、肌肉細胞、內皮細胞和肝細胞。該蛋白是一種多功能的B類清道夫受體，作為脂質穩(wěn)態(tài)和免疫反應的重要調節(jié)因子，在脂質代謝、胰島素反應和炎癥中發(fā)揮重要作用，并參與代謝性疾病的發(fā)病機制，如肥胖、2型糖尿病、動脈粥樣硬化、非酒精性脂肪性肝病。代謝綜合征也被稱為“胰島素抵抗綜合征”，胰島素抵抗是代謝綜合征的核心組成部分，是代謝性疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理生理因素。

使網絡中的f×n個協同成員節(jié)點失效，f∈[0,1]為協同成員節(jié)點的失效比例，同時記錄CPIKN結構與效能穩(wěn)定性指標的變化情況。

CD36異常高表達可促進代謝綜合征和胰島素抵抗的發(fā)生。目前CD36基因缺失對胰島素抵抗的影響尚存爭議，這極大的限制了以CD36作為代謝綜合征干預靶點的藥物研發(fā)。有研究表明，缺乏CD36基因可以保護小鼠免受高脂飲食引起的肥胖、高血糖和胰島素抵抗。相反的是，遺傳性CD36基因缺陷患者在亞洲和非洲人群中較為常見，CD36基因缺陷患者全身葡萄糖攝取降低，同時患者還表現出高脂血癥、代謝綜合征癥狀和胰島素抵抗。大型的隊列研究也顯示CD36基因表達降低與胰島素抵抗和2 型糖尿病風險增加有關。CD36基因缺失改善或者加重胰島素抵抗受什么因素的影響仍然是未知的。我們課題組前期研究發(fā)現，在高脂飲食狀態(tài)下，CD36基因缺失可改善高脂誘導的脂代謝紊亂和胰島素抵抗，而在正常飲食狀態(tài)下，CD36基因缺失反而會削弱生理的胰島素敏感性。這表明CD36對胰島素抵抗的調控受到營養(yǎng)狀態(tài)的影響，部分解釋了CD36在胰島素抵抗中扮演矛盾作用的潛在原因。

肌肉是機體主要的胰島素敏感組織，對調控葡萄糖代謝穩(wěn)態(tài)至關重要，密切參與胰島素抵抗的發(fā)生機制。在高脂飲食狀態(tài)下，我們已經發(fā)現CD36基因缺失可以增強小鼠肌肉組織的胰島素敏感性，促進葡萄糖的利用。然而，在正常飲食狀態(tài)下，CD36基因缺失對小鼠肌肉胰島素敏感性的影響卻沒有相關報道。在本研究中，我們主要探討正常飲食狀態(tài)下，CD36基因缺失調控小鼠肌肉胰島素信號通路的作用機制。我們發(fā)現，CD36基因缺失會導致正常飲食喂養(yǎng)下小鼠的肌肉組織胰島素信號通路傳導受損。肌肉組織中蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）表達在CD36基因缺失小鼠中異常升高，而PTP1B是胰島素信號傳導的負調控因子。本研究首次揭示了在正常飲食狀態(tài)下，小鼠CD36基因缺失通過促進肌肉組織中PTP1B的表達從而導致胰島素敏感性受損的分子機制。我們的研究部分解釋了CD36基因缺陷患者葡萄糖攝取降低和易發(fā)胰島素抵抗的原因。這一發(fā)現提示可將PTP1B作為預防和治療CD36基因缺陷人群胰島素抵抗的新靶點。

有關資料顯示，我國公眾急救知識普及率不超過1%，其中，大學生接受急救培訓的大多數為醫(yī)學類的學生。歐美、日韓等國家大力推行應急救護培訓，其中，美國公眾基本急救技術普及率達89.95%，新加坡衛(wèi)生救護知識培訓普及率達20%。我國開展公眾急救知識培訓起步較晚，存在著實施及資金雙重困難。在我國人口基數大、幅員遼闊的國情下，在不同區(qū)域和不同居民群體中進行急救知識的普及，也存在著許多不同的特性，我國居民急救能力的培養(yǎng)仍然面臨著較大的挑戰(zhàn)。

1 材料和方法

1.1 動物

野生型（wild type,WT）小鼠為C57BL/6J小鼠，購自重慶醫(yī)科大學動物中心，許可證號為SYXK(渝)2012-0001。全身性CD36 敲除（CD36）小鼠由美國Maria Febbraio教授惠贈（Lerner Research Institute,U.S.）。所有的動物實驗均符合實驗動物倫理委員會規(guī)定的標準（2014056）。

1.2 主要試劑

飼料（D12450B）；TRIzol RNA提取試劑、逆轉錄試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix（TaKaRa）；細胞總蛋白提取試劑（凱基公司）；BCA蛋白含量檢測試劑盒（北京鼎國公司）；AKT、p-AKT、IRβ、IRS1、IRS2、PI3K抗體購自CST；PTP1B 抗體（Proteintech Group）；抗βactin抗體（北京博奧森公司）；免疫共沉淀（Co-IP）試劑（LSKMAGG02）、PVDF膜（Millipore）；免疫熒光二抗（中杉金橋公司）；ECL化學發(fā)光試劑（Bio-Rad）；引物由擎科引物公司合成；血糖檢測儀（羅氏）；葡萄糖檢測試劑盒（北京普利萊基因技術公司）；胰島素（諾和諾德）；胰島素試劑盒（北京鼎國公司）；claramine（Sigma-Aldrich）。

1.3 動物選擇與分組

正常飲食喂養(yǎng)結束后，所有小鼠禁食過夜，每組各選6只腹腔注射1 units/kg的胰島素，10 min后收集骨骼肌，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ每偟鞍滋崛≡噭┖刑崛〖∪饪偟鞍?，BCA試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，PVDF膜轉膜，37 ℃條件下3%BSA封閉1.5 h，4 ℃條件下孵育一抗(抗AKT、p-AKT、IR、IRS1、IRS2、PTP1B和β-actin抗體)過夜，TBST洗3次，每次15min，HRP 標記的二抗室溫孵育1 h，TBST 清洗3 次，每次15 min，利用化學發(fā)光劑ECL 顯影，條帶的強度用ImageJ軟件（灰度×面積）進行定量分析。

1.4 葡萄糖耐量實驗（GTT）和胰島素耐量實驗（ITT）

檢測該過程是根據制造商的說明用Magna ChIP G試劑盒（Millipore）進行的。PTP1B啟動子特異性引物（表1）。

1.5 Western blot檢測蛋白表達

根據基因型將小鼠分為WT組和CD36組，每組12只，正常飲食喂養(yǎng)14周。

1.6 免疫熒光染色

我國《律師法》修訂多次，始終保留著“公務員不得兼任執(zhí)業(yè)律師”的規(guī)定?，F行的公職律師制度與《律師法》規(guī)定存在沖突，公職律師缺少合法的身份依據。建議應當盡快修改《律師法》，盡早實現“形成社會律師、公職律師、公司律師、軍隊律師并存發(fā)展、相互配合，優(yōu)勢互補的格局”，把公職律師納入我國律師制度的整體框架中，為其提供合法的身份依據，在法律上確認其角色定位，明確相關權利義務。

1.7 RT-PCR檢測mRNA表達

Western blot 檢測正常飲食喂養(yǎng)條件下WT 和CD36小鼠肌肉中胰島素刺激的蛋白激酶B（AKT）磷酸化水平，結果顯示P-AKT/AKT蛋白表達比值顯著降低（＜0.01，圖2A、B）。CD36小鼠肌肉中葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）表達降低，肌肉組織的葡萄糖利用能力減弱（圖2C）。胰島素信號傳導通路中AKT 上游的mRNA和蛋白表達情況顯示CD36小鼠肌肉中胰島素受體（IR）和胰島素受體底物1/2（IRS1/2）的mRNA水平沒有降低（圖2D），并且兩組小鼠肌肉中IR、IRS1、IRS2和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的蛋白水平均沒有顯著差異（＞0.05，圖2E、F）。

1.8 免疫共沉淀

將等量的小鼠肌肉蛋白裂解物與抗體在4 ℃條件下孵育過夜，然后添加G蛋白磁珠（LSKMAGG02）孵育2 h，冷裂解緩沖液洗滌3次后，將結合的蛋白質在SDS樣品緩沖液中煮沸5 min以洗脫，SDS-PAGE電泳分離上清液蛋白，并用抗IR和IRS1酪氨酸磷酸化的抗體免疫印跡。

1.9 染色質免疫共沉淀（ChIP）

正常飲食喂養(yǎng)14周時，所有小鼠禁食12 h，取尾靜脈血，用血糖檢測儀測定此時血糖濃度，計為0 min的血糖濃度。然后腹腔注射1 g/kg的D-葡萄糖，分別在30、60、90、120 min后測定所有小鼠的血糖濃度，即為GTT實驗。ITT實驗則將小鼠禁食4 h，腹腔注射1 units/kg的胰島素，同樣取尾靜脈血，用血糖儀測定0、30、60、90、120 min的血糖濃度。

1.10 統(tǒng)計學處理

本研究實驗數據均采用軟件SPSS25.0進行統(tǒng)計學分析，數據均以均數±標準差，采用-test對兩樣本進行比較，以＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

斑潛蠅主要危害西葫蘆葉片，在葉片內幼蟲蛀食造成彎曲的隧道，破壞葉綠素和葉肉細胞，嚴重時葉片枯死甚至成片植株死亡。

2 結果

2.1 CD36基因缺失引起小鼠胰島素敏感性受損

免疫共沉淀（Co-IP）檢測小鼠肌肉組織中胰島素反應蛋白質的酪氨酸磷酸化水平。結果顯示，與WT小鼠相比，CD36小鼠肌肉中總蛋白的酪氨酸磷酸化水平明顯降低（＜0.05，圖3A、D）。CD36小鼠肌肉中IR的酪氨酸磷酸化水平顯著降低（＜0.01，圖3B、E），同時發(fā)現IRS1的酪氨酸磷酸化水平也降低（＜0.05，圖3C、F）。

云南省曲靖市麒麟區(qū)某水庫位于南盤江右岸一級支流白石江上，控制流域面積18.3km2，水庫總庫容401萬m3，興利庫容357萬m3，是一座以灌溉、防洪為主，兼有城市供水等綜合效益的小（1）型水庫。工程等別為Ⅳ等，主要水工建筑物級別為4級，次要建筑物級別為5級。除險加固防洪設計標準為：擋泄水建筑物按30年一遇洪水設計，300年一遇洪水校核。正常水位1941.23m，死水位1921.73m，設計洪水位1 941.77 m，校核洪水位1 942.57 m，汛限水位1 939.23 m。

按照免疫熒光試劑盒說明書，小鼠肌肉組織切片用山羊血清封閉15 min，抗GLUT4 抗體4 ℃條件下孵育過夜（放在濕盒中），室溫下避光加入山羊抗兔IgG-FITC孵育30 min，DAPI染液作用10 min，PBS沖洗，黑暗條件下防熒光淬滅劑封片，共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

2.2 小鼠CD36基因缺失降低肌肉組織胰島素敏感性

TRIzol試劑提取肌肉總RNA，并檢測其含量和純度，用逆轉錄試劑盒在37 ℃5 min、85 ℃5 s、4 ℃5 min條件下1 μg總RNA逆轉錄成cDNA，并保存于-20 ℃。取2 μL cDNA進行RT-PCR，β-actin作為內參，反應總體積為25 μL，設置擴增條件為：94 ℃預變性1 min；94 ℃變性10 s、54 ℃退火10 s、72 ℃延伸10 s，共39個循環(huán)。記錄每個標本和內參的Ct值，根據2計算目的基因的表達水平。

2.3 小鼠CD36 基因缺失抑制肌肉IR/IRS1 酪氨酸磷酸化

正常飲食喂養(yǎng)14 周后，注射1 U/kg 的胰島素或1 g/kg的葡萄糖，檢測所有小鼠0、30、60、90、120 min的血糖水平，并分析胰島素敏感性的差異或糖耐量差異。與WT小鼠相比，CD36小鼠對胰島素的敏感性明顯減弱（圖1A），胰島素耐量曲線下面積顯著升高（＜0.05，圖1B）。CD36小鼠糖耐量明顯升高(圖1C)，糖耐量曲線下面積顯著降低（＜0.01，圖1D）。CD36小鼠血清胰島素濃度升高（＜0.01，圖1E），胰島素抵抗指數（HOMA-IR）也升高（＜0.05，圖1F）。

2.4 CD36基因缺失通過促進肌肉中PTP1B的表達降低小鼠的胰島素敏感性

CD36小鼠肌肉中PTP1B mRNA 水平明顯升高（＜0.01，圖4A），并且PTP1B的蛋白表達水平也顯著高于WT 小鼠（＜0.05，圖4D、E）。與WT 小鼠相比，CD36小鼠肌肉中乙酰組蛋白3（H3）與PTP1B啟動子的結合水平增加（＜0.01，圖4B、C）。而claramine 對PTP1B的藥理抑制有效地消除了CD36小鼠的胰島素敏感性受損（圖4F、G）。

3 討論

多項研究發(fā)現CD36和胰島素抵抗的病因有關，但其潛在的機制仍然不清楚。有文獻報道在肥胖相關的2型糖尿病患者中CD36過表達減弱胰島素信號傳導，產生胰島素抵抗。因此通常認為CD36缺乏可以改善高脂肪飲食誘導的肥胖和胰島素抵抗。但近期有研究顯示，人類CD36基因缺陷患者表現為胰島素抵抗和高脂血癥，并出現代謝綜合征癥狀。自發(fā)性高血壓大鼠缺乏CD36表現為胰島素抵抗和高游離脂肪酸（FFA）水平的代謝表型，轉基因過表達CD36可改善這一表型。我們推測CD36在胰島素抵抗中矛盾的作用可能是由營養(yǎng)狀態(tài)不同所導致的。課題組前期研究發(fā)現在高脂飲食狀態(tài)下，CD36基因缺失可以增強小鼠肌肉的胰島素敏感性。而本研究結果表明，在正常飲食狀態(tài)下，CD36基因缺失導致小鼠肌肉胰島素敏感性受損，提示CD36基因缺失對肌肉胰島素敏感性的影響依賴于營養(yǎng)狀態(tài)的調控。因此將CD36作為治療臨床多種代謝性疾病的靶點時必須要考慮不同營養(yǎng)狀況對療效的影響。

手機是抵御聒噪的神器，根據聒噪的級別調節(jié)不同的節(jié)目。比如對方的語音語調和風細雨，不影響我刷屏看文字，就首選微信微博；如果對方語音高亢語調激昂，逼你入腦入心，分心的方式就只能是看淘寶；如果對方的言辭激烈，好像你欠他2000元錢似的，這就是在逼我出手了，只好在購物車里劃拉，對自己好一點吧，該買的就買，否則咋辦？人家已經對咱這么不客氣，咱自己總得對自己客氣些吧？

經典的胰島素信號包括IR、IRS1、IRS2、PI3K 和AKT等，它們在胰島素在許多類型的細胞和組織的代謝活動中發(fā)揮著重要作用。IR屬于酪氨酸激酶家族，由α亞基和β亞基組成，胰島素發(fā)揮生物學作用首先與細胞膜上的IRα結合，使IRβ自身磷酸化，隨后通過IRS1、IRS2、PI3K和AKT等信號通路發(fā)揮一系列生物學效應。其中AKT的磷酸化激活是反應胰島素敏感性的金指標。本研究發(fā)現在正常飲食條件下，CD36小鼠肌肉中p-AKT/AKT的蛋白比值和GLUT4的表達顯著降低，提示CD36基因缺失降低肌肉組織的胰島素敏感性，且葡萄糖利用能力減弱。接著檢測胰島素信號通路中AKT 上游的mRNA 和蛋白表達情況，發(fā)現CD36小鼠肌肉中IR、IRS1、IRS2和PI3K的mRNA和蛋白水平均沒有顯著差異，提示CD36小鼠不是通過降低肌肉中IR/IRS1/IRS2/PI3K信號通路的蛋白表達水平導致胰島素敏感性受損。胰島素信號通路是由IR引發(fā)的蛋白質酪氨酸磷酸化級聯激活的，因此我們分析了小鼠肌肉中胰島素反應蛋白質的酪氨酸磷酸化水平。結果顯示，CD36小鼠肌肉中胰島素刺激的IR和IRS1的酪氨酸磷酸化水平明顯降低，表明CD36基因缺失可以通過降低肌肉中IR/IRS1的酪氨酸磷酸化水平抑制胰島素信號通路傳導。而胰島素信號通路的缺陷是胰島素抵抗的主要原因。以上結果提示在正常飲食條件下，CD36基因缺失可以通過抑制IR/IRS1的酪氨酸磷酸化信號傳導導致肌肉組織胰島素敏感性受損。

胰島素在發(fā)揮作用過程中最重要的是與胰島素受體結合，使胰島素受體磷酸化從而激活下游信號通路，而PTP1B能夠使磷酸化的胰島素受體去磷酸化，從而阻斷下游信號通路的激活。因此，PTP1B作為胰島素信號傳導的重要負調控因子，在胰島素抵抗中發(fā)揮著重要作用。目前PTP1B已成為治療2型糖尿病的新靶點。研究發(fā)現，小鼠體內PTP1B是全身胰島素敏感性的主要調節(jié)因子。PTP1B小鼠在肝臟和肌肉兩大主要代謝靶組織中表現出增強的IR和IRS1酪氨酸磷酸化。我們首次揭示了CD36在調節(jié)小鼠肌肉組織中PTP1B表達的作用。本研究發(fā)現在正常飲食條件下，CD36小鼠肌肉中PTP1B表達增加，且PTP1B基因啟動子的組蛋白乙?；揭诧@著升高。本課題組前期研究顯示CD36 可以通過ROS 影響肝細胞組蛋白去乙?；窰DAC表達水平，進而調控靶基因啟動子組蛋白乙?；?，提示CD36可以影響基因的表觀修飾，CD36小鼠肌肉PTP1B 啟動子乙?；缴呖赡芘cROS/HDAC途徑相關，但具體的分子機制還有待進一步解析。此外PTP1B抑制劑阻斷了CD36基因缺失對小鼠胰島素敏感性受損的影響。以上結果表明，PTP1B在CD36小鼠肌肉的胰島素信號傳導中發(fā)揮了重要作用，提示CD36基因缺失可以通過促進PTP1B的表達從而抑制胰島素信號傳導引起肌肉組織的胰島素敏感性受損。

綜上所述，在正常飲食狀況下，CD36基因缺失通過削弱IR/IRS1通路的酪氨酸磷酸化導致肌肉組織的胰島素敏感性受損，其機制可能與PTP1B基因的表達上調有關。該研究表明CD36基因對于維持肌肉生理的胰島素信號通路傳導至關重要，CD36基因以非脂質依賴的分子機制調控生理胰島素信號通路。我們的研究結果為闡明臨床上CD36基因缺陷患者葡萄糖攝取降低和易發(fā)胰島素抵抗這一現象提供了理論依據。