唐氏綜合征胎盤差異miRNA表達譜分析：基于全轉錄組測序分析技術

唐氏綜合征（DS）是最常見的染色體非整倍體，發(fā)病率約為1∶700活產(chǎn)。該綜合征包括80多種影響所有主要器官的臨床表現(xiàn)，以及不同程度的認知功能障礙和顱面異常，這是唐氏綜合征患者最常見的臨床特征。同時，唐氏綜合征常伴發(fā)生先天性心臟缺陷、胃腸道異常、兒童白血病或早發(fā)性阿爾茨海默病等。唐氏綜合征的表型可能是基因失衡所引起，由于21號染色體基因劑量增加了50%且存在與其他基因相互不平衡的作用。目前，唐氏綜合征在臨床缺乏治療的有效手段，主要通過產(chǎn)前篩查和診斷的方式減少唐氏患兒的出生。

目前常用于唐氏兒的篩查方法是一種聯(lián)合檢測，包括從母體血液中提取的幾種生化標記物和胎兒超聲標記物，但檢出率僅60%～70%。無創(chuàng)胎兒DNA檢查對于唐氏綜合征檢出率較高，但檢查費用高，技術操作復雜，檢查周期長，不易在基層醫(yī)療機構推廣。篩查的陽性結果需要通過侵入性產(chǎn)前診斷檢測絨毛膜絨毛取樣（CVS）或羊膜穿刺術來確認。然而，這兩種手術對操作者的臨床經(jīng)驗要求高，且仍有1%導致流產(chǎn)的機率。因此，建立一種安全、價格合理又特異性的唐氏綜合征產(chǎn)前篩查手段仍是產(chǎn)前診斷領域探索的方向。

miRNA是真核生物中常見的一類由內源基因編碼的長度約為20～25個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，參與轉錄后基因表達的調控。繼妊娠者血漿中胎兒游離DNA被發(fā)現(xiàn)后，有文獻報道母體外周血中還存在胎兒游離RNA。胎盤是胎兒特有的組織，篩出胎盤特異表達miRNA會產(chǎn)生新的胎兒特異性標志物，對其檢測也更具針對性，可以提高檢測的特異性和靈敏性，但目前最具特異性的miRNA分子尚有待探討。

本研究重點比較了正常胎盤和唐氏綜合征胎盤中miRNA的表達；通過使用陣列技術對82個miRNA全轉錄組進行了分析；使用生物信息學工具分析選定的miRNA的靶基因，以繪制潛在的受影響的功能通路。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取同期昆明市婦幼保健院產(chǎn)科產(chǎn)前診斷確診唐氏綜合征孕婦（=3，年齡分別為28，35，47歲）及正常對照孕婦胎盤（=3，年齡分別為29，30，31歲）。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核（審批號：2021-5-7），孕婦均被提供遺傳咨詢并簽署知情同意書。

1.2 唐氏綜合征產(chǎn)前診斷的細胞遺傳學和高通量測序分析

使用標準程序對胎兒羊水樣本進行染色體分析。超聲引導下羊膜腔穿刺術，抽羊水20 mL，離心后棄上清，加入培養(yǎng)基，原位法進行羊水細胞培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)7～9 d。用GTG顯帶法對中期染色體進行染色，每個病例檢查30個分裂像，分析5個分裂像。采用德國QIAGEN公司DNeasy Blood and Tissue Kit（69506）試劑盒提取羊水細胞DNA。采用染色體CNV 檢測試劑盒（KR0040）進行DNA 文庫構建。在Illumina Next-Seq500測序平臺對DNA文庫進行測序。

1.3 標本處理

采用SPSS 23.0進行統(tǒng)計學分析，多組間比較使用Chi-square（N×N）檢驗分析，兩組間比較使用-test分析。對差異表達基因的篩查以|log2(Foldchange)|＞1且＜0.05為閾值。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 轉錄組測序及數(shù)據(jù)分析

采用高通量測序技術。選取唐氏綜合征胎盤和正常胎盤組織各3例，對子面、母面、絨毛層組織進行混樣，充分研磨后TRIzol法提取總RNA。miRNA測序文庫制備采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits（Illumina）試劑盒。文庫制備工作完成后，對構建好的文庫使用Illumina Hiseq2000/2500進行測序。實驗流程按照說明書的標準步驟執(zhí)行。對比分析唐氏綜合征胎盤與正常胎盤組織中的差異表達miRNA，以差異倍數(shù)≥1.5且＜0.05及檢測豐度較高作為顯著上調和顯著下調的標準。通過miRBase（https://www.mirbase.org/）查詢目標miRNA的序列信息及所在染色體。對差異表達miRNA的潛在靶基因進行GO和KEGG-Pathway功能富集分析。

通過使用miRWalk、Targetscan、miRDB軟件工具對上調miRNA的靶基因進行預測并通過Venny軟件分析，發(fā)現(xiàn)上調miRNA的共同靶基因為BTBD3、AUTS2、ALS2等。目前關于BTBD3的功能在很大程度上是未知的，F(xiàn)agerberg等報道BTBD3基因特異性在胎盤組織和腦組織中存在高表達（圖3E）。另有研究發(fā)現(xiàn)，在新生兒發(fā)育過程中，BTBD3可以將樹突導向活動的軸突終末，并調節(jié)初級感覺皮層中活動依賴的樹突修剪，從而促進神經(jīng)回路的形成。在人類和嚙齒類動物中，BTBD3在皮層-紋狀體-丘腦-皮層回路中高表達，包括中背丘腦、前扣帶皮層和海馬體。在這個回路中，BTBD3的表達在出生后早期迅速增加，在人類和小鼠中，在兒童和青少年時期達到高峰。多篇報道顯示BTBD3與神經(jīng)細胞發(fā)育有關。另一靶基因AUST2（自閉癥易感性候選基因2）已成為一個與廣泛的神經(jīng)心理疾病相關的關鍵基因，如自閉癥譜系障礙、智力障礙、精神分裂癥和癲癇。AUTS2位于染色體7q11.22上，該區(qū)域與染色體斷點的易感性相關。它共跨越1.2 Mb，包括19個外顯子，其中外顯子1-6位于5'末端，被大內含子分開，外顯子7-13緊湊排列在基因的3'末端。最初在2002年被報道為一對同卵雙胞胎因染色體新發(fā)平衡易位使AUTS2 基因功能被中斷而導致自閉癥。AUTS2已被證明參與多種神經(jīng)發(fā)育過程：在細胞核中，它作為神經(jīng)發(fā)育的關鍵轉錄調控因子，而在細胞質中，它通過控制細胞骨架重排參與大腦皮質發(fā)生，包括神經(jīng)元遷移和神經(jīng)發(fā)生。在產(chǎn)后，AUTS2調節(jié)興奮性突觸的數(shù)量，以維持神經(jīng)回路中興奮和抑制之間的平衡。在本次唐氏綜合征胎盤組織轉錄組基因測序中顯示AUST2、BTBD3 和ALS2 轉錄組中表達下調。在AUST2與BTBD3均參與神經(jīng)細胞的發(fā)育，鑒于唐氏綜合征患兒均存在智力障礙的問題，其是否與BTBD3、AUST2基因表達下調相關是我們下一步將繼續(xù)研究的方向。

1.5 統(tǒng)計學分析

胎盤娩出后2 h內完成組織采樣。以臍帶附著點為中心，在對稱的四個方位（ABCD），子面、母面、絨毛層分別取1 cm樣本，放入含RNA-later 試劑的EP 管中4 ℃過夜，后置于液氮中速凍，之后置于-80 ℃冰箱保存。

2 結果

2.1 唐氏綜合征產(chǎn)前診斷結果分析

已有研究顯示，通過檢測母體外周血中胎兒游離RNA，可將唐氏綜合征診斷的敏感度和特異性分別提高至90.0%和96.5%。胎兒來源的游離RNA在母體外周血中以亞細胞小體形式存在，不易被RNA酶降解，且在妊娠期母體血液中含量豐富，有望成為無創(chuàng)途徑獲得胎兒遺傳物質的另一個候選標記物。近年來孕婦血液特異的miRNA檢測有望成為一種新型的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測手段逐漸受到重視。Karaca等對懷有唐氏綜合征胎兒的孕婦的羊水miRNA進行研究發(fā)現(xiàn)21號染色體相關性miRNA-125b-2，miRNA-155 和miRNA-3156 在懷有唐氏綜合征胎兒的孕婦羊水中明顯高于正常妊娠或未妊娠女性。我們的檢測結果（表1）中顯示miR-125b-2-3p在唐氏綜合征胎盤中的表達量高于正常胎盤，與報道一致。

她笑后又接著說：“你們男人啊，是不是一看見好看的女人，就像老貓子嗅到腥一樣，就是不要了老命，也恨不得一口把她含在嘴里才過得？”

2.2 全轉錄組測序及質量分析

通過對所有差異表達miRNA 的靶基因GO 和Pathway分析發(fā)現(xiàn)，GO富集分析結果表明，生物過程模塊多數(shù)為參與RNA代謝過程及轉錄調控，其余與感覺器官發(fā)育、眼睛發(fā)育等相關，RNA轉錄過程的調控推測與唐氏綜合征患兒各類代謝產(chǎn)物異常表達有關。參與的細胞組分方面，多數(shù)富集在細胞膜及細胞質相關組分，其余在整個細胞器、細胞核均有涉及。分子功能近年成為在腫瘤、代謝病及遺傳病的研究重點，在本文中，唐氏綜合征的分子功能富集主要顯示在蛋白質結合和金屬離子結合方面，且在各類酶活性中均有富集。研究報道在唐氏綜合征中神經(jīng)生長因子的代謝途徑發(fā)生了改變：通過水解酶、金屬蛋白酶等降低神經(jīng)生長因子的數(shù)量。其余富集到轉錄調控過程等。

2.3 唐氏綜合征胎盤中miRNA差異表達情況

通過對所有差異表達miRNA 的靶基因GO 和Pathway分析發(fā)現(xiàn)，GO富集分析結果表明，差異表達miRNA的靶基因主要參與的分子功能包括蛋白結合、金屬離子結合、轉移酶活性、核苷酸結合、DNA結合、水解酶活性、ATP結合、RNA結合、DNA依賴性RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄調控、同種蛋白質結合；參與的細胞組分包括質膜部分、胞質部分、細胞核部分、膜的整體成分、胞質部分、核腔、核質部分、突觸、細胞連接、細胞器、細胞器腔、膜封閉腔、質膜部分、核仁、突觸部分、細胞內非膜細胞器、非膜細胞器、核外圍、核基質；參與的生物過程包括轉錄調控、RNA 代謝過程調控、DNA 依賴性RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄調控、眼睛發(fā)育、感覺器官發(fā)育、轉錄負調控、依賴DNA、磷酸化、磷代謝過程、磷酸鹽代謝過程、mRNA代謝過程。KEGG富集分析結果表明差異表達miRNA靶基因主要參與的信號通路包括腫瘤相關信號通路、PI3K-Akt信號通路、Ras信號通路、Rap1信號通路、細胞骨架調控信號通路、嘌呤代謝相關信號通路、P53相關信號通路（圖4）。

2.4 差異表達miRNA的靶基因功能富集分析結果

實驗篩選出82個差異表達的miRNA。與正常胎盤組織相比，唐氏綜合征胎盤組織中有29個miRNA表達上調（變化倍數(shù)≥2，＜0.05），15個miRNA表達下調（變化倍數(shù)≥2，＜0.05）；根據(jù)表達豐度（表達豐度300以上）共篩選出4個表達上調的miRNA，6個表達下調的miRNA。差異表達的miRNA分布在不同的染色體上，其中包括一個21號染色體衍生的miRNA（表1）。差異表達miRNA的火山圖、整體層次聚類圖顯示這些miRNA在兩組中表達有顯著差異（圖3A～C）。通過miRWalk、Targetscan、miRDB軟件預測靶基因后進行分析，miRNA-323a-3p、miRNA-199b-5p 和miRNA-125b-2-3p 共同靶基因為ALS2（鳥嘌呤核苷酸交換因子）。miRNA-323a-3p 和miRNA-199b-5p 共同靶基因為BTBD3、AUTS2等（圖3D）。對95個人的組織樣本進行RNA-seq測序，靶基因BTBD3在27個不同組織中的表達情況（圖3E，數(shù)據(jù)來自Bioproject：PRJEB4337。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/22903/）。

3 討論

唐氏綜合征的發(fā)生與母親的懷孕年齡有關，高齡孕婦唐氏綜合征患兒的發(fā)病率更高，卵子老化也與唐氏綜合征的發(fā)生有著不可分離的關系。據(jù)報道，30歲以下的孕婦孕育唐氏綜合征胎兒風險為1/1000，35歲以上孕婦風險率1/270，40歲以上孕婦風險率為1/100，45歲以上孕婦風險率為1/20。95%左右的唐氏綜合征患者父母均為正常且家族中也沒有唐氏綜合征，其發(fā)生是受精卵早期細胞分裂錯誤或生殖細胞（精子或卵子）分裂錯誤導致的。僅有5%以下的唐氏綜合征的發(fā)生與父母染色體結構異常（如易位）有關。所以理論上講，不管是否有家族史，所有懷孕的人都應該進行唐氏篩查，提高孕婦及家屬對于唐氏綜合征系列產(chǎn)前篩查的重視程度，使更多孕婦主動接受唐氏綜合征系列產(chǎn)前篩查，進行唐氏綜合征患兒的早期診斷，具有非常重要的現(xiàn)實意義。

唐氏綜合征病例產(chǎn)前診斷羊水細胞染色體核型和高通量測序結果一致，均為21三體（圖1）。

截止至2018年5月31日，“體育舞蹈圈”公眾號粉絲已達到238 805人，并覆蓋全國包括臺灣在內的34個省、市、自治區(qū)、直轄市，目前粉絲數(shù)量仍處于健康增長狀態(tài)。此外，根據(jù)線上問卷調查結果顯示，如表1，“體育舞蹈圈”微信公眾號粉絲群體大致可分為體育舞蹈初學者、等級考試參與者、體育舞蹈在職教師三類群體，且三者需求均以學習體育舞蹈教材及配套等級組合視頻為主。

測序結果經(jīng)base calling軟件CASAVA分析后Q值（堿基質量值）顯示由于測序一起造成的某個位置堿基錯誤率小于1%，測序質量可靠。在樣本間重復性分析中使用Pearson相關性分析、PCA分析（主成分分析）來判斷，顯示數(shù)據(jù)可信度良好（圖2）。

平順縣隸屬于山西省東南部的長治市，位于太行山西側，黃土高原東部邊緣，處于我國由華北平原向第二階梯過度的前沿，平均海拔高于1000m的地區(qū)占全縣總面積的70%以上（圖1）。全縣地勢南高北低、自東南向西北傾斜。境內河流則有濁漳河，東部的虹霓河、南部宑底河系集東南部山地雨水形成，流域面積均較小[10]。縣境內地貌以山地為主，平原僅在濁漳河兩岸有少量分布[11]。

在本次分析結果中，KEGG富集分析結果表明差異表達miRNA靶基因主要參與的信號通路有腫瘤相關信號通路、PI3K-Akt信號通路等。PI3K-Akt信號通路作為腦組織受體，推測其在唐氏綜合征患兒腦發(fā)育過程起到重要作用。近年來，關于唐氏綜合征生物標記物及發(fā)病的分子機制已有一定研究，但尚缺乏更多臨床試驗驗證，本次的檢測可能為唐氏綜合征發(fā)病的分子機制提供了新論據(jù)。

工業(yè)革命之前，技術進步非常緩慢，一個人一生幾乎感受不到技術的進步，沿著同樣的技術路徑勞動和生活，可謂天經(jīng)地義。工業(yè)革命以后，尤其是20世紀下半葉以來，一個人可以感受到技術的明顯進步。1980年代以來，每十年甚至每年都可以感受到技術的明顯進步。

本研究所納入的臨床試驗普遍質量較低，缺乏高質量、標準化的RCT。由于各研究間針刺所選穴位不同、服用的西藥和中成藥不同，且各研究間所納入患者的病情嚴重程度不一等因素的影響，造成分析過程中各研究間存在較大異質性。在治療前后NIH-CPSI評分變化量與白細胞降低有效率作為結局指標的分析中，由于納入的相關分析較少，得出的結果可能可靠性不強。故在今后要多進行相關的臨床研究，尤其是與中藥湯劑、中藥坐浴和微波治療等方面的對比研究，且要進行高質量、標準化的RCT；盡量多注重治療后隨訪的結果，為針刺治療CP遠期療效提供可靠證據(jù)。

綜上所述，可能提示miRNA的過度表達屬于影響胎盤形成模式及對胎兒發(fā)育的所有后果的重要因素。唐氏胎兒在早期發(fā)育時胎盤組織中miRNA表達出現(xiàn)上調，進而抑制胎兒神經(jīng)發(fā)育相關靶基因的表達。我們下一步進行血清學驗證miRNA表達情況，可用于彌補血清學篩查在唐氏綜合征篩查的特異性不足的問題，提高孕早期唐氏綜合征篩查的準確性。