生物有機(jī)肥對(duì)鹽堿地水稻葉片的影響轉(zhuǎn)錄組分析

劉 鵬,畢江濤,李文兵,惠治兵,肖國(guó)舉,孫 權(quán),王 靜

1 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 銀川 750021

2 寧夏大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院, 銀川 750021

鹽漬土又稱鹽堿土是鹽土和堿土以及不同程度鹽化和堿化土壤的統(tǒng)稱[1],嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的發(fā)展[2—3]。鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生滲透脅迫和離子毒害作用,間接影響植物的光合作用、能量代謝、膜透性和生長(zhǎng)發(fā)育[4]。水稻是我國(guó)四大主糧之一,種植水稻是生物改良鹽堿地的一種有效途徑[5],但在鹽堿脅迫下水稻整個(gè)生育周期性狀都會(huì)受到影響,葉片逐漸變短、變小,顏色隨之變淺[6],植株生物量和分蘗能力下降,產(chǎn)量降低[7—8]。隨著人口不斷增加,耕地面積逐漸減少,開(kāi)發(fā)利用鹽堿地對(duì)增加耕地資源,改善生態(tài)環(huán)境具有重要意義[9—10]。

鹽堿地修復(fù)改良方法主要為水利工程、化學(xué)、生物等措施[11],生物修復(fù)包括植物和微生物修復(fù),具有投入低、修復(fù)效果好、生態(tài)效益高等優(yōu)點(diǎn)[12—13]。生物有機(jī)肥在鹽堿地修復(fù)改良中發(fā)揮著重要的作用,既能作為傳統(tǒng)有機(jī)肥增加土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分、改善物理結(jié)構(gòu)[14—16],又能外源輸入有益微生物,調(diào)節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu),抑制病蟲(chóng)害[17—18],改善作物水分狀況、膜完整性和光合作用[19],還可以減輕作物鹽堿脅迫、提高作物產(chǎn)量及品質(zhì)[20—22],減輕化肥過(guò)量使用造成的環(huán)境污染[23]。

高通量RNA-Seq技術(shù)作為揭示植物響應(yīng)鹽脅迫分子機(jī)制的重要手段,已取得了多項(xiàng)重要成果。張麗麗和張富春研究發(fā)現(xiàn)[24],鹽生植物鹽穗木(Halostachyscaspica)能夠通過(guò)促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)和活性氧清除,提高短期鹽脅迫適應(yīng)能力；董明等[25]研究結(jié)果表明,高粱在鹽脅迫下光合作用受到抑制,激素信號(hào)和類黃酮的合成在響應(yīng)鹽脅迫中發(fā)揮著重要作用；在水稻響應(yīng)鹽脅迫中,翻譯調(diào)控[26]、脫落酸和油菜素甾醇等植物激素信號(hào)[27—29]、酚類和類黃酮物質(zhì)合成[30]、Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級(jí)聯(lián)、轉(zhuǎn)錄因子(TFs)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(TRs)、蛋白激酶(PKs)和其他關(guān)鍵功能蛋白起著重要作用[31]。

施用生物有機(jī)肥能有效修復(fù)改良鹽堿地、改善水稻農(nóng)藝性狀[32],但在基因表達(dá)水平上知之甚少。本研究采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),對(duì)生物有機(jī)肥不同處理下水稻葉片差異基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析,功能和代謝通路注釋,為探究生物有機(jī)肥對(duì)鹽堿地水稻生長(zhǎng)影響的生物學(xué)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

本試驗(yàn)地位于寧夏回族自治區(qū)銀川市賀蘭縣金貴鎮(zhèn)銀光村(106.43°E,38.49°N),屬于溫帶大陸性季風(fēng)氣候,全年日照時(shí)數(shù)2851—3106 h,有效積溫1534.9℃,年降水量200 mm左右,時(shí)空分布不均,多集中在6—9月。試驗(yàn)地土壤為淤灌土,pH 8.40、全鹽1.83 g/kg、有機(jī)質(zhì)9.9 g/kg、全氮1.18 g/kg、全磷0.59 g/kg、解堿氮42 mg/kg、有效磷3.38 mg/kg、速效鉀320 mg/kg,屬于輕度鹽堿土。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組排列,小區(qū)面積20 m2(5 m×4 m),小區(qū)之間起壟覆膜,單獨(dú)排灌。水稻育苗插秧種植,品種為寧粳48號(hào)。供試生物有機(jī)肥配方及(嗜)耐鹽菌種均由課題組提供,寧夏某生態(tài)肥業(yè)有限公司生產(chǎn),配料中加入硅元素制成鹽堿地水稻專用生物有機(jī)肥[N+P2O5+K2O>5%,有機(jī)質(zhì)>45.0%,有效活菌數(shù)(枯草芽孢桿菌、多黏類芽孢桿菌、鹽單胞菌、乳酸菌、光合細(xì)菌等)>500億/kg]；供試化肥為市售磷酸二銨(含P2O546%,N 18%)。試驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)處理,T1:生物有機(jī)肥+化肥,T2:生物有機(jī)肥滅活+化肥,T3:化肥,T4:空白對(duì)照(不施肥)。生物有機(jī)肥作為基肥,施用量為1500 kg/hm2；化肥施用量為當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶施肥習(xí)慣的1/2,施用量為213.75 kg/hm2,按照基肥、分蘗肥、穗肥5∶3∶2的量施用,水肥管理與大田一致。

1.3 水稻農(nóng)藝性狀測(cè)定

水稻灌漿期測(cè)定健康植株葉綠素含量、葉面積指數(shù)、株高、根長(zhǎng)、有效分蘗數(shù),干物質(zhì)量。葉綠素含量用SPAD- 502便攜式葉綠素儀測(cè)定；葉長(zhǎng)、株高、根長(zhǎng)用鋼卷尺測(cè)量；葉寬用游標(biāo)卡尺測(cè)量；用長(zhǎng)寬矯正法來(lái)測(cè)定葉面積(葉面積指數(shù)=葉片長(zhǎng)×寬×0.75)[33]；干物質(zhì)量采用烘干法測(cè)定,每個(gè)處理取15個(gè)重復(fù)。

1.4 樣品采集

取水稻灌漿后期葉片,用無(wú)菌水洗去灰塵后裝入2 mL凍存管中,隨即放入液氮中速凍,干冰送樣,委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成RNA的提取、質(zhì)控、建庫(kù)及Illumina HiSeqTM測(cè)序,每個(gè)處理取3次重復(fù)。

1.5 文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

提取樣品RNA,總量≥1 μg,通過(guò)Oligo(dT)磁珠富集水稻葉片中帶有poly A尾的mRNA,隨后在NEB Fragmentation Buffer中用二價(jià)陽(yáng)離子將得到的mRNA隨機(jī)打斷。以片段化的mRNA為模版,隨機(jī)寡核苷酸為引物,在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA第一條鏈,然后用R NaseH降解RNA鏈,并在DNA polymerase I體系下,以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過(guò)末端修復(fù),加A尾并連接測(cè)序接頭,用AMPure XP beads篩選250—300 bp左右的cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增并再次使用AMPure XP beads 純化PCR產(chǎn)物,最終獲得文庫(kù),然后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

利用clusterProfiler 3.4.4軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析,P<0.05作為顯著性富集的閾值；利用SPSS軟件對(duì)葉綠素相對(duì)含量、有效分蘗數(shù)、根長(zhǎng)、葉面積和和干物質(zhì)重量進(jìn)行方差分析、多重比較,株高進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生物有機(jī)肥處理對(duì)水稻生長(zhǎng)的影響

由表1可知,施用生物有機(jī)肥+化肥后,水稻葉片中葉綠素含量、有效分蘗數(shù)、根長(zhǎng)、葉面積和干物質(zhì)重量均顯著高于化肥和空白對(duì)照(P<0.05),株高也大于其他處理,說(shuō)明施用生物有機(jī)肥能有效促進(jìn)鹽堿地水稻生長(zhǎng)。

表1 水稻灌漿期農(nóng)藝性狀

2.2 測(cè)序質(zhì)量分析

為了保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量,在分析前對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,去掉帶接頭、含無(wú)法確定堿基信息、低質(zhì)量(Qphred≤20的堿基數(shù)占整個(gè)read長(zhǎng)度的50%以上)的reads,統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2。整體上,每個(gè)樣品最終得到4000—7000萬(wàn)條Clean reads,Q20為96.86%—98.33%,Q30為91.87%—95.09%,GC含量為50.04%—55.22%,數(shù)據(jù)整體測(cè)序錯(cuò)誤率為0.03%,小于1%,表明測(cè)序質(zhì)量良好,數(shù)據(jù)可用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.3 不同處理差異表達(dá)基因分析

利用DESeq 2軟件比較生物有機(jī)肥不同處理下水稻葉片的基因,以P<0.05且|log2FoldChange|>0.0作為篩選基準(zhǔn),圖1為差異基因表達(dá)火山圖,T2和T1之間檢測(cè)到差異基因6593條,說(shuō)明生物有機(jī)肥中的微生物在參與調(diào)控水稻葉片基因表達(dá)中發(fā)揮了重要作用；T4和T3之間的1866條差異基因是由施用化肥引起的,T3和T1之間的4796條差異基因是由生物有機(jī)肥引起的,說(shuō)明生物有機(jī)肥對(duì)水稻葉片基因調(diào)控作用大于化肥；T4和T1之間檢測(cè)到差異基因6976條,高于T4vsT3與T3vsT1差異基因數(shù)量之和,說(shuō)明生物有機(jī)肥與化肥對(duì)水稻基因調(diào)控作用具有協(xié)同作用。生物有機(jī)肥對(duì)水稻基因表達(dá)具有重要意義,因此對(duì)其進(jìn)一步進(jìn)行GO功能富集與KEGG富集分析。

圖1 基因火山圖

2.4 差異轉(zhuǎn)錄基因的GO富集分析

將得到的目標(biāo)基因進(jìn)行GO功能富集分析能夠確定差異基因的主要生物學(xué)功能,即生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能三個(gè)主類。T2vsT1結(jié)果注釋差異基因共4780條,其中生物學(xué)過(guò)程1643條,細(xì)胞組成635條,分子功能2502條,分別占比34.37%、13.28%、52.34%,由此可以看出大多數(shù)差異基因與分子功能顯著相關(guān),各組分最顯著的10個(gè)Term見(jiàn)圖2,生物學(xué)過(guò)程方面主要表現(xiàn)在翻譯、肽生物合成和代謝、酰胺生物合成和代謝、有機(jī)氮化合物的生物合成、DNA構(gòu)象變化等方面；在細(xì)胞組分中,主要參與核糖體、細(xì)胞內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合物、核糖核蛋白復(fù)合體、非膜細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)非膜細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)部分、細(xì)胞質(zhì)等方面；在分子功能中,主要集中在核糖體的結(jié)構(gòu)成分和結(jié)構(gòu)分子活性等方面。

圖2 T2vsT1差異基因本體功能富集分析

T3vsT1共注釋到差異基因3829條,生物學(xué)過(guò)程1335條,細(xì)胞組成506條,分子功能1988條,分別占比34.87%、13.21%、51.92%,可以看出施用生物有機(jī)肥影響水稻葉片的分子功能,各組分最顯著的10個(gè)Term見(jiàn)圖3,生物學(xué)過(guò)程主要表現(xiàn)在光合作用、翻譯、肽生物合成與代謝、酰胺生物合成與代謝；細(xì)胞組分中,主要參與類囊體、類囊體部分、光系統(tǒng)、膜蛋白復(fù)合物、光合膜、核糖體、光系統(tǒng)II、高爾基體相關(guān)囊泡、高爾基體相關(guān)囊泡膜、細(xì)胞質(zhì)部分、核糖核蛋白復(fù)合體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合物等方面；在分子功能中,主要集中在結(jié)構(gòu)分子活性、核糖體的結(jié)構(gòu)成分、轉(zhuǎn)錄因子活性,序列特異性DNA結(jié)合、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等方面。

圖3 T3vsT1差異基因本體功能富集分析

T4vsT1共注釋到差異基因5252條,生物學(xué)過(guò)程1840條,細(xì)胞組成731條,分子功能2681條,分別占比35.03%、13.92%、51.05%,說(shuō)明生物有機(jī)肥與化肥聯(lián)合作用能有效促進(jìn)葉片基因差異表達(dá),各組分最顯著的10個(gè)Term見(jiàn)圖4,生物學(xué)過(guò)程主要表現(xiàn)在翻譯、肽生物合成與代謝、細(xì)胞酰胺生物合成與代謝、有機(jī)氮化合物的生物合成、光合作用、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等方面；細(xì)胞組分中,主要參與核糖體、核糖核蛋白復(fù)合體、細(xì)胞內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)部分、細(xì)胞質(zhì)、非膜細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)非膜細(xì)胞器等方面；在分子功能中,主要集中在結(jié)構(gòu)分子活性、核糖體的結(jié)構(gòu)成分、RNA結(jié)合、翻譯因子活性,RNA結(jié)合、rRNA結(jié)合等方面。

圖4 T4vsT1差異基因本體功能富集分析

T4vsT3共注釋到差異基因1396條,生物過(guò)程523條,細(xì)胞組成131條,分子功能742條,分別占比37.46%、9.38%、53.15%,差異顯著的基因集中在細(xì)胞組分和分子功能,可以看出施用化肥主要對(duì)水稻葉片的生物學(xué)過(guò)程影響較小,各組分最顯著的10個(gè)Term見(jiàn)圖5。在細(xì)胞組分中,差異基因主要參與的生物學(xué)過(guò)程包括類囊體、類囊體部分、光合膜等方面；在分子功能中,差異基因主要集中在血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、氧化還原酶活性作用于成對(duì)的供體上并結(jié)合或還原分子氧、鐵離子結(jié)合等方面。

圖5 T4vsT3差異基因本體功能富集分析

2.5 差異基因KEGG通路富集分析

為了進(jìn)一步表達(dá)差異基因的生物學(xué)行為,根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果,對(duì)生物有機(jī)肥不同處理下,鹽堿地水稻葉片差異基因進(jìn)行分析。

T2vsT1共有965條差異基因注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中,分布在112個(gè)分類代謝途徑中,最顯著的20個(gè)通路見(jiàn)圖6,涉及差異基因最多的代謝通路是核糖體(142條),其次是植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(55條)、剪接體(47條)、植物-病原體相互作用(45條)、氨基酸生物合成(41條)、碳代謝(40條)、嘌呤代謝(38條)、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑-植物(35條)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工(34條)、胞吞作用(30條)等,其中有2個(gè)代謝通路顯著富集(P<0.05),分別是核糖體和光合作用(22條)。

圖6 T2vsT1差異基因KEGG富集通路

T3vsT1共有732條差異基因得到注釋,分布在109個(gè)分類代謝途徑中,最顯著的20個(gè)通路見(jiàn)圖7,涉及差異基因最多的代謝通路是核糖體(81條),其次是碳代謝(43條)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(40條)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工(32條)、氨基酸生物合成(31條)、谷胱甘肽代謝(30條)、氨基糖和核苷酸糖代謝(26條)、苯丙烷生物合成(26條)、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑-植物(25條)、半胱氨酸和蛋氨酸代謝(24條)等,其中有4個(gè)代謝通路顯著富集(P<0.05),分別是核糖體、光合作用、光合作用-天線蛋白和谷胱甘肽代謝。

圖7 T3vsT1差異基因KEGG富集通路

T4vsT1共有1076條差異基因得到注釋,分布在109個(gè)分類代謝途徑中,最顯著的20個(gè)通路見(jiàn)圖8,涉及差異基因最多的代謝通路是核糖體(147條)、碳代謝(71條)、氨基酸生物合成(48條)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(46條)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工(45條)、嘌呤代謝(35條)、剪接體(35條)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(34條)、光合作用(32條)、谷胱甘肽代謝(32條)等,有5個(gè)代謝通路顯著富集(P<0.05),分別是核糖體、光合作用、光合作用-天線蛋白、鞘脂代謝、卟啉與葉綠素代謝。

圖8 T4vsT1差異基因KEGG富集通路

T4vsT3共有263條差異基因得到注釋,共100條代謝通路,最顯著的20個(gè)通路見(jiàn)圖9,涉及差異基因最多的代謝通路是苯丙烷生物合成(21條)、碳代謝(21條)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(17條)、氨基酸生物合成(17條)、乙醛酸和二羧酸代謝(13條)、脂肪酸降解(12條)、光合作用(12條)、糖酵解/糖異生(12條)、脂肪酸代謝(11條)、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑-植物(11條)等,有7個(gè)代謝通路顯著富集(P<0.05),是脂肪酸降解、光合作用、苯丙烷生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、不飽和脂肪酸生物合成、α-亞麻酸代謝、脂肪酸代謝。

圖9 T4vsT3差異基因KEGG富集通路

各組差異基因KEGG顯著富集通路統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表3,結(jié)果表明,施用生物有機(jī)肥后,核糖體和光合作用代謝通路顯著富集(P<0.05),與前文GO分析中核糖體和光合作用相互佐證,說(shuō)明鹽堿地施用生物有機(jī)肥誘導(dǎo)水稻葉片中的RNA合成蛋白質(zhì),對(duì)其光合作用具有顯著影響；谷胱甘肽是生物體內(nèi)最主要的非蛋白巰基和含量最豐富的低分子量多肽,具有很強(qiáng)的抗氧化性,參與植物抗逆中的多項(xiàng)功能活動(dòng)[34],在本研究中,T3vsT1和T4vsT1中谷胱甘肽代謝通路基因上調(diào)23和27條,下調(diào)7和5條,說(shuō)明生物有機(jī)肥能夠提高鹽堿地水稻抗逆性。

表3 差異基因 KEGG顯著富集通路

2.6 差異基因耐鹽轉(zhuǎn)錄因子分析

轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞響應(yīng)外界脅迫以后主要調(diào)控某些基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子[35]。目前,已鑒定出參與植物鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子有AP2/EREBP、MYB、WRKY以及bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員[36]。圖10為各組差異基因注釋在轉(zhuǎn)錄因子家族的基因數(shù)量,T2vsT1中4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族共有111條差異基因,其中上調(diào)39條(MYB家族23條),下調(diào)72條(AP2家族23條,MYB家族22條,WRKY家族21條)；T3vsT1共有93條差異基因,上調(diào)44條(AP2家族10條,bZIP家族10條,MYB家族15條),下調(diào)49條(AP2家族20條,MYB家族15條,WRKY家族10條)；T4vsT1共有97條差異基因,上調(diào)53條(AP2家族19條,bZIP家族11條,MYB家族18條),下調(diào)44條(AP2家族13條,MYB家族19條),T4vsT3共有40條差異基因,上調(diào)24條(AP2家族11條),下調(diào)18條(MYB家族13條)。

圖10 響應(yīng)鹽脅迫家族基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)

3 討論

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是功能基因組學(xué)的重要組成部分,它是從整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律[37]。植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)機(jī)制十分復(fù)雜,當(dāng)細(xì)胞感受到逆境脅迫時(shí),相應(yīng)的受體將會(huì)收到信號(hào),控制相關(guān)的基因表達(dá),并產(chǎn)生生理反應(yīng),同時(shí)在轉(zhuǎn)錄和翻譯等水平做出應(yīng)答[38]。本研究中,從水稻農(nóng)藝性狀可以看出,施用生物有機(jī)肥能有效減輕鹽分對(duì)水稻的脅迫,促進(jìn)鹽堿地水稻生長(zhǎng)。對(duì)不同生物有機(jī)肥處理下鹽堿地水稻葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄測(cè)序分析,Q30堿基百分比大于91.87及以上,表明測(cè)序質(zhì)量良好,滿足轉(zhuǎn)錄組分析的基本要求。

施肥不僅可以開(kāi)啟一些基因上調(diào)表達(dá),同時(shí)也可以關(guān)閉一些基因表達(dá)(基因沉默),還可以調(diào)節(jié)一些基因下調(diào)表達(dá)[39]。王鎣燕[40]在NPK定位實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),化肥配施農(nóng)家肥能明顯促進(jìn)16S rRNA和nosZ基因拷貝數(shù)。本研究GO功能分析中,T2vsT1中差異基因引起顯著差異的功能有16個(gè),T3vsT1中有36個(gè),T4vsT1中有60個(gè),說(shuō)明施用生物有機(jī)肥能有效刺激水稻葉片基因差異表達(dá),這些差異基因在生物學(xué)過(guò)程中細(xì)胞學(xué)過(guò)程、代謝過(guò)程相關(guān)基因分布較多；細(xì)胞組分中主要集中在細(xì)胞器、細(xì)胞器膜；在分子功能中差異顯著表達(dá)基因與結(jié)合、催化活性有關(guān)。張敏瑜[41]接種AM真菌和Foc4能誘導(dǎo)巴西蕉的基因差異表達(dá),且2株菌同時(shí)接種時(shí)差異基因顯著表達(dá)量大于單株菌的表達(dá)量。Chandra研究結(jié)果表明[42],耐鹽解淀粉芽孢桿菌能夠調(diào)節(jié)水稻基因差異表達(dá)提高水稻耐鹽性。本研究中,T2vsT1中差異顯著上調(diào)基因均大于下調(diào)數(shù)量,說(shuō)明生物有機(jī)肥中的枯草芽孢桿菌等(嗜)耐鹽菌株對(duì)鹽堿地水稻生物學(xué)過(guò)程具有重要的影響。

核糖體是最古老的、精細(xì)復(fù)雜的細(xì)胞器,其結(jié)構(gòu)和組成從原核到真核保持著高度的保守性[43],是細(xì)胞機(jī)制的一個(gè)重要部分,負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成,在控制細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂和發(fā)育中起著重要作用[44],核糖體相關(guān)基因表達(dá)可能會(huì)影響生物體的一些機(jī)能。謝麗霞[45]從極端嗜鹽曲霉核糖體中克隆出SpRPS3ae和SpRPL44兩條蛋白基因?qū)胫参锖臀⑸镏芯苡行岣咂淇果}性,夏麗丹等[46]在分析鹽膚木對(duì)鉛脅迫的響應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn),核糖體相關(guān)基因是鹽膚木應(yīng)對(duì)鉛脅迫的主要調(diào)節(jié)基因。在本研究中,差異表達(dá)基因的GO與KEGG的分析中均發(fā)現(xiàn),核糖體相關(guān)基因在T2vsT1、T3vsT1、T4vsT1中均差異表達(dá),說(shuō)明核糖體內(nèi)可能是鹽堿地水稻施用生物有機(jī)肥后應(yīng)對(duì)鹽堿環(huán)境的重要調(diào)節(jié)基因。

光合作用是植物產(chǎn)生能量的主要途徑,葉片是植物進(jìn)行光合作用的重要器官,對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要[25]。但鹽堿脅迫會(huì)造成植物細(xì)胞膜損傷、氣孔關(guān)閉、CO2同化速率降低,從而降低光合速率、蒸騰速率、氣孔開(kāi)放、細(xì)胞間CO2濃度和葉綠素含量影響水稻生長(zhǎng)發(fā)育,從而影響作物產(chǎn)量[47—48]。本研究中KEGG代謝途徑的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),T3vsT1和T4vsT1中光合作用和光合作用-天線蛋白代謝通路基因均顯著上調(diào),而光合作用-天線蛋白是光反應(yīng)中原初反應(yīng)中的一類補(bǔ)光蛋白復(fù)合體,能夠捕獲光能并把能量傳遞至反應(yīng)中心[25],說(shuō)明施用生物有機(jī)肥能有效促進(jìn)鹽堿地水稻葉片對(duì)光能的捕獲,從而增強(qiáng)水稻光合作用。

植物激素不但調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育,而且還參與植物的非生物脅迫[25],在T2vsT1、T3vsT1和T4vsT1中分別有55條、40條、34條差異基因注釋在植物激素信號(hào)傳導(dǎo)通路上,涉及的植物激素有生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯、油菜素甾醇、茉莉素和水楊酸,意味著施用生物有機(jī)肥對(duì)植物激素具有一定影響,脫落酸是植物利用類胡蘿卜素參與合成的一種應(yīng)激反應(yīng)激素[49],能激發(fā)質(zhì)膜結(jié)合通道或從細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲(chǔ)存庫(kù)釋放Ca2+與第二信使Ca2+整合,幫助植物在鹽脅迫下存活[50],在植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫中發(fā)揮著重要作用[51]。在本研究中類胡蘿卜素生物合成通路基因在T3vsT1中上調(diào)5條、下調(diào)1條,在T4vsT1中上調(diào)10條,無(wú)下調(diào)基因,說(shuō)明鹽堿地施用生物有機(jī)肥能促進(jìn)類胡蘿卜素生物合成,促進(jìn)水稻抗性提高。

植物經(jīng)常受到病原性細(xì)菌、真菌、病毒、線蟲(chóng)等的攻擊[52],但是植物具有天生的免疫系統(tǒng)來(lái)抵御病原體[53],當(dāng)受到病原體攻擊時(shí),每個(gè)細(xì)胞都能夠自主識(shí)別和應(yīng)對(duì)病原體[54]?？莶菅挎邨U菌能有效防治水稻的紋枯病[55]、稻瘟病[56]等病害,本研究中T3vsT1和T4vsT1中植物-病原體相互作用代謝通路上調(diào)基因數(shù)量大于下調(diào)基因數(shù)量,說(shuō)明施用生物有機(jī)肥在一定程度上能夠激活鹽堿地水稻葉片自身對(duì)病原體的抗性,微生物在其中可能發(fā)揮了重要作用,在T2中對(duì)生物有機(jī)肥進(jìn)行了滅活處理,但在T2vsT1中上調(diào)基因數(shù)量小于下調(diào)基因,其原因需要進(jìn)一步研究。

參與響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫下呈現(xiàn)出不同的應(yīng)答反應(yīng)模式,表明這些轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫應(yīng)答途徑中扮演著不同的角色[36]。AP2/EREBP是一個(gè)大的轉(zhuǎn)錄因子家族,包含EREBP和AP2等2個(gè)亞族。研究證實(shí),AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄家族基因與植物逆境響應(yīng)有關(guān)[57],MYB蛋白在包括鹽脅迫在內(nèi)的植物非生物脅迫調(diào)控中有重要作用[58],WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域,能夠參與損傷、衰老、發(fā)育、抗病等抗逆反應(yīng)[59]。不同生物有機(jī)肥處理誘導(dǎo)鹽脅迫下水稻葉片響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄因子家族基因開(kāi)始表達(dá),其中施生物有機(jī)肥能促使水稻葉片已知響應(yīng)鹽脅迫的家族基因差異表達(dá),主要參與鹽脅迫響應(yīng)的基因都屬于AP2和MYB轉(zhuǎn)錄因子家族,說(shuō)明施用生物有機(jī)肥能有效促進(jìn)植物響應(yīng)鹽脅迫基因表達(dá),增強(qiáng)作物耐受性。

4 結(jié)論

以生物有機(jī)肥不同處理下的鹽堿地水稻葉片為研究材料,運(yùn)用RNA-Seq技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,并對(duì)差異基因進(jìn)行GO和KEGG代謝通路富集分析,解析其參與的生物學(xué)功能和代謝途徑。施用生物有機(jī)肥能夠改變鹽堿地水稻基因表達(dá),從而調(diào)控水稻的生物學(xué)功能和代謝過(guò)程,影響水稻的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究初步揭示了生物有機(jī)肥施用對(duì)鹽堿地水稻促生和抗逆作用的生物學(xué)機(jī)制。