沙棘枝枯病的定量檢測體系構建和應用

陳 悅，孫思雨，胡建忠，郝凱強，于 曼，吳元華，夏 博

（1.沈陽農業(yè)大學，遼寧 沈陽 110866；2.水利部沙棘開發(fā)管理中心，北京 100038）

沙棘Hippophae rhamnoides是一種多年生落葉灌木，廣泛分布于歐亞大陸，我國從東北、華北到西北、西南均是沙棘主栽地區(qū)[1]。我國現(xiàn)有沙棘資源200 余萬hm2，沙棘加工企業(yè)200 余家，年產(chǎn)值約70 億元[2]。沙棘適生性強，可以通過硬枝扦插、嫩枝扦插和嫩芽扦插等途徑進行快速繁育[3]，適宜在我國西部荒漠化地區(qū)大面積栽培，對水土保持、防風固沙具有重要作用，兼具重要的經(jīng)濟價值和生態(tài)價值[4]。

沙棘枝枯病又被稱為干縮病，是世界范圍內嚴重危害沙棘的毀滅性病害之一。20世紀60年代該病在俄羅斯大面積爆發(fā)，目前已在世界沙棘主栽區(qū)廣泛流行[5]。在我國遼寧、甘肅及陜西等沙棘主要種植區(qū)均有沙棘枝枯病危害的報道[6]。最近有研究結果表明，引起黑龍江省沙棘枝枯病的病原菌為擬枝孢鐮刀菌Fusarium sporotrichioides[7]。擬枝孢鐮刀菌是一類具有廣泛寄主的病原真菌，可以侵染馬鈴薯、紫花苜蓿、大豆等多種經(jīng)濟作物[8-10]，能夠在植物病殘體和土壤中越冬越夏，引起玉米、薰衣草等多種植物枯萎病、腐爛病的發(fā)生[11-13]。發(fā)病植株上部葉片提前褪綠并大量脫落，在枝上形成凹陷病斑，隨后病斑連結成片，整個植株的枝條干枯皺縮，嚴重感病的植株出現(xiàn)沙棘果實提早脫落的現(xiàn)象，該病最終導致沙棘林木大面積死亡[14]。

實時熒光定量PCR 技術（quantitative realtime PCR）是基于DNA/RNA 探針技術的植物病原菌鑒定方法，在PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的累積來實時監(jiān)測整個PCR 反應過程，最后再通過已建立的標準曲線對未知模板進行定量分析，與傳統(tǒng)診斷方法相比具有高度特異性[15]，被廣泛應用于基因表達的定量分析[16-17]。傳統(tǒng)PCR 方法的靈敏度低，且采用傳統(tǒng)PCR 方法無法實現(xiàn)對環(huán)境和土壤樣品的高效定量檢測[18]，而實時熒光定量PCR 具有較高的檢測靈敏性，兼顧定性檢測和定量檢測，采用該技術能夠較為準確地確定初始拷貝數(shù)[19-20]，該技術已經(jīng)被廣泛應用于定量檢測土壤和枝條病殘體中微生物含量[21]。實時熒光定量PCR 技術在擬枝孢鐮刀菌檢測方面的應用研究鮮見報道。本研究中針對擬枝孢鐮刀菌建立實時熒光定量PCR 檢測體系，旨在從基因水平為快速定量檢測擬枝孢鐮刀菌提供一種有效方法，對沙棘枝枯病的早期診斷、定量檢測和病害防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株為單孢純化后的G1-5-1 擬枝孢鐮刀菌F.sporotrichioides、 核盤菌Sclerotinia sclerotiorum、 炭疽菌Colletotrichumsp.、 根腫菌Plasmodiophora brassicae、絲核菌Rhizoctoniasp.、尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum、層出鐮刀菌Fusarium proliferatum、木賊鐮刀菌Fusarium equisetum、 三線鐮刀菌Fusarium tricinctum、赤霉菌Gibberellasp.、 擬莖點霉Phomopsis cauliflorum，現(xiàn)存于沈陽農業(yè)大學植物保護學院病毒室。

1.1.2 供試枝條樣本和土壤樣本

2020年5—7月，在甘肅省慶陽市采集17 份枝條樣本、4 份沙棘根際土壤樣本，共21 份樣本，其詳細信息見表1。

表1 供試沙棘枝條和土壤樣品Table 1 Test branch and soil samples

1.2 試劑與儀器

試劑：NaCl、無水乙醇和蔗糖購自國藥公司；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂糖和卡那霉素購自索萊寶公司；膠回收試劑盒（全式金）；DNA secure新型植物基因組DNA 提取試劑盒（Tiangen）；土壤微生物基因組DNA 提取試劑盒（Qiagen）；真菌基因組快速抽提試劑盒（生工，上海）；其他未標注試劑均購自Vazyme 公司。

儀器：紫外凝膠成像儀（Bio-Rad）、PCR 擴增儀StepOnePlus ?（Thermofisher）、Nanodrop紫外分光光度計（Thermofish）。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因組DNA 制備

1）病原菌基因組DNA 的提取。在單孢純化后的菌落上打取直徑為5 mm 的菌餅，將菌餅置于PD 培養(yǎng)液中，封好封口膜，在搖床（25 ℃，110 r/min）上搖培5 d 后，用已滅菌的濾紙過濾培養(yǎng)液，將過濾出的菌絲用無菌水沖洗3 次放于50 mL 離心管中，在凍干機中凍干3 h。參照真菌基因組快速抽提試劑盒說明書提取病原菌基因組DNA。取20 mg 干燥的子實體或菌絲放入研缽中，倒入少量液氮，迅速研磨成粉末，加入到1.5 mL離心管中。加入400 μL Buffer Digestion 和4 μL β-巰基乙醇，振蕩混勻。65 ℃水浴1 h，至細胞完全裂解。加入200 μL Buffer PF，充分顛倒混勻，在冰箱（-20 ℃）中放置5 min。室溫條件下，10 000 r/min 離心5 min，將上清液（500 ～550 μL）轉移到新的1.5 mL 離心管中。加入等體積的異丙醇，顛倒5 ～8 次使之充分混勻，室溫條件下放置2 ～3 min。室溫條件下，10 000 r/min 離心5 min，棄上清液。加入1 mL 75%的乙醇，顛倒漂洗1 ～3 min，10 000 r/min 離心2 min，棄上清，重復1 次該操作步驟。開蓋，室溫條件下倒置5 ～10 min，至殘留的乙醇完全揮發(fā)。得到的DNA 用50～100 μL TE Buffer溶解，并在-20 ℃條件下保存。

2）植物基因組DNA 的提取。參照DNA secure 新型植物基因組DNA 提取試劑盒說明書提取植物基因組DNA。取植物干組織20 mg 放入研缽中，倒入少量液氮，充分碾磨，加入400 μL 緩沖液LP1 和6 μL RNase A（10 g/L），放入離心管中，旋渦振蕩1 min，室溫條件下放置10 min。加入130 μL 緩沖液LP2，充分混勻，旋渦振蕩1 min。12 000 r/min 離心5 min，將上清液移至新的離心管中。加入1.5 倍體積的緩沖液LP3，立即充分振蕩15 s，使之混勻，可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。將所得溶液和絮狀沉淀均加入吸附柱CB3 中，1 200 r/min 離心30 s，棄廢液，將吸附柱CB3 放入收集管中。向吸附柱CB3 中加入600 μL 漂洗液PW，1 200 r/min 離心30 s，棄廢液，將吸附柱CB3 放入收集管中，重復該操作步驟多次。然后1 200 r/min 離心2 min，棄廢液。吸附柱CB3 在室溫條件下放置2 min，徹底晾干殘余的漂洗液。將吸附柱CB3 轉入新的1.5 mL 離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50 ～200 μL 洗脫緩沖液TE，在室溫條件下放置2 min，12 000 r/min 離心2 min，將溶液收集到離心管中。

3）土壤微生物基因組DNA 的提取。參照土壤微生物基因組DNA 提取試劑盒（Qiagen）說明書提取土壤微生物基因組DNA。向Power Bead Tube 中加入0.25 g 土壤樣品，輕輕攪拌。加入60 μL 的C1，渦旋振蕩數(shù)秒。24 位旋渦適配器水平固定，高速渦旋10 min，12 000 r/min 離心30 s。將上清液移到2 mL 收集管中，加入250 μL C2 渦旋5 s，在2 ～8 ℃條件下靜置5 min。12 000 r/min離心1 min，將600 μL 上清液移到2 mL 收集管中。加入200 μL C3 并渦旋5 min，在2 ～8 ℃條件下靜置5 min。12 000 r/min 離心30 s，將750 μL 上清液移到2 mL 收集管中。搖勻C4，加入1 200 μL上清液，渦旋5 s。取該溶液675 μL 加入MB 旋轉柱離心管中，12 000 r/min 離心30 s，棄掉流出液，重復該操作步驟多次，處理所有樣品。添加500 μL 的C5，12 000 r/min 離心30 s。棄掉流出液，12 000 r/min 再次離心1 min。將MB 旋轉柱放入2 mL收集管中，加入100 μL的C6到白色濾膜中央。在室溫條件下12 000 r/min 離心30 s，棄掉MB 旋轉柱，試管中的DNA 可用于下一步試驗。

1.3.2 常規(guī)PCR 反應

根據(jù)熒光定量PCR 引物的設計原則，使用Primer 5 軟件進行引物設計。所設計引物序列為QS-2F（5′-CATCATTCGAATCGCTCTCA），和QS-2R（5′-GGGTATGAGCCCCACTATCA），由上海生工生物公司（長春）合成。

以總DNA 為模板，加入所設計實時熒光定量PCR 特異性引物，對目標片段進行擴增。反應體系為10 μL 2×Taq Master Mix、8.2 μL ddH2O、1 μL 總DNA、0.4 μL primer-F（10 μmol/L）、0.4 μL primer-R（10 μmol/L），反應體系總體積為20 μL。PCR 反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，30 ～35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.3.3 目的片段載體連接與熱激轉化

1）膠回收與載體連接。參照天根公司提供的膠回收試劑盒說明書進行切膠回收。向吸附柱CA2 中加入500 μL 平衡液BL，12 000 r/min 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。將單一的目的DNA 條帶從瓊脂糖凝膠中切下，放入干凈的離心管中，稱取其質量。向膠塊中加入等體積的PN 溶液，50 ℃水浴放置，其間不斷溫和地上下翻轉離心管，以確保膠塊充分溶解。將所得溶液加入吸附柱CA2 中，在室溫條件下放置2 min，12 000 r/min 離心30 ～60 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2 放入收集管中。向吸附柱CA2 中加入600 μL 漂洗液PW，12 000 r/min 離心30 ～60 s，棄廢液，將吸附柱CA2 放入收集管中，重復1 次該操作步驟。將吸附柱CA2 放回收集管中，12 000 r/min 離心2 min，除盡漂洗液后，在室溫條件下放置晾干；再將吸附柱CA2 放到離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，在室溫條件下放置2 min。12 000 r/min 離心2 min，收集DNA溶液。連接體系為4 μL 回收產(chǎn)物DNA、0.5 μL pEASY-T1 simple 載體、無菌水0.5 μL，總體積5 μL，反應5 min（25 ℃）。

2）熱激轉化。將上述產(chǎn)物加入50 μL trans1-T1 感受態(tài)細胞中，冰浴20 ～30 min。42 ℃金屬浴熱激30 s，反應結束后立即將產(chǎn)物冰浴2 min。將250 μL 液體LB 培養(yǎng)基加入上述體系中，在37 ℃條件下200 r/min 培養(yǎng)1 h。3 000 r/min 離心1 min，棄掉150 μL，輕彈混勻，取50 μL 均勻涂布到含50 mg/L 卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)基上。

3）陽性菌落檢測和測序。挑選單菌落加入到1 mL 含50 mg/L 卡那霉素的液體LB 培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下200 r/min 培養(yǎng)7 ～8 h。取1 μL 菌液作為模板加入到PCR（20 μL 體系）預混液中，進行PCR 反應。將檢測到的陽性克隆質粒送到上海生工生物公司（長春）測序。

4）質粒提取。按照天根公司提供的試驗方法進行質粒提取。向吸附柱CP3 中加入500 μL 平衡液BL，12 000 r/min 離心1 min，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。取1 ～5 mL 過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，12 000 r/min 離心1 min，吸除上清液。向留有菌體沉淀的離心管中加入250 μL的P1 溶液，使用渦旋振蕩器使懸浮細菌徹底沉淀。向離心管中加入250 μL 的P2 溶液，溫和地上下翻轉6 ～8 次，使菌體充分裂解。再加入350 μL 的P3 溶液，溫和地上下翻轉6 ～8 次，使之充分混勻，出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12 000 r/min 離心10 min。將收集的上清液轉移到吸附柱CP3 中，盡量不要吸出沉淀。12 000 r/min 離心30 ～60 s，棄廢液，將吸附柱CP3 放入收集管中。向吸附柱CP3 中加入500 μL去蛋白液PD，12 000 r/min離心30～60 s，棄廢液，將吸附柱CP3 重新放回收集管中。再加入600 μL 漂洗液PW，12 000 r/min 離心30 ～60 s，棄廢液，將吸附柱CP3 放入收集管中，重復該操作步驟多次。將吸附柱CP3 放入收集管中，12 000 r/min 離心2 min。將吸附柱CP3 置于離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50 ～100 μL 洗脫緩沖液EB，在室溫條件下放置2 min，12 000 r/min離心2 min，將質粒溶液收集到離心管中。

1.3.4 實時熒光定量PCR 檢測

實時熒光定量PCR 反應體系為10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、0.4 μL Primer 1（10 μmol/L）、0.4 μL Primer 2(10 μmol/L)、2 μL Template DNA、7.2 μL ddH2O，反應體系總體積為20 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)。

1）引物特異性檢測。選取擬枝孢鐮刀菌、層出鐮刀菌和三線鐮刀菌等自沙棘枝條和根際土壤分離的真菌DNA 作為模板，用ddH2O 作為陰性對照，進行實時熒光定量PCR，檢測引物的特異性。

2）實時熒光定量PCR 靈敏性檢測。將提取的擬枝孢鐮刀菌的DNA 進行梯度稀釋，使每微升模板的拷貝數(shù)為103～108。以梯度稀釋質粒DNA作為模板，以ddH2O 作為陰性對照，進行實時熒光定量PCR 反應，檢測實時熒光定量PCR 的靈敏性。由儀器內置程序繪制標準曲線，標準曲線的橫坐標為樣品拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標為反應循環(huán)數(shù)。

N=(C×6.02×1023)/[(L+L′)×660]。

式中：N為每微升模板的質?？截悢?shù)；C為質粒體積濃度；L為載體長度；L′為片段長度。

3）枝條和土壤樣品檢測。將所提取的枝條和土壤微生物基因組DNA 樣品進行實時熒光定量PCR 擴增反應。

2 結果與分析

2.1 擬枝孢鐮刀菌EF-1α 質粒的構建

將構建好的擬枝孢鐮刀菌EF-1α 質粒，以實時熒光定量PCR 特異性引物（QS-2F、QS-2R）進行菌落PCR，使用1.4%瓊脂糖進行凝膠電泳檢測，結果如圖1所示。由圖1 可見，陽性菌落條帶明顯，泳道4（CK）無條帶。將測序結果進行序列比對，發(fā)現(xiàn)同源性高達100%，說明EF-1a質粒構建成功。

圖1 擬枝孢鐮刀菌EF-1α 質粒特異性檢測結果Fig.1 Specific detection result of F.sporotrichioides EF-1α fragment plasmid

2.2 實時熒光定量PCR 引物的特異性

PCR 引物特異性檢測結果如圖2所示。由圖2 可見，所設計的實時熒光定量PCR 特異性引物（QS-2F、QS-2R）以擬枝孢鐮刀菌為DNA 模板能進行有效擴增，且PCR 呈陽性反應，其他供試菌株的DNA 模板及陰性對照均未檢測到條帶，證明該引物對擬枝孢鐮刀菌具有較高的特異性。

圖2 實時熒光定量PCR 引物特異性的電泳檢測結果Fig.2 PCR primer specific detection

2.3 擬枝孢鐮刀菌實時熒光定量PCR 的靈敏性

提取擬枝孢鐮刀菌EF-1α 質粒DNA 后，分別稀釋成不同質粒DNA 模板濃度，使每微升模板的拷貝數(shù)為103～108，進行擬枝孢鐮刀菌實時熒光定量PCR 擴增（圖3）和常規(guī)PCR 擴增。

圖3 擬枝孢鐮刀菌EF-1α 質粒實時熒光定量PCR 擴增結果Fig.3 Amplification result of quantitative real-time PCR for F.sporotrichioides EF-1α fragment plasmid

擬枝孢鐮刀菌實時熒光定量PCR 標準曲線如圖4所示。由圖4 可見，反應循環(huán)數(shù)和DNA 濃度的對數(shù)呈現(xiàn)線性關系。

圖4 擬枝孢鐮刀菌實時熒光定量PCR 標準曲線Fig.4 Standard curve of quantitative real-time PCR for F.sporotrichioides

應用常規(guī)PCR 擴增結果進行電泳，結果如圖5所示。由圖5 可見，以質粒作為模板且每微升的拷貝數(shù)為108～104時，有明顯條帶；在每微升的拷貝數(shù)為103時，能觀察到微弱條帶；在每微升的拷貝數(shù)為102、10 時及陰性對照中均未檢測到條帶。進行實時熒光定量PCR 擴增時，能夠有效檢測每微升的拷貝數(shù)為103。表明所建立的實時熒光定量PCR 方法的靈敏性優(yōu)于常規(guī)PCR。

圖5 普通PCR 檢測不同濃度擬枝孢鐮刀菌EF-1α 質粒DNA 的電泳結果Fig.5 The electrophoresis diagram of ordinary PCR for different concentrations of plasmid DNA of F.sporotrichioides

2.4 枝條和土壤DNA 樣品的擬枝孢鐮刀菌實時熒光定量PCR 定量檢測

將枝條和土壤DNA 樣品進行擬枝孢鐮刀菌實時熒光定量PCR 擴增，結果表明在25 份枝條樣品中有6 份存在擬枝孢鐮刀菌，在12 份土壤樣品中有1 份存在擬枝孢鐮刀菌。將檢測結果代入擬枝孢鐮刀菌實時熒光定量PCR 標準曲線，結果如圖6所示。由圖6 可見：每微升所提取枝條DNA樣品的擬枝孢鐮刀菌拷貝數(shù)為103.75～104.15，即每克枝條樣品的擬枝孢鐮刀菌拷貝數(shù)為6×104.75～6×105.15；每微升所提取GSGD 土壤DNA 樣品的擬枝孢鐮刀菌拷貝數(shù)是103.82，即每克土壤樣品的擬枝孢鐮刀菌拷貝數(shù)為6×104.82。

圖6 枝條和土壤樣品中擬枝孢鐮刀菌數(shù)量的實時熒光定量PCR 定量檢測結果Fig.6 Quantitative real-time PCR quantitative detection of the expression of F.sporotrichioides in branches and soil

3 結論與討論

沙棘枝枯病是由擬枝孢鐮刀菌引起的系統(tǒng)性病害，有必要建立一套有效的擬枝孢鐮刀菌檢測體系進行沙棘枝枯病的早期防控。本研究中通過設計特異性引物，優(yōu)化了一種精準檢測沙棘枝枯病的方法—擬枝孢鐮刀菌實時熒光定量PCR 法。本研究中所用引物是基于翻譯延伸因子（EF-1α）設計的[22]，可以特異性擴增擬枝孢鐮刀菌，能夠較好地區(qū)分擬枝孢鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、三線鐮刀菌以及其他多種致病菌，同時能夠定性定量檢測沙棘枝干和土壤的病原菌密度。本研究中建立了擬枝孢鐮刀菌質粒檢測標準曲線，使用該曲線得到的每微升DNA 樣本的檢測拷貝數(shù)是103～108。通過對21 份枝條和土壤樣品進行檢測，在7份樣品中發(fā)現(xiàn)熒光信號，進一步證明了該方法的實用性和可操作性。

本研究中采用的擬枝孢鐮刀菌實時熒光定量PCR 檢測方法可替代傳統(tǒng)的稀釋平板計數(shù)法，具有易操作、特異性強和靈敏度高等優(yōu)點，該方法有利于研究病原菌在沙棘植物組織和土壤中的分布。

目前，常規(guī)PCR 已被應用于生態(tài)監(jiān)測、植物病害診斷和病原物鑒定等方面[18]，但是該方法僅適用于植物枝干和土壤內含病原菌的鑒定，不能進行定量檢測[8]。土壤中病原菌的傳統(tǒng)檢測方法操作復雜、靈敏度低且檢測時間長[21]。實時熒光定量PCR 技術既有常規(guī)PCR 擴增的高靈敏性，且兼?zhèn)銬NA 雜交的高特異性和光譜技術的高精確定量，既彌補了傳統(tǒng)PCR 檢測的缺點，又不會對環(huán)境造成污染[23]。該技術的采用大大降低了對植物枝干、空氣及土壤中病原菌的定性和定量檢測難度。例如，該技術在小麥葉片中條銹病菌和白粉病菌的檢測[24-25]及水稻種子中惡苗病菌的定量檢測[26]中均得到了較好應用[27]。本研究中僅針對甘肅地區(qū)沙棘枝枯病樣品的病原菌擬枝孢鐮刀菌進行了定量檢測，還應使用其他地區(qū)的樣品對該檢測方法進行驗證和優(yōu)化。