基于Wnt/β-catenin信號通路探討血府逐瘀湯在非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKI獲得性耐藥中的作用

王理槐，孫銀輝，張領(lǐng)兄，劉 歡，周 琴，袁蘇云，張亞茹，朱 樂，張 紅

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；3.重慶市九龍坡區(qū)中醫(yī)院，重慶 400051)

我國肺癌的發(fā)病率和病死率近年來不斷升高，已位居所有惡性腫瘤的首位，其中又以非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma,NSCLC)為其主要類型，多數(shù)NSCLC患者確診即為晚期，治療棘手，5年生存率較低[1-2]。以厄洛替尼為代表的表皮生長因子(Epidermal growth factor receptor,EGFR)-酪氨酸酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitor,TKI)分子靶向藥物的出現(xiàn)則為NSCLC的治療帶來了重大突破，然而耐藥性的產(chǎn)生使得TKI的靶向治療極為受限，而EGFR的突變導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號通路的激活是引起NSCLC患者對TKI敏感性降低的重要機制之一[3-5]。眾多研究[6-7]表明，對NSCLC患者采取EGFR-TKI與中醫(yī)藥的聯(lián)合治療可有效控制疾病進展，獲得較長的無進展生存期，筆者在對臨床病例的觀察中亦發(fā)現(xiàn)，該療效的產(chǎn)生或與中醫(yī)藥可延緩NSCLC患者對TKI耐藥的產(chǎn)生有關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為久病成瘀，各類惡性腫瘤的始終皆與瘀血密切相關(guān)，活血化瘀當(dāng)是其治療各類腫瘤的基本治則之一，血府逐瘀湯也已廣泛用于各類腫瘤的治療，療效較佳[8]。本研究擬從動物實驗探討血府逐瘀湯對NSCLC獲得性耐藥的療效，及其是否可調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白進而延緩或抑制厄洛替尼耐藥性的產(chǎn)生，以期為臨床中醫(yī)藥抑制靶向治療NSCLC耐藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：Balb/c小鼠50只雌雄各半(其中10只以防小鼠意外死亡備用)，SPF級，體重18～22 g，8～10周齡，于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司購買，均按清潔級標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心，室溫25 ℃，自由飲食和進水。動物的使用均根據(jù)我?！秾嶒瀯游锕芾硪?guī)定》實施。

1.1.2 藥物：鹽酸厄洛替尼片(上海羅氏制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20170030，規(guī)格1.5 g/片)；血府逐瘀湯：桃仁12 g，紅花、當(dāng)歸、生地、牛膝各9 g，川芎、桔梗各5 g，赤芍、枳殼各6 g，柴胡、甘草各3 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院藥劑科提供，經(jīng)煎藥機煮成湯劑，60 ℃分別濃縮成含生藥15 mg/ml(低劑量)、45 mg/ml(高劑量)，4 ℃儲備存用。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞來源：將對厄洛替尼獲得性耐藥的NSCLC細(xì)胞株P(guān)C9/ER(購于上海傳秋生物科技有限公司)置于RPMI 1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%青鏈霉素)中傳代培養(yǎng)，傳代至足夠數(shù)量后，采用胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，并取少量懸液臺盼藍染色鑒定活細(xì)胞含量超過95%，最后離心去上清，以無血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)制濃度為2×107個/ml PC9/ER細(xì)胞懸液備用。

1.2.2 動物造模及給藥：將調(diào)制的PC9/ER細(xì)胞懸液接種于所有裸鼠左側(cè)腋部皮下，每只接種2點，每點0.2 ml。待2周后，所有小鼠均成瘤，腫瘤體積均達150～250 mm3，從中選取腫瘤體積較均勻的40只裸鼠，隨機分為五組，每組8只?？瞻捉M：給予0.9%氯化鈉溶液(0.4 ml/只)灌胃；TKI組：給予厄洛替尼30 mg/(kg·d)灌胃給藥；低劑量組：以15 mg/ml低劑量血府逐瘀湯按30 ml/(kg·d)灌胃給藥；高劑量組：以45 mg/(kg·d)血府逐瘀湯按30 ml/(kg·d)灌胃給藥；高劑量+TKI組：45 mg/ml血府逐瘀湯按30 ml/(kg·d)標(biāo)準(zhǔn)并聯(lián)合厄洛替尼30 mg/(kg·d)標(biāo)準(zhǔn)灌胃給藥。所有組別均為每天給藥1次，共給藥20 d。于第20天給藥后稱重后處死所有裸鼠，并剝離移植瘤。

1.2.3 觀察指標(biāo)：①瘤體體積：給藥前及給藥后每4 d測量瘤體最長徑(a)和最短徑(b)，并根據(jù)公式V=πab2/6(mm3)算出瘤體體積。②生長抑制率：依據(jù)瘤體體積大小繪制腫瘤的生長曲線圖，計算腫瘤的生長抑制率(TWI%)=(C-T)/C×100%，C為空白組小鼠平均體積、T為給藥組小鼠體積。③腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)：將石蠟處理后的瘤體樣本以4 μm厚度切片，并進行免疫組織化學(xué)和HE染色，每張切片以顯微鏡隨機選擇5個高倍視野，對Ki67陽性細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)進行計數(shù)，并計算Ki67指數(shù)=Ki67陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。Ki67指數(shù)越高表明腫瘤生長越快，組織分化能力越差。④Wnt3α、P-GSK3β與β-catenin的蛋白表達：用Western blot法檢測，將冷凍腫瘤組織在液氮中迅速研磨成粉末，加入細(xì)胞裂解液(含蛋白酶和磷酸酶抑制劑)，冰上裂解后于4 ℃ 12000 g離心15 min，取上清液，應(yīng)用BCA分析試劑測定蛋白濃度，50 μg蛋白質(zhì)在SDS-PAGE 電泳分離，半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4 ℃過夜，TBST洗膜3次，加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，加入ECL發(fā)光液暗室中顯影，圖像掃描，以GAPDH蛋白的表達為內(nèi)參照，應(yīng)用凝膠圖像軟件分析目標(biāo)條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組瘤體體積比較 見表1。在給藥第16天、第20天時，高劑量+TKI組瘤體體積小于空白組及TKI組，給藥第20天，高劑量組瘤體體積小于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組瘤體體積比較(mm3)

2.2 各組瘤體生長抑制率比較 見表2。在給藥第16天、第20天時，高劑量+TKI組瘤體生長抑制率高于TKI組、高劑量組，給藥第20天，高劑量組瘤體生長抑制率高于TKI組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組瘤體生長抑制率比較(%)

2.3 各組腫瘤細(xì)胞增殖Ki67指數(shù)比較 見表3。空白組、TKI組、低劑量組腫瘤細(xì)胞增殖Ki67指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；高劑量組、高劑量+TKI組腫瘤增殖Ki67指數(shù)均低于空白組，高劑量+TKI組腫瘤增殖Ki67指數(shù)低于高劑量組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組腫瘤細(xì)胞增殖Ki67指數(shù)比較

2.4 各組Wnt3α、P-GSK3β與β-catenin的蛋白表達情況 空白組、TKI組、低劑量組Wnt3α、P-GSK3β與β-catenin的蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；高劑量組、高劑量+TKI組Wnt3α、β-catenin蛋白表達均低于空白組，P-GSK3β蛋白表達均高于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：與空白組比較，*P<0.05圖1 血府逐瘀湯對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

3 討 論

對于NSCLC的治療，EGFR-TKI獲得性耐藥的定義為曾接受過厄洛替尼等TKI藥物的治療并按WHO標(biāo)準(zhǔn)取得了確實的臨床療效一段時間后腫瘤又繼續(xù)進展[9]。因此，由于對晚期NSCLC有效治療手段的相對匱乏，相較于原發(fā)性耐藥，解決獲得性耐藥TKI治療敏感性問題，延長其臨床獲益時間，對于該類NSCLC患者具有重要臨床意義，可有效提高其5年生存率及生活質(zhì)量。NSCLC屬于中醫(yī)學(xué)“癥瘕”“積聚”等范疇，多數(shù)醫(yī)家皆認(rèn)為血瘀是“癥瘕”發(fā)生發(fā)展的主要病理基礎(chǔ)，如《血證論》中有云：“瘀血在經(jīng)絡(luò)臟腑，則結(jié)留癮，氣為血滯，故聚而成形”[10]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)亦佐證，血液流變學(xué)的異常和微循環(huán)障礙在各類腫瘤中普遍存在，血液高黏、微循環(huán)灌注不足，血管內(nèi)皮功能受損，繼而異形血管大幅增生，使腫瘤細(xì)胞有更多機會接觸血管，并分泌細(xì)胞因子加速異形血管的增生，從而促進自身生長，并形成癌栓轉(zhuǎn)移，可見血瘀證是貫穿各類惡性腫瘤始終的重要病理基礎(chǔ)[11-12]。血府逐瘀湯是活血化瘀法治療血瘀證的代表方，同時兼具行氣止痛之功，由桃仁、紅花、當(dāng)歸、生地等藥組成，其在各類惡性腫瘤的治療中均有一定應(yīng)用，筆者運用其治療肺癌已有多年，該方對于厄洛替尼治療NSCLC具有較好的協(xié)同作用，療效較佳，因此筆者思考其取得較好協(xié)同作用的機制之一是否為提升NSCLC對EGFR-TKI的敏感性，延長患者厄洛替尼的臨床獲益時間。

本實驗結(jié)果顯示，在給藥第16天時高劑量+TKI組瘤體體積、瘤體生長抑制率指標(biāo)的改善均優(yōu)于其他各組，其他各組間則無明顯差異，在給藥第20天時，高劑量+TKI組兩項指標(biāo)的改善同樣最優(yōu)，而高劑量組相較于空白組亦有了一定改善，其他各組則無明顯差異。表明高劑量的血府逐瘀湯對于獲得性耐藥NSCLC的治療具有一定療效，但其與TKI連用時，可提高獲得性耐藥NSCLC對EGFR-TKI的敏感性，進而獲得更佳效果，明顯優(yōu)于單一使用，而低劑量的血府逐瘀湯則無明顯療效，腫瘤細(xì)胞增殖Ki67指數(shù)高劑量組+TKI組最優(yōu)，高劑量組其次，剩余各組則無明顯差別亦可佐證以上觀點。血府逐瘀湯中桃仁、紅花、川芎等藥破血祛瘀以止痛，牛膝引血下行，使中、上焦之瘀滯化有去路，生地、當(dāng)歸則養(yǎng)血益陰，以達瘀血去、新血生之效，氣為血之帥，故再加桔梗、枳殼、柴胡寬胸理氣，以助血行并防血瘀所致之氣滯，同時桔?？奢d藥上行，使藥效直達病位，全方活血行氣并行，祛瘀養(yǎng)血同施，故可有效治療血瘀所致諸癥[13]。現(xiàn)代藥理研究[14-15]也表明，該方具有抑制血小板聚集、擴張微血管、促進血液流動等效果，進而可明顯改善全身血液循環(huán)障礙，同時當(dāng)歸、柴胡、牛膝等藥還能促進TB淋巴細(xì)胞的活化，調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答，進而發(fā)揮抑瘤作用，并起到了提高EFGR對TKI敏感性的效果。此外，血府逐瘀湯發(fā)揮其抗腫瘤效果和改善EGFR-TKI耐藥作用與時間及劑量具有一定相關(guān)性，腫瘤的血瘀證表現(xiàn)為全身性微循環(huán)障礙，往往需要一定的治療時間及較高劑量才可取得一定療效，本實驗中指標(biāo)的改善均在給藥16 d后才有明顯差別。

Wnt/β-catenin信號通路參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，同時對包括NSCLC的多類惡性腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移均具有調(diào)控作用，在NSCLC細(xì)胞中具有較高活性，該信號通路主要包括Wnt3α、P-GSK3β、β-catenin蛋白等[16]。EGFR突變導(dǎo)致的其對TKI敏感性降低50%是由于其外顯子中第790號氨基酸位點(T790M)的突變形，已有研究[17-18]證實發(fā)生T790M突變的患者中β-catenin存在明顯的異常激活及表達，而敲低β-catenin可明顯提高非敏感的肺癌細(xì)胞對TKI的敏感性，故而調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路的異常是改善EGFR-TKI獲得性耐藥及抑制NSCLC病情進展的有效途徑之一。正常情況下，Wnt/β-catenin通路為靜息狀態(tài)，Wnt3α低表達，僅極為稀少的β-catenin在細(xì)胞膜上表達，P-GSK3β為該通路的負(fù)相調(diào)控蛋白，多數(shù)胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin可被P-GSK3β形成的復(fù)合物磷酸化降解[19]。而NSCLC患者的肺癌細(xì)胞可受到刺激信號，Wnt3α等蛋白表達激活，并于Frizzled家族受體結(jié)合，使散亂蛋白聚集于胞膜處磷酸化P-GSK3β，阻止其復(fù)合物的形成，進而穩(wěn)定并促進β-catenin蛋白的表達，而作為該信號通路激活的核心因子，大量聚集的β-catenin可與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子結(jié)合，從而激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，最終促進肺癌細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)TKI獲得性耐藥的產(chǎn)生[20]。本實驗結(jié)果表明高劑量組、高劑量+TKI組Wnt3α、β-catenin蛋白表達均低于空白組，P-GSK3β蛋白表達均高于空白組，剩余各組則無明顯差別，提示高劑量的血府逐瘀湯可下調(diào)NSCLC患者Wnt3α的異常表達，上調(diào)P-GSK3β表達，恢復(fù)其復(fù)合物對β-catenin的正常降解功能，進而抑制Wnt/β-catenin信號通路的過度激活，發(fā)揮抗腫瘤及改善TKI獲得性耐藥的作用。

綜上，高劑量血府逐瘀湯可抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，通過下調(diào)Wnt3α、β-catenin蛋白表達，上調(diào)P-GSK3β蛋白表達來延緩EGFR-TKI獲得性耐藥NSCLC小鼠腫瘤進展，抑制腋下移植瘤體積，降低腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)。