纖維素類可吸收止血材料體外效果評價方法

張爽，葉紅，朱玉，童琳，曹琛，馬征，徐慶華

在臨床手術(shù)過程中，安全有效的止血方式非常重要，優(yōu)良的止血材料可以保障患者的生命安全，提高手術(shù)效率[1]?？晌罩寡牧献鳛橐环N可被人體吸收的醫(yī)療器械產(chǎn)品，主要適用于手術(shù)過程中無法使用常規(guī)止血技術(shù)的情況，其通過促進(jìn)局部傷口的血液凝固來實現(xiàn)止血[2]。常見的止血產(chǎn)品依據(jù)其材質(zhì)可以分為纖維素類、膠原蛋白/明膠類、淀粉類、殼聚糖類、纖維蛋白類。材料不同，止血機制也有差異。其中，纖維素類止血產(chǎn)品在市場中占有的比重最大[3]。纖維素是D-葡萄糖殘基通過 β-1,4 連接形成的多糖聚合物。纖維素鏈的線性結(jié)構(gòu)能夠滿足各種生化需求。纖維素對人體組織具有天然的生物相容性，可以改性成多種形式，如氧化纖維素、氧化再生纖維素、醋酸纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素等，它們的理化性質(zhì)各有差異。纖維素在其改性后能夠表現(xiàn)出優(yōu)秀的生物效應(yīng)。

可吸收止血材料直接接觸創(chuàng)傷表面，發(fā)揮止血功效，需要擁有更加良好的凝血性和組織相容性[4]。國內(nèi)市場上可吸收止血產(chǎn)品種類繁多，但是臨床前的評價標(biāo)準(zhǔn)還比較缺乏，現(xiàn)僅有一部 2016年國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布的《可吸收止血產(chǎn)品注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》，導(dǎo)致臨床上對于該類產(chǎn)品的選擇沒有一定的指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)[2,5]。因此建立可吸收止血材料的評價體系，對規(guī)范可吸收止血材料的臨床使用具有重要的參考價值。

為此，實驗開展了可吸收止血材料評價體系的研究，實驗共選取了市售的 3 種不同材質(zhì)的纖維素類可吸收止血材料，分別對其抑菌性、體外降解性以及體外凝血性進(jìn)行評價，為篩選出安全、有效的可吸收止血材料提供理論基礎(chǔ)以及參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗共選取 3 種市售常用纖維素類止血材料。A 類材料為氧化再生纖維素（oxidized regenerated cellulose，ORC）。ORC 吸收血液后，會形成黑色或褐色的塊狀，可在很短的時間內(nèi)達(dá)到止血效果，其臨床適應(yīng)證包括傷口修復(fù)和組織重建。B 類材料為羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）。CMC 是一種半天然聚合物，具有較強的吸水性。它在生理上無毒，與黏膜、骨骼和皮膚相容，可以與組織緊密結(jié)合，從而閉合傷口[6]。C 類材料為羥乙基纖維素（hydroxyethyl dellulose，HEC）。HEC 材料本身及代謝產(chǎn)物的 pH 值為中性，HEC 材料最終代謝產(chǎn)物可以分解成人體可吸收的產(chǎn)物，減少血栓的形成，適用于手術(shù)、創(chuàng)傷等創(chuàng)面[7]。

1.2 方法

1.2.1 抑菌性 依據(jù)《WS/T 650-2019 抗菌和抑菌效果評價方法》[8]，實驗采用抑菌環(huán)法。抑菌片的制備：無菌環(huán)境下，將 A 類、B 類、C 類 3 種材料制成直徑為 5 mm，厚度不超過 4 mm 的圓片（塊），每 4 片為一組。陰性對照樣片的制備：將濾紙片制成與實驗組大小相同的圓片（塊）[8]。

采用的實驗菌株為金黃色葡萄球菌 ATCC6538 和大腸桿菌 8099 的凍干株，傳代培養(yǎng)，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，37 ℃ 條件下培養(yǎng) 24 h，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）將實驗菌 24 h 新鮮斜面培養(yǎng)物稀釋濃度至 3.0 × 106CFU/ml，用無菌棉拭子蘸取菌液，均勻涂抹在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面，蓋好平皿，室溫放置后備用。用無菌鑷子在每個染菌平板上放置 4 片實驗樣片，中心處放置 1 片陰性對照樣片，共 5 片。各樣片中心點距離 ＞ 25 mm，與平板的周緣距離＞ 15 mm。將平板置于 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)的直徑并記錄，實驗重復(fù) 3 次[8]。

1.2.2 體外降解性 實驗主要觀察 3 種材料在 PBS 緩沖液、生理鹽水溶液中的溶解差異。實驗在室溫 25 ℃、標(biāo)準(zhǔn)氣壓的條件下進(jìn)行。將 A 類、B 類、C 類 3 種材料分別處理成 2 cm × 2 cm 大小的試樣。在試管中分別加入5 ml 的 PBS 緩沖液、生理鹽水溶液備用，將 3 種處理過的止血材料分別加入上述試管中，打表計時，觀察樣品在 0、1、2、5、10、30 min 時的溶解性。

1.2.3 降解產(chǎn)物的鑒別 分別在飽和 A 類材料生理鹽水溶液、1% B 類材料生理鹽水溶液、1% C 類材料生理鹽水溶液中加入終濃度為 0.2% 的纖維素酶溶液，室溫下反應(yīng)120 h。取 200 μl 反應(yīng)液，分別加入 200 μl 氫氧化鈉溶液（0.1 g/ml）和200 μl硫酸銅溶液（0.05 g/ml）。沸水浴中加熱，觀察溶液顏色變化[9]。以 1% 葡萄糖溶液為陽性對照，以飽和 A 類材料生理鹽水溶液、1% B 類材料生理鹽水溶液、1% C 類材料生理鹽水溶液、1% 纖維素酶溶液為陰性對照。

1.2.4 終降解產(chǎn)物濃度的測定 采用 3,5-二硝基水楊酸（DNS）法定量測定葡萄糖含量[9]。稱取 0.3 g DNS，置于100 ml 燒杯中，用 50 ml 去離子水完全溶解，繼續(xù)加入氫氧化鈉 1.6 g，酒石酸鉀鈉 3 g，結(jié)晶酚 0.5 g，無水亞硫酸鈉 0.5 g，攪拌至所有成分完全溶解，轉(zhuǎn)移至 100 ml 棕色容量瓶中，用去離子水定容至刻度，搖勻，常溫放置 7 d 后使用[9]。精確配制 2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。將配制好的 0.5 ml DNS 試劑加入到含有 1.0 ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液的試管中，沸水浴中反應(yīng) 5 min 后，立刻放入冰水浴中冷卻，定容至 20 ml，顛倒混勻后室溫下靜置 20 min。用紫外可見分光光度計在 540 nm 波長下測量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。

1.2.5 體外倒置凝血實驗 取出 A 類、B 類、C 類 3 種止血材料以及對照組醫(yī)用紗布，分別處理成 2 cm × 2 cm 大小的試樣，放置于無菌培養(yǎng)皿中，37 ℃ 保溫 5 min 待用。向待測樣品表面滴加 400 μl 37 ℃ 預(yù)熱抗凝大鼠血液，充分浸潤待測樣品后，立刻向待測樣品表面滴加 45 μl 的氯化鈣溶液（0.2 mol/L），將樣品放置于 37 ℃ 培養(yǎng)箱中，觀察3 種止血材料在反應(yīng) 5 min 后出現(xiàn)凝血現(xiàn)象的差別。

1.2.6 體外動態(tài)凝血 取出 A 類、B 類、C 類 3 種止血材料以及對照組醫(yī)用紗布，分別處理成 1 cm × 1cm 大小的試樣，放置于無菌培養(yǎng)皿中，37 ℃ 保溫 5 min 待用。

向待測樣品表面滴加 200 μl 37 ℃ 預(yù)熱抗凝大鼠血液，充分浸潤待測樣品后，立刻向待測樣品表面滴加 25 μl 0.2 mol/L 的氯化鈣溶液，將培養(yǎng)皿放入氣浴恒溫振蕩器中以 37 ℃、80 r/min 的條件充分振蕩 1、5、10 min，取出培養(yǎng)皿，用 20 ml 超純水進(jìn)行淋洗，淋洗出未被止血紗布凝血的紅細(xì)胞，收集淋洗液后放置于離心機中，以 300 r/min離心 5 min。離心結(jié)束后，采用紫外可見分光光度計測量樣品的淋洗液在 540 nm 下的吸光度，實驗采用普通醫(yī)用紗布與未加材料的抗凝大鼠血液作為陰性對照組以及空白對照組。實驗重復(fù) 3 次，觀察比較止血材料的凝血性能差異。吸光度值越高，表明材料凝血效果越差，反之說明凝血效果越好[10]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，組間比較符合正態(tài)分布的采用方差檢驗，組內(nèi)兩兩比較采用 LSD 法，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑菌性

游標(biāo)卡尺測得抑菌環(huán)直徑：A 類材料大腸桿菌組為（8.67 ± 0.57）mm，金黃色葡萄球菌組為（8.68 ± 0.64）mm。A 類材料抑菌環(huán)直徑均 ＞ 7 mm，B 類、C 類材料無抑菌環(huán)產(chǎn)生，說明 A 類材料對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌作用。而 B 類、C 類材料對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌沒有抑菌作用（圖1）。重復(fù)上述實驗 3 次，結(jié)果相同。

圖1 不同種類可吸收止血材料體外抑菌效果

2.2 體外降解性

室溫條件下可觀察到 B 類、C 類在 PBS 緩沖液、生理鹽水這兩種溶液中會迅速吸水膨脹溶解，由纖維網(wǎng)眼型織物變?yōu)橥该鞯哪z狀物質(zhì)，然后在較短的時間內(nèi)完全溶解于溶液中，溶液呈澄清透明狀。

由圖2 可以看出，3 種止血材料都是纖維素的衍生物，雖具有類似的纖維結(jié)構(gòu)，但是理化性質(zhì)不同。體外環(huán)境下，B 類、C 類材料比 A 類材料具有更好的溶解性。

圖2 不同種類可吸收止血材料體外降解性比較

2.3 終降解產(chǎn)物濃度的測定

3 種可吸收止血材料在纖維素酶作用下降解產(chǎn)物的顯色如圖3 所示。A 類材料降解產(chǎn)生葡萄糖不明顯，B 類、C 類材料主要降解產(chǎn)物為葡萄糖，A 類、B 類、C 類材料未經(jīng)纖維素酶處理的溶液均無明顯的葡萄糖產(chǎn)生。DNS 法測定葡萄糖的線性方程為 A = 9.99 × 10-3+ 2.05 × 10-2C，相關(guān)系數(shù)r= 0.998，表明葡萄糖濃度在 0.0625 ～ 2.0 mg/ml內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

圖3 不同種類可吸收止血材料在纖維素酶作用下降解產(chǎn)物的顯色（A：加熱前顯色結(jié)果；B：加熱后顯色結(jié)果。從左至右分別為 1% 纖維素酶，1% 葡萄糖，1% A 類材料去離子水溶液，1% A 類材料與纖維素酶作用液，1% B 類材料去離子水溶液，1% B 類材料與纖維素酶作用液，1% C 類材料去離子水溶液，1% C 類材料與纖維素酶作用液）

A 類材料在纖維素酶的催化作用下緩慢降解，如圖4A 所示。該降解反應(yīng) 30 s 內(nèi)葡萄糖生成速率為0.72 mg/(ml·min)，在 5880 min 以后，在降解曲線上發(fā)現(xiàn) A類材料有緩慢的二級降解反應(yīng)，可能是因為 A 類材料在水中的溶解性較低，纖維素酶吸附到材料后產(chǎn)生了進(jìn)一步的降解反應(yīng)，后期葡萄糖生成速率為 1.74 × 10-4mg/(ml·min)。A 類材料降解的終濃度為（0.88 ± 0.14）mg/ml。

B 類材料在纖維素酶催化作用下，生成葡萄糖，如圖4B 所示。在此降解反應(yīng)中，初期葡萄糖生成速率約為2.44 mg/(ml·min)，1 min 時達(dá)到峰值，峰濃度為 1.26 mg/ml，是 B 類材料初始濃度水平的 42%，葡萄糖終濃度為（1.21± 0.11）mg/ml，是 B 類材料初始濃度水平的 40.3%。

C 類材料在纖維素酶催化作用下，生成葡萄糖，如圖4C 所示。在此降解反應(yīng)中，初期葡萄糖生成速率約為2.22 mg/(ml·min)，5 min 時達(dá)到峰值，峰濃度為 1.25 mg/ml，是 C 類材料初始濃度水平的 41.7%，葡萄糖終濃度為（1.12 ± 0.10）mg/ml，是 C 類材料初始濃度水平的 37.3%。

圖4 不同種類止血材料降解反應(yīng)中產(chǎn)生葡萄糖含量與時間關(guān)系圖

說明B 類、C 類材料在水中的溶解性較好，反應(yīng)生成葡萄糖的速度較快，葡萄糖是 B 類、C 類材料降解過程中的中間產(chǎn)物，在 B 類、C 類材料的降解曲線上，葡萄糖濃度在 1 min 后未發(fā)現(xiàn)明顯的增加或降低趨勢，說明它們在監(jiān)測時間內(nèi)均未發(fā)生二級降解反應(yīng)。

2.4 體外倒置凝血

實驗結(jié)果（圖5）顯示，37 ℃ 反應(yīng) 5 min 后，A 類材料出現(xiàn)明顯的血液凝結(jié)現(xiàn)象，材料上血樣已經(jīng)開始凝聚，倒置未出現(xiàn)血液下滴現(xiàn)象，凝血效果較好。B 類材料的血液凝結(jié)效果其次，C 類材料血樣未完全凝固，凝血效果最差。通過觀察結(jié)果顯示：A 類材料的凝血能力優(yōu)于 B 類、C 類材料。

圖5 體外倒置凝血效果圖

2.5 體外動態(tài)凝血

結(jié)果顯示不同時間段，各組材料間凝血效果差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；10 min 時，3 種止血材料與陰性、空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），3 種止血材料都表現(xiàn)出促凝血效果。A 類材料的快速凝血能力優(yōu)于 B 類、C 類材料，5 min 時A 類材料與 B 類、C 類材料出現(xiàn)凝血效果差異，這也與體外倒置凝血實驗的結(jié)果吻合（表1）。

表1 不同種類可吸收止血材料吸光度（± s ）

表1 不同種類可吸收止血材料吸光度（± s ）

注：a為與 A 類比較，P ＜ 0.05；*為與陰性比較，P ＜ 0.05；#為與空白比較，P ＜ 0.05。

材料 1 min 5 min 10 min A 類材料 0.97 ± 0.05*# 0.75 ± 0.21*# 0.68 ± 0.06*#B 類材料 1.00 ± 0.08# 0.99 ± 0.06a 0.76 ± 0.07*#C 類材料 0.99 ± 0.09*# 0.95 ± 0.02a# 0.82 ± 0.16*#陰性對照 1.10 ± 0.07 1.11 ± 0.02 1.07 ± 0.02空白對照 1.14 ± 0.04 1.14 ± 0.06 1.03 ± 0.11 F 值 3.906 7.206 9.106 P 值 0.037 0.005 0.002

3 討論

在手術(shù)過程中，為了減少出血量、縮短手術(shù)時間、避免感染以及二次手術(shù)的發(fā)生，以提高手術(shù)質(zhì)量和效率，便于患者的恢復(fù)，對于可吸收止血材料的合理選擇是必要的[4]。目前市場上存在品種多樣的可吸收止血材料，但在臨床使用中存在各種問題。作為可植入于人體內(nèi)的第三類醫(yī)療器械，對可吸收止血材料的使用具有更高的標(biāo)準(zhǔn)要求[5]。本實驗主要研究的是纖維素類可吸收止血材料抑菌性、體外降解性以及體外凝血性。

傳統(tǒng)的手術(shù)紗布摘除時可能會與皮膚組織等粘連而造成二次創(chuàng)傷，不利于傷口的愈合，增加患者和醫(yī)護(hù)人員的負(fù)擔(dān)。而手術(shù)后大量或長期使用抗生素，會對機體產(chǎn)生副作用及耐藥性。若止血材料具有抑菌功能，將會更有利于創(chuàng)傷修復(fù)[11]。對可吸收止血材料抑菌性能進(jìn)行評價，對于止血材料的臨床使用指導(dǎo)以及醫(yī)院耗材管理都具有較大的參考價值[2]。因此，可吸收止血材料抑菌性的研究越來越被重視，根據(jù)《WS/T650-2019 抗菌和抑菌效果評價方法》結(jié)果判定，A 類材料具有抑菌性能，B 類、C 類材料沒有顯示出抑菌性能，這也和 3 種市售產(chǎn)品的功能宣稱相吻合。

可吸收止血材料的體內(nèi)降解性能是其產(chǎn)品特征之一，體內(nèi)降解性是評價安全性的指標(biāo)。而本實驗進(jìn)行的是體外降解性的研究，B 類、C 類材料可以在體外環(huán)境下迅速水解，這與材質(zhì)有關(guān)系。體外環(huán)境下降解性能快的產(chǎn)品是否會導(dǎo)致材料崩解過快，從而對臨床手術(shù)中止血有影響，需要進(jìn)一步的實驗驗證。由于人體中不含有纖維素酶，所以體內(nèi)和體外降解性的差異需要進(jìn)一步的研究。

生理環(huán)境止血能力是止血材料最重要的功能，其凝血能力直接反映了止血材料的實用價值。實驗中 3 種止血材料都表現(xiàn)出促凝血效果，A 類材料的快速凝血能力優(yōu)于 B類、C 類材料。

使用此種方式建立可吸收止血材料臨床前抑菌性、體外降解性以及體外凝血性評價體系，結(jié)果真實可靠，方法簡便且穩(wěn)定，有利于對可吸收止血材料臨床前性能進(jìn)行評價，把控產(chǎn)品質(zhì)量。局限性在于降解性以及凝血性僅進(jìn)行了體外實驗，并未開展相關(guān)體內(nèi)實驗，需要對評價方法進(jìn)行進(jìn)一步的驗證與完善。

據(jù)估計，到 2024年全球醫(yī)療器械市場銷售額將達(dá)到5945 億美元[12]。國內(nèi)也有越來越多的可吸收止血材料的研發(fā)與上市，利用我國豐富的水產(chǎn)資源研發(fā)的海洋材料類止血材料也成為研究熱點[13]。而在這些研究評價中，止血功效評價以及抑菌性評價等方面使用了多種模型，如果可以建立較為規(guī)范的可吸收止血材料評價體系，對于規(guī)范臨床使用以及新型材料的開發(fā)具有一定的意義。