Fuchs角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良患者淋巴細(xì)胞永生化細(xì)胞系的建立及驗(yàn)證

高飛，胡澤斌，段然慧，左甜甜，董喆，黃杰

Fuchs 角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良（Fuchs endothelial corneal dystrophy，F(xiàn)ECD）又稱為滴狀角膜，是角膜內(nèi)皮進(jìn)行性的損傷。角膜后彈力層增厚，細(xì)胞外基質(zhì)贅疣沉積，最終發(fā)展成為角膜內(nèi)皮失代償為特征的進(jìn)行性遺傳角膜疾病[1]。在美國(guó)，40 歲以上人口約有 5% 患有此病。在亞洲，大約 70%Fuchs 角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良患者含有TCF4 的重復(fù)序列擴(kuò)增，而且含有 CTG 重復(fù)擴(kuò)增的患者表型更嚴(yán)重。這一擴(kuò)增將使患病風(fēng)險(xiǎn)增加 30 倍以上[2]。CTG 重復(fù)數(shù)目小于或等于 37 為正常，在 37 ～ 52 之間表明與 Fuchs 角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)，超過(guò) 52 為 Fuchs 角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良高風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。以上重復(fù)序列擴(kuò)增所導(dǎo)致的疾病在臨床診斷中面臨著巨大的挑戰(zhàn)，表型相似性高。根據(jù)其臨床癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)等輔助檢查進(jìn)行分型確診面臨非常多的困難，只有通過(guò)基因突變檢測(cè)才可區(qū)分各種突變型別?；蛟\斷是確診和分型的金標(biāo)準(zhǔn)。TCF4 基因 CTG 重復(fù)擴(kuò)增所導(dǎo)致的角膜營(yíng)養(yǎng)不良的發(fā)病進(jìn)程約為 10年以上，而角膜移植是挽救患者視力的唯一有效方法。因此，盡早進(jìn)行基因篩查以明確病因是治療 Fuchs 角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良的有效手段。TCF4 基因突變類型與發(fā)病關(guān)系如圖1 所示。

圖1 TCF4 基因型與發(fā)病關(guān)系[3]

據(jù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道，F(xiàn)ECD 是白內(nèi)障手術(shù)后角膜內(nèi)皮細(xì)胞功能失代償?shù)闹匾騕5]，導(dǎo)致術(shù)后效果不理想。因此在臨床行白內(nèi)障手術(shù)前進(jìn)行基因篩查以排除 FECD 是有必要的。鑒于該類患者的樣本獲得困難且具有研究意義，對(duì) FECD臨床樣本進(jìn)行永生化細(xì)胞系的培養(yǎng)以獲得穩(wěn)定的研究用樣本來(lái)源是至關(guān)重要的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來(lái)源 通過(guò)與中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究中心合作獲取臨床樣本，患者均簽署知情同意書。樣本信息詳見表1。

表1 8 例細(xì)胞株樣本信息

1.1.2 試劑耗材 核酸提取用試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；永生化細(xì)胞系建立所需試劑購(gòu)自美國(guó) Gibco Life Technologies 公司；永生化細(xì)胞系驗(yàn)證所需試劑盒購(gòu)自廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司；NanoDrop one 微量分光光度計(jì)為美國(guó) ThermoFisher 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 EBV 病毒液制備 采用 RPMI1640 + 1 × 雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng) B95-8 細(xì)胞至 100 ml，饑餓細(xì)胞 5 ～ 7 d 后于-80 ℃ 冰箱凍存，反復(fù)凍融 3 次后，2000 r/min 條件下離心 10 min，取離心后的上清液用 0.2 μm 濾膜過(guò)濾并放置于 -80 ℃ 冰箱待用。

1.2.2 分離 Fuchs 角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良患者淋巴細(xì)胞 使用肝素抗凝管采集患者外周靜脈全血 5 ml 并轉(zhuǎn)移至離心管中，分別吸取 2 ml RPMI1640 培養(yǎng)基及 4 ml 淋巴細(xì)胞分離液加入含有外周血的離心管內(nèi)，充分混勻后在2500 r/min 條件下離心 15 min，然后吸取白色的淋巴細(xì)胞層至另一試管中混勻備用。

1.2.3 淋巴細(xì)胞的永生化培養(yǎng)轉(zhuǎn)化 使用 RPMI1640 培養(yǎng)基將分離的淋巴細(xì)胞洗滌 2 次后在 1000 r/min 條件下離心 15 min，棄去上清并加入 EBV 病毒液 1.5 ml 及環(huán)孢菌素 A 0.2 ml，置于 5% 二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)于 37 ℃ 培養(yǎng)24 h 后使用顯微鏡觀察，期間根據(jù)細(xì)胞聚集生長(zhǎng)的狀況進(jìn)行加液或換液，當(dāng)永生化細(xì)胞的生長(zhǎng)數(shù)量達(dá)到 3 × 106個(gè)/ml后，將細(xì)胞吹勻備用。

1.2.4 永生化細(xì)胞系的凍存 細(xì)胞凍存前 24 h，需進(jìn)行細(xì)胞換液；將轉(zhuǎn)化完成的細(xì)胞收集到離心管后，于 1000 r/min離心 10 min，棄去上清；分裝于凍存管中，每管需加入 1 ml凍存液，置于 -70 ℃ 2 h 后，于液氮中長(zhǎng)期保存。

1.2.5 永生化細(xì)胞系的質(zhì)量及穩(wěn)定性觀察 凍存細(xì)胞復(fù)融并傳 6 代后鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境。

1.2.6 永生化細(xì)胞系的分子生物學(xué)驗(yàn)證 將 Fuchs 角膜內(nèi)皮營(yíng)養(yǎng)不良永生化細(xì)胞系取出復(fù)蘇后提取 DNA，再進(jìn)行熒光 PCR-毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 永生化細(xì)胞系的質(zhì)量及穩(wěn)定性控制結(jié)果

8 份細(xì)胞株樣本在復(fù)蘇并培養(yǎng) 7 d 時(shí)，在顯微鏡下可見表面光滑的淋巴細(xì)胞發(fā)生增大和聚團(tuán)，且細(xì)胞周邊有胞質(zhì)突出的現(xiàn)象（圖2）；30 d 及凍融傳代后，顯微鏡下可見淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)為密集的細(xì)胞團(tuán)且外壁有不規(guī)則毛刺狀（圖3、圖4），表明細(xì)胞成功轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞樣永生化細(xì)胞。

圖2 永生化轉(zhuǎn)化第 7 天結(jié)果（40 × 顯微鏡下觀察）

圖3 永生化轉(zhuǎn)化第 30 天結(jié)果（40 × 顯微鏡下觀察）

圖4 復(fù)融并傳 6 代后結(jié)果（40 × 顯微鏡下觀察）

2.2 永生化細(xì)胞系分子生物學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

提取 8 份永生化細(xì)胞株樣本的 DNA，提取的 DNA采用 NanoDrop 核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定OD260/OD280和OD260/OD230值，確定 DNA 的質(zhì)量和濃度；同時(shí)，對(duì)樣本進(jìn)行熒光 PCR-毛細(xì)管電泳法檢驗(yàn)分析，分析結(jié)果顯示全部陽(yáng)性樣本的堿基序列與樣本 CTG 重復(fù)數(shù)一致。檢測(cè)結(jié)果見表2、圖5。

表2 8 份 FECD 樣本永生化驗(yàn)證結(jié)果

圖5 8 份 FECD 樣本的永生化細(xì)胞系熒光 PCR-毛細(xì)管電泳結(jié)果

3 討論

永生化淋巴細(xì)胞系是一類包含人類全基因組用于人類基因研究的重要細(xì)胞資源，也是人類遺傳疾病資源保存與應(yīng)用的技術(shù)手段及首選方法[6]。目前，全球較大規(guī)模的細(xì)胞遺傳資源保藏機(jī)構(gòu)包括美國(guó)國(guó)家人類基因突變細(xì)胞中心、英國(guó)生物樣本庫(kù)和美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院等，上述機(jī)構(gòu)均采用永生化轉(zhuǎn)化技術(shù)作為最主要的遺傳資源保存方法[7]。永生化細(xì)胞系具備一些明顯的優(yōu)勢(shì)：轉(zhuǎn)化所需樣本量少、轉(zhuǎn)化所需實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化方法規(guī)范易操作；更為重要的是采用取之不盡的人類細(xì)胞資源用于遺傳性疾病研究的這一方式具有一定的創(chuàng)新性和實(shí)用性。

研究采集的樣本是經(jīng)肝素鈉抗凝的 FECD 各突變型別的人外周血；經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)明確了低密度接種法，即采用轉(zhuǎn)化細(xì)胞的密度為 1 × 105個(gè)/ml，該密度可以減少 T、B 細(xì)胞的接觸，從而增加細(xì)胞轉(zhuǎn)化的成功率，具有一定的創(chuàng)新性；同時(shí)，通過(guò)加入環(huán)孢菌素 A 進(jìn)一步抑制 T 細(xì)胞活性，最終成功建立了包含 FECD 各突變類型的永生化細(xì)胞系并完成了永生化細(xì)胞的傳代、凍存及復(fù)蘇。同時(shí)對(duì)建系成功的永生化細(xì)胞抽提 DNA 后進(jìn)行了可準(zhǔn)確讀取 CTG 重復(fù)數(shù)的熒光 PCR-毛細(xì)管電泳法驗(yàn)證，并進(jìn)行細(xì)胞顯微鏡下觀察，結(jié)果表明永生化狀態(tài)下的TCF4 基因組 DNA 的遺傳穩(wěn)定，可作為穩(wěn)定的研究用樣本資源為相關(guān)科研機(jī)構(gòu)的參考物質(zhì)研制及后續(xù)的 FECD 臨床檢驗(yàn)與疾病篩查奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。