銅綠假單胞菌核酸檢測(cè)用試劑盒國(guó)家參考品的研究

梁麗，陳馳，石繼春，王春娥，龍新星，劉茹鳳，黃洋，李康，徐瀟，李江姣，徐穎華，葉強(qiáng)

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）為假單胞菌屬的一種革蘭氏陰性菌，也被稱為綠膿桿菌。在自然界水、土壤與空氣中均廣泛存在[1]。銅綠假單胞菌污染常見(jiàn)于涼拌菜、熟肉制品、飲用水等食品領(lǐng)域。例如在水源水或成品水中檢出銅綠假單胞菌，甚至多批次樣品的檢出率大于 10%，為一種重要的水源和食源性致病菌[2-4]。因此在我國(guó)飲用天然礦泉水（GB 8537-2016）[5]和包裝飲用水（GB 19298-2014）[6]的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中均明確規(guī)定不得檢出銅綠假單胞菌。此外，在 2015年我國(guó)頒布的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》也要求化妝品中不得有銅綠假單胞菌檢出[7]。銅綠假單胞菌作為醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一，在機(jī)體免疫力低下時(shí)，例如術(shù)后和惡性腫瘤的患者容易感染本菌，且銅綠假單胞菌的耐藥性強(qiáng)，在治療時(shí)往往需要使用多種抗生素進(jìn)行聯(lián)合用藥[8-9]。因此，快速而準(zhǔn)確地鑒定出銅綠假單胞菌對(duì)保障食品安全和人民健康具有重要的意義。

盡管銅綠假單胞菌為食品、化妝品等微生物常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目之一，但所推薦的檢測(cè)方法為傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法[6]。作為細(xì)菌檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”的細(xì)菌培養(yǎng)法，其準(zhǔn)確度高，但耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度較低。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展以及銅綠假單胞菌的全基因信息解析[10]，各種分子生物學(xué)技術(shù)，包括單一 PCR、多重 PCR、定量 PCR 技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等，憑借強(qiáng)特異性、高靈敏度、簡(jiǎn)便省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在銅綠假單胞菌的檢測(cè)和研究中[2,11-13]。但至今尚無(wú)銅綠假單胞菌相關(guān)國(guó)家參考品，導(dǎo)致不同企業(yè)的產(chǎn)品缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)衡量，不利于行業(yè)水平的整體提升。本研究研制了銅綠假單胞菌核酸檢測(cè)試劑盒用國(guó)家參考品，以期為未來(lái)相關(guān)定性檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 10 株不同來(lái)源的銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株用于陽(yáng)性參考品的制備（表1）；用于制備陰性參考品的菌株分別為：嗜麥芽窄食假單胞菌 CMCC(B)10701、惡臭假單胞菌 CMCC(B)10716、熒光假單胞菌 CMCC(B)10711、布氏假單胞菌 CMCC(B)10712、摩氏假單胞菌CMCC(B)10713、金黃色葡萄球菌 CMCC(B)26001、肺炎克雷伯菌 CMCC(B)46117、肺炎鏈球菌 CMCC(B)31001、腦膜炎奈瑟菌 CMCC(B)29052、大腸埃希菌 CMCC(B)44113，上述菌株均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院的中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。

表1 本研究所用 10 株銅綠假單胞菌的特性

1.1.2 主要試劑和儀器 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自北京三藥公司科技開(kāi)發(fā)公司；細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；Premix Taq 和 DL2000 均購(gòu)自日本 Takara 公司；銅綠假單胞菌核酸測(cè)定試劑盒分別購(gòu)自北京華大吉比愛(ài)生物技術(shù)有限公司、中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司和江蘇碩世生物科技股份有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

細(xì)菌培養(yǎng)箱為北京中儀國(guó)科科技有限公司產(chǎn)品；熒光定量 PCR 儀為美國(guó) ABI 公司產(chǎn)品；VITEK 全自動(dòng)微生物生化鑒定儀為梅里埃診斷產(chǎn)品有限公司產(chǎn)品；microTyper MS 飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)為江蘇天瑞儀器股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 銅綠假單胞菌參考菌株的培養(yǎng)和鑒定 將 10 株銅綠假單胞菌復(fù)蘇后分別接種至普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基中，觀察菌落形態(tài)，全自動(dòng)微生物生化鑒定儀進(jìn)行生化鑒定。選取瓊脂平板上培養(yǎng)的第 2 代單菌落，進(jìn)行飛行質(zhì)譜鑒定。同時(shí)將上述菌種新鮮過(guò)夜培養(yǎng)物按照試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌全基因組 DNA，以其為模板，參考文獻(xiàn)[14]，使用16S rRNA 基因通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，最后將測(cè)序拼接結(jié)果提交NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 Blast 比對(duì)分析。

1.2.2 候選參考品的制備 將上述 10 株銅綠假單胞菌復(fù)蘇后新鮮培養(yǎng)物制備成菌懸液，經(jīng)加熱滅活并驗(yàn)證滅活合格后，采用無(wú)菌生理鹽水將銅綠假單胞菌的滅活菌液稀釋至5.0 × 106個(gè)/ml，以每管 0.5 ml 定量分裝。同時(shí)，選取銅綠假單胞菌 CMCC(B)10126 滅活菌懸液制備重復(fù)性和最低檢出限候選參考品，菌液濃度稀釋至 5.0 × 106個(gè)/ml，定量分裝每管 0.8 ml。

同時(shí)，將 10 株陰性參考品菌株接種于各自適宜生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上，按上述銅綠假單胞菌相同操作處理，制備滅活菌懸液，最終稀釋至 1.0 × 106～ 1.0 × 107個(gè)/ml，以每管0.5 ml定量分裝，所有候選參考品樣品均保存于 -20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 候選參考品特性分析 為了評(píng)價(jià)候選參考品的均勻性，從上述制備的 150 套候選參考品中隨機(jī)抽取陽(yáng)性（P1 ～P10）、重復(fù)性和最低檢出限候選參考品樣品各 10 支，使用銅綠假單胞菌核酸測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算不同樣品檢測(cè)結(jié)果 Ct 值的變異系數(shù)（CV）。同時(shí)，將長(zhǎng)期放置 -20 ℃ 冰箱保存的陽(yáng)性（P1 ～ P10）和最低檢出限候選參考品取出，反復(fù)凍融 3 次和 5 次，并將候選陽(yáng)性、最低檢出限候選參考品分別放置于 4 ℃、25 ℃、37 ℃ 條件下 3、7、14 d，然后與 -20 ℃ 保存的對(duì)應(yīng)樣品進(jìn)行平行測(cè)定比較分析，系統(tǒng)評(píng)價(jià)候選參考品穩(wěn)定性。

1.2.4 候選參考品驗(yàn)證分析 選用 3 種不同廠家的銅綠假單胞菌試劑盒進(jìn)行候選參考品驗(yàn)證研究，包括對(duì)已稀釋10 倍的陽(yáng)性（P1 ～ P10）和陰性（N1 ～ N10）進(jìn)行檢測(cè)分析，評(píng)價(jià)候選參考品的準(zhǔn)確性和特異性；并對(duì)已稀釋 10 倍的重復(fù)性候選參考品進(jìn)行重復(fù)檢測(cè) 10 次，進(jìn)行 2 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析，評(píng)價(jià)候選參考品的重復(fù)性。同時(shí)，采用無(wú)菌生理鹽水倍比系列稀釋最低檢出限參考品（5.0 × 106個(gè)/ml）成 4 個(gè)稀釋度 1.0 × 105、1.0 × 104、1.0 × 103和 1.0 ×102個(gè)/ml，檢測(cè)分析和評(píng)價(jià)候選參考品的最低檢出限。

1.2.5 候選參考品協(xié)作標(biāo)定 將所有檢測(cè)候選參考品樣品編盲，組織國(guó)內(nèi) 5 家生產(chǎn)銅綠假單胞菌試劑盒企業(yè)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定，按照擬定協(xié)作標(biāo)定方案，要求使用各自生產(chǎn)的試劑盒分別進(jìn)行候選參考品的準(zhǔn)確性、特異性、重復(fù)性和最低檢出限驗(yàn)證分析，并至少進(jìn)行兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，最終將所有原始結(jié)果提交中國(guó)食品藥品檢定研究院作統(tǒng)一分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 22 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)本研究候選參考品的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行 Kruskal-Wallis 非參數(shù)檢驗(yàn)分析，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銅綠假單胞菌參考菌株的鑒定分析結(jié)果

用于制備陽(yáng)性候選參考品的 10 株銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的革蘭氏染色、菌落生長(zhǎng)形態(tài)以及 VITEK 生化鑒定結(jié)果均符合銅綠假單胞菌的特征。質(zhì)譜鑒定結(jié)果均為銅綠假單胞菌，且分值在 2.16 ～ 2.45 之間，表明結(jié)果鑒定可信度和準(zhǔn)確度高。16S rRNA 基因測(cè)序分析顯示 10 株菌株與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的銅綠假單胞菌模式菌株 JCM5962的 16S rRNA 基因序列相似度均大于 97%（表1），進(jìn)一步證實(shí)所用標(biāo)準(zhǔn)菌株均為銅綠假單胞菌。

2.2 候選參考品的特性分析結(jié)果

各種候選參考品菌液經(jīng)加熱滅活處理后，驗(yàn)證分析顯示所有滅活菌液在各自適宜的平板培養(yǎng)基上均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，表明候選參考品菌液滅活合格。候選參考品的均勻性檢測(cè)結(jié)果顯示，陽(yáng)性（P1 ～ P10）、最低檢出限和重復(fù)性候選參考品不同樣品間的 Ct 值基本一致，檢測(cè)結(jié)果 CV 值為 1.35%～ 4.04% 之間（表2），表明本研究制備的候選參考品的分裝均勻度良好。

表2 候選參考品的分裝均勻度分析結(jié)果

此外，候選參考品經(jīng)反復(fù)凍融 3 次和 5 次處理后，以及分別于 4 ℃、25 ℃、37 ℃ 放置 3、7 和 14 d 后，檢測(cè)分析結(jié)果與 -20 ℃ 保存的各候選參考品結(jié)果相比，除陽(yáng)性候選參考品 P3 樣品在 37 ℃ 放置 14 d 未能檢出，其他樣品均能成功檢出，不同溫度樣品 Ct 值的 CV 值在7.98% ～ 13.38% 之間，均小于 15%（圖1），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均無(wú)顯著差異（P＞ 0.05），結(jié)果表明候選參考品具有良好穩(wěn)定性。

圖1 候選參考品的穩(wěn)定性分析結(jié)果（P1 ～ P10分別代表陽(yáng)性候選參考品；L 代表最低檢出限和重復(fù)性候選參考品）

2.3 候選參考品驗(yàn)證分析結(jié)果

3 種不同廠家生產(chǎn)試劑盒檢測(cè)對(duì) P1 ～ P10 陽(yáng)性候選參考品稀釋樣品均顯示為陽(yáng)性，而所有 N1 ～ N10 陰性候選參考品稀釋樣品均顯示為陰性。重復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示 3 種不同廠家生產(chǎn)試劑盒檢測(cè)重復(fù)候選參考品樣本的Ct 值之間的 CV 值分別為 0.94%、4.63% 和 1.34%，均小于 5.0%，表明候選參考品的重復(fù)性良好。此外，最低檢出限驗(yàn)證分析結(jié)果顯示其中 2 家試劑盒的最低檢出限為1.0 × 104個(gè)/ml，而另外一個(gè)試劑盒的最低檢出限為 1.0 ×103個(gè)/ml。

2.4 候選參考品協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

協(xié)作標(biāo)定分析結(jié)果顯示除 E 實(shí)驗(yàn)室未能檢測(cè)出 P8陽(yáng)性候選參考品樣品，其余實(shí)驗(yàn)室對(duì) P1 ～ P10 樣品均檢測(cè)為陽(yáng)性；而所有實(shí)驗(yàn)室陰性候選參考品檢測(cè)結(jié)果均符合要求；重復(fù)性候選參考品檢測(cè)結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) Ct 值的 CV 值均在 5.0% 以內(nèi)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)協(xié)作標(biāo)定實(shí)驗(yàn)室的最低檢出限參考品結(jié)果也不盡相同，例如 A 和 B 實(shí)驗(yàn)室結(jié)果為 1.0 × 105個(gè)/ml，編號(hào) C 和 E 實(shí)驗(yàn)室結(jié)果為1.0 × 104個(gè)/ml，D 實(shí)驗(yàn)室最低檢出限可達(dá) 1.0 × 102個(gè)/ml（表3）。

表3 候選參考品協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特異性靶基因核苷酸序列技術(shù)在多種病原體診斷和檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用具有革命性的時(shí)效性與靈敏度的改變[11]。為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可溯源性，檢測(cè)用相關(guān)國(guó)家參考品的使用就顯得尤為重要[15-16]。為了研制高質(zhì)量的國(guó)家參考品，從中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心保存大量銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株中選取了 10 株不同來(lái)源銅綠假單胞菌作為陽(yáng)性參考品制備菌株，盡管這些菌株在我們實(shí)驗(yàn)室均有完整形態(tài)和生化鑒定記錄，本研究仍進(jìn)行了傳統(tǒng)形態(tài)特征與生化、質(zhì)譜、16S rRNA 基因序列分析以及后續(xù)全基因組測(cè)序方法（結(jié)果未顯示）多種不同原理鑒定分析方法對(duì)這些菌株進(jìn)行驗(yàn)證。在制備陰性參考品菌株的選擇時(shí)，也充分考慮了與銅綠假單胞菌感染部位相同或感染癥狀相似且常見(jiàn)的同一種屬其他病原體，以及其他類似食源性病原體，從而盡可能確保本研究研制的國(guó)家參考品使用陽(yáng)性和陰性參考品菌株具有代表性。

作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的最關(guān)鍵參數(shù)之一，參考品的穩(wěn)定性優(yōu)劣直接影響其質(zhì)量。依據(jù)《中國(guó)藥典》2020 版《生物制品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備和標(biāo)定規(guī)程》要求，在研制國(guó)家參考品時(shí)應(yīng)設(shè)置不同溫度和不同時(shí)間進(jìn)行候選參考物質(zhì)的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)[15]。本研究將各種候選參考品經(jīng)反復(fù)凍融 3 次和5 次后，以及分別于 4 ℃、25 ℃、37 ℃ 放置 3、7 和14 d 后進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)即使在 37 ℃ 放置 14 d的極端溫度條件下，也僅有個(gè)別樣品未能檢出，其他結(jié)果與-20 ℃ 保存的樣品分析結(jié)果無(wú)顯著性差異，這些結(jié)果表明候選參考品的穩(wěn)定性良好。

在國(guó)家參考物質(zhì)研制過(guò)程中，為了保證參考品特性值的準(zhǔn)確性，要求 3 個(gè)實(shí)驗(yàn)室及以上進(jìn)行參考品協(xié)作驗(yàn)證研究[17]。本研究組織國(guó)內(nèi) 5 家生產(chǎn)銅綠假單胞菌核酸測(cè)定試劑盒廠家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行候選參考品的協(xié)作標(biāo)定研究，發(fā)現(xiàn)除廠家 5 的產(chǎn)品不能成功檢出 P8 陽(yáng)性參考品樣品，其他陽(yáng)性和陰性候選參考品檢測(cè)分析均符合規(guī)定要求。事實(shí)上，本研究前期候選參考品特性分析時(shí)，也使用了該廠家的銅綠假單胞菌核酸測(cè)定試劑盒產(chǎn)品，多次實(shí)驗(yàn)均能成功檢測(cè) P8 樣品。推測(cè)這種不一致的結(jié)果可能與協(xié)作標(biāo)定研究的實(shí)驗(yàn)操作相關(guān)。同時(shí)，也提示在以后使用參考品進(jìn)行質(zhì)量控制時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照推薦使用條件進(jìn)行操作使用。此外，協(xié)作標(biāo)定研究也表明不同試劑盒的最低檢出量參考品略有不同，可能與各自試劑盒檢測(cè)靈敏度相關(guān)。但總體遠(yuǎn)低于實(shí)際應(yīng)用中陽(yáng)性樣品存在的菌體數(shù)量，均滿足檢測(cè)需求。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)室成功建立了銅綠假單胞菌核酸檢測(cè)國(guó)家參考品（參考品文號(hào)：210023-201901），該參考品具有良好的均勻性和穩(wěn)定性，能夠用于銅綠假單胞菌核酸檢測(cè)相關(guān)質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)。