針刺治療腦出血氧化應(yīng)激機制研究進展

董珊珊,孔 瑩,鄒 偉

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

腦出血(Intracerebral hemorrhage ，ICH)是神經(jīng)科學領(lǐng)域常見的危重疾病之一。據(jù)《2016年全球疾病負擔研究》《中國中風》部分報告， ICH已是全球死亡率最高的中風亞型，我國的ICH發(fā)病率高于其他高收入國家[1-3]。然而，目前臨床上有關(guān)ICH的治療選擇十分稀缺[4]。氧化應(yīng)激(Oxidative Stress，OS)是自由基產(chǎn)生與清除失衡導(dǎo)致的一種氧化過渡狀態(tài)?，F(xiàn)代醫(yī)學研究認為自由基爆發(fā)是惡化ICH繼發(fā)性腦損傷的關(guān)鍵病理因素[5]。近年來有關(guān)針刺治療ICH氧化應(yīng)激的研究取得一定進展。鄒偉教授實驗團隊的前期研究證實，針刺參與調(diào)控與OS相關(guān)的通路蛋白表達，有效地改善ICH腦組織氧化損傷[6]。但關(guān)于針刺治療ICH氧化應(yīng)激的確切機制目前尚無定論。因此，本研究試從ICH后自由基來源進行分析與探究，對針刺治療ICH氧化應(yīng)激作用機理加以闡述。

1 ICH與自由基-氧化應(yīng)激

大腦是OS的敏感部位。大腦的高耗氧和腦部神經(jīng)元細胞膜富含多不飽和脂肪酸,使得腦組織更易于自由基產(chǎn)生。然而生理狀態(tài)下，腦內(nèi)含有天然的抗氧化酶系統(tǒng)調(diào)控自由基水平，使自由基的產(chǎn)生與降解之間存在著微妙的平衡。ICH發(fā)生后血液成分的泄漏使得腦部抗氧化系統(tǒng)迅速被自由基所淹沒，發(fā)生OS。研究表明，ICH后氧化產(chǎn)物(如MDA、8-OHDG)的水平升高，而抗氧化酶(如SOD、GSH-Px及CAT)活性則會降低，OS誘導(dǎo)的腦損傷主要是通過自由基(主要是ROS)直接引起細胞生物大分子氧化和激活細胞死亡通路，導(dǎo)致長期的神經(jīng)功能缺陷[5]。動物研究已經(jīng)證實抗氧化劑(NSP-116)通過有效抑制自由基生成，改善ICH大鼠的神經(jīng)功能缺損[8]?？梢?，自由基劑量是決定OS的關(guān)鍵參數(shù)，而OS與ICH的整體預(yù)后高度相關(guān)。

2 ICH后的自由基來源

2.1 炎性細胞活化

神經(jīng)炎癥與OS是互為依賴的兩個表型。神經(jīng)炎癥的成分主要包括小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞和T淋巴細胞[9]。ICH后炎性細胞活化不僅伴有炎性因子(如IL-1β和TNF-α)釋放，也會產(chǎn)生大量的自由基導(dǎo)致腦損傷。

小膠質(zhì)細胞是參與ICH病理過程最早和最主要的炎癥細胞。其通過激活和形成M1(促炎)或M2(抗炎)表型對急性腦損傷做出應(yīng)答。在ICH發(fā)作的7 d內(nèi)，小膠質(zhì)細胞的M1表型向M2表型轉(zhuǎn)化[9]，而表型間的轉(zhuǎn)移不平衡會產(chǎn)生大量ROS。細胞實驗表明，小膠質(zhì)細胞可以在體外誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生[10]。此外，在ICH大鼠模型中，抑制小膠質(zhì)細胞和星型膠質(zhì)細胞活化可減少促炎性細胞因子IL-1β和TNF-α的釋放，降低ROS的產(chǎn)生和腦損傷量[11]。ICH后，小膠質(zhì)細胞中的NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3(NLRP3)炎癥小體激活，引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)[12]。采用apelin-13抑制小膠質(zhì)細胞的活化，可以降低腦組織NLRP3和ROS的產(chǎn)生[13]。Hu L等[14]的細胞和動物實驗發(fā)現(xiàn)通過miR-152的過度表達，可以阻斷硫氧還蛋白相互作用蛋白(TXNIP)介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活，減少了ROS產(chǎn)生。此外，NLRP3炎性小體通過促進中性粒細胞浸潤來放大ICH后的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致呼吸鏈爆發(fā)，抑制NLRP3炎癥小體可以有效降低中性粒細胞浸潤、緩解氧化損傷[12]，中性粒細胞是治療ICH的新興靶點。

2.2 線粒體功能障礙

線粒體是氧和ROS的樞紐，ICH病理條件下，受損線粒體累積是毒性ROS的主要來源。這種損傷主要是由于線粒體的過度分裂打破線粒體穩(wěn)態(tài)，最終造成線粒體功能障礙。線粒體功能障礙主要通過損害三磷酸腺苷(ATP)合成和誘導(dǎo)ROS生成過量加重繼發(fā)性腦損傷[15]。因此，參與線粒體融合-分裂動態(tài)平衡的調(diào)控因子(如UCP2、NRF-1及TFAM)可能與自由基的產(chǎn)生密切相關(guān)。原代神經(jīng)元研究表明，線粒體斷裂和膜電位喪失會導(dǎo)致ROS累積[16]。Kadlec AO等[17]發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)線粒體功能的主要轉(zhuǎn)錄共激活因子過氧化物酶體增殖激活受體共激活因子-1α(PGC-1α)缺乏會導(dǎo)致線粒體功能障礙發(fā)生OS。ICH后PGC-1α的表達抑制會顯著降低腦組織ATP濃度，抑制線粒體的生成數(shù)量和功能，下調(diào)SOD2酶水平，增加腦含水量和線粒體髓鞘層結(jié)構(gòu)的形成[18]。相反，誘導(dǎo)PGC-1α激活則會促進線粒體功能恢復(fù)，減少腦組織細胞內(nèi)ROS和線粒體ROS產(chǎn)生[19]。說明ICH后PGC-1α參與線粒體途徑的OS調(diào)節(jié)，PGC-1α對OS具有正向調(diào)控作用。

此外，線粒體自噬能夠調(diào)控線粒體穩(wěn)態(tài)、促進線粒體更新以及限制ROS過量累積。激活Pink1/-Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬能夠減少高血壓腦出血大鼠模型中功能失調(diào)的線粒體產(chǎn)生，減少腦組織梗死體積[20]。其次，一些抗氧化劑通過參與線粒體穩(wěn)態(tài)間接抑制ROS產(chǎn)生。ICH后，上調(diào)谷胱甘肽(GSH)水平能夠促進線粒體氧化呼吸功能恢復(fù)，減輕急性腦損傷[21]。DJ-1是一種具有活性氧清除和酶活性調(diào)節(jié)等多效功能蛋白，應(yīng)激條件下，DJ-1單體化從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至線粒體保護細胞免受氧化損傷[22]。ICH后，激活DJ-1/Akt/IKK/NFκB通路可以有效抑制線粒體介導(dǎo)的OS[23]?？梢?，線粒體功能障礙是自由基生成的重要來源。

2.3 鐵離子超載

鐵參與有氧呼吸的電子傳遞鏈以及血紅蛋白中的氧氣傳輸，鐵的穩(wěn)態(tài)對于大腦功能運行至關(guān)重要。由于鐵離子具有毒性作用，生理狀態(tài)下腦組織內(nèi)幾乎不存在游離的鐵離子(Fe3+)或亞鐵離子(Fe2+)。ICH發(fā)生后，腦組織神經(jīng)元內(nèi)的鐵離子主要由血液成分中的血紅蛋白衍生。過量的游離鐵釋放通過Fenton和Haber-Weiss反應(yīng)，生成超氧陰離子和高活性羥基自由基，導(dǎo)致腦鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào)促進OS[24]。Garton T等[25]指出Fenton反應(yīng)中亞鐵與過氧化氫的相互作用生成氧化活性分子，即：Fe2++H2O2Fe3++OH·+OH-，生成的Fe3+又可以通過各種還原劑還原為Fe2+，造成自由基生成反應(yīng)的惡性循環(huán)。

ICH后鐵離子超載引起氧化損傷的途徑復(fù)雜多樣，一方面，神經(jīng)細胞內(nèi)鐵離子的過度積累會觸發(fā)鐵死亡，而鐵死亡通過抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)介導(dǎo)ROS的累積[26]。另一方面，鐵死亡通過加重神經(jīng)炎癥和線粒體功能障礙惡化自由基生成。使用鐵死亡抑制劑去鐵胺(DFX)可以顯著減少ICH小鼠模型血腫區(qū)ROS的產(chǎn)生以及小膠質(zhì)細胞和中性粒細胞的炎性浸潤[27]。Chen B等[28]發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)和體外ICH模型中，鐵死亡相關(guān)基因PTGS2的表達水平均升高，而RPL8僅在人腦組織中升高，小鼠ICH 3 h后鐵和MDA水平顯著升高，線粒體體積縮小。

3 針刺對ICH氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用

3.1 針刺激活內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)

內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)等?？寡趸富钚缘母叩椭苯佑绊憴C體的抗氧化能力強弱。大部分研究發(fā)現(xiàn)，針刺能夠升高內(nèi)源性抗氧化酶活性，如SOD、CAT及GSH-Px，來對抗過氧化影響[29]。針刺能夠促進病理狀態(tài)下腦組織SOD、CAT及GSH-Px等抗氧化酶釋放，通過增強腦組織的抗氧化能力，改善自由基代謝，抑制OS，這一點在諸多研究中均有證實，如高血壓大鼠延髓區(qū)[30]、血管性認知障礙大鼠大腦皮層區(qū)[31]以及腦缺血再灌注大鼠腦組織半暗帶區(qū)[32]。

機體內(nèi)，SOD能催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)產(chǎn)生H2O2和O2。據(jù)報道，音樂電針患肢曲池、合谷、髀關(guān)及后三里穴能夠提高ICH模型大鼠SOD活力,促進神經(jīng)功能缺損恢復(fù)[33]。Liu等[34]發(fā)現(xiàn)，與單純西藥治療相比，逐瘀通腑系列方藥加針刺治療可以顯著降低高血壓腦出血患者血漿LPO、血細胞比容和全血粘度含量，升高SOD、GSH-Px活性。羅松等[35]在針刺治療ICH的機理研究中發(fā)現(xiàn)，在ICH急性期，針刺水溝、風府、曲澤、內(nèi)關(guān)、三陰交、血海和太溪穴位能顯著增強動脈粥樣硬化兔腦出血模型的腦SOD活性。此外，針刺可顯著抑制ICH大鼠模型磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(p-STAT3)蛋白表達，并減少神經(jīng)功能缺損[36]，這可能與轉(zhuǎn)錄因子STAT3調(diào)節(jié)的MnSOD激活相關(guān)[37]。因此，激活內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)是針刺治療ICH的機理之一。

3.2 針刺抑制自由基的過量生成

針刺療法通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)自由基-氧化應(yīng)激系統(tǒng)，增強神經(jīng)系統(tǒng)抗氧化能力[38]。OS病理過程中存在著復(fù)雜的信號通路網(wǎng)絡(luò)，因此引起自由基產(chǎn)生的潛在途徑可能與針刺的抗氧化機制密切相關(guān)。

腦保護因子腦紅蛋白(NGB)是一種運輸與儲存氧的球蛋白，可以維持出血損傷的線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)完整及其有氧氧化功能。韓佳煒等[39]發(fā)現(xiàn)，ICH后腦組織NGB的表達呈內(nèi)源性升高，但不足以抵抗氧化損傷，針刺“人中”“內(nèi)關(guān)”能使ICH后腦組織中NGB表達進一步升高，通過保護受損神經(jīng)元線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整，對抗OS及神經(jīng)元凋亡。ICH的線粒體功能障礙發(fā)生后，線粒體氧化呼吸鏈末端的關(guān)鍵限速蛋白細胞色素C(Cyt C)從線粒體釋放致使氧化呼吸鏈中斷，ROS生成增多。韓佳煒等[40]通過針刺“人中”“內(nèi)關(guān)”改善線粒體的損傷程度，抑制ICH后Cyt C的釋放，減少神經(jīng)元凋亡。針刺還可以顯著抑制ICH后NLRP3激活引起的炎性細胞浸潤[41]。此外，在針刺抗ICH氧化應(yīng)激損傷的研究中也發(fā)現(xiàn)了針刺可以有效減少ICH后炎性細胞浸潤[6]，說明針刺對ICH大鼠的抗氧化作用機制也參與抑制炎性細胞浸潤，從而下調(diào)自由基產(chǎn)生水平。核因子E2-相關(guān)因子2(Nrf2)是氧化還原主要的敏感轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2受Keap1的負調(diào)控，ICH后ROS的過量產(chǎn)生刺激Nrf2從Keap1解偶聯(lián)并重定位至細胞核，然后激活介導(dǎo)細胞存活的抗氧化反應(yīng)元件(ARE)依賴性細胞保護基因。頭針“百會”透“曲鬢”通過激活Nrf2-ARE通路誘導(dǎo)下游血紅素氧合酶-1(HO-1)、醌氧化還原酶1(NQO1)的表達,從而減緩ICH氧化應(yīng)激損傷[6]。Nrf2通路激活是緩解ICH氧化應(yīng)激的有望靶標。

3.3 針刺保護細胞大分子免受氧化損傷

針刺可以保護細胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA免受氧化損傷。通過對丙二醛(MDA)、過氧化脂(LPO)、單氨氧化酶 (MAO)和脂褐質(zhì) (LF)等氧化指標的研究，發(fā)現(xiàn)針刺具有減少脂質(zhì)氧化損傷的有益作用[29]。LPO是一種過氧化脂質(zhì)，正常情況下低濃度存在，脂質(zhì)的過氧化損傷會致使LPO升高。針刺治療ICH在穩(wěn)定地增強腦出血兔抗自由基酶活性的同時，降低LPO含量[35]。MDA是脂質(zhì)氧化損傷的終產(chǎn)物，具有細胞毒性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合。研究發(fā)現(xiàn)，音樂電針選穴患肢曲池、合谷、髀關(guān)及后三里治療ICH能顯著降低腦組織及血清MDA[33]。HO-1參與血紅素的代謝以及機體內(nèi)抗炎和抗氧化過程，黃俊濤[42]發(fā)現(xiàn)電針內(nèi)關(guān)(雙側(cè))、三陰交(雙側(cè))及水溝穴治療ICH通過提高腦內(nèi)HO-1和HO-2含量減輕OS反應(yīng)，但ICH急性期應(yīng)慎重選擇電針治療。此外，8-羥基脫氧鳥苷酸(8-OHDG)是DNA氧化損傷的突變標志物，ICH患者的白細胞8-OHDG水平顯著高于健康人群[43]，針刺療法具有降低腦組織8-OHDG的作用[44]，但關(guān)于ICH的研究有待進一步驗證。

4 討論

腦出血在中醫(yī)理論中屬于“中風”范疇。其基本病機為氣血逆亂，上犯于腦，血溢腦絡(luò)導(dǎo)致腦絡(luò)阻痹、神明不調(diào)。針刺治療中風病在我國最早記載于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，而后東晉時期葛洪的《肘后備急方》也曾強烈推薦針刺作為中風急性期的急救方法。針刺具有調(diào)神通絡(luò)、醒腦開竅等功效，通過針刺特定穴位對ICH患者的神經(jīng)功能缺損有改善作用[45]。

現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)針刺在減少OS、促進ICH神經(jīng)功能恢復(fù)方面具有顯著療效。本研究通過對現(xiàn)存文獻的分析得到針刺的抗氧化作用是多方面、多機制的共同作用結(jié)果：其一，針刺既能阻斷ICH的自由基來源，又能中和已生成的過量自由基；其二，針刺通過抑制炎性細胞活化、改善線粒體呼吸功能和減少鐵離子超載多種途徑阻斷自由基產(chǎn)生；其三，針刺能增強內(nèi)源性抗氧化酶(如SOD、CAT及GSH-Px)活性來中和已生成的自由基，防御OS；其四，針刺能夠直接減少細胞大分子(如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA)的氧化損傷；其五，針刺能夠調(diào)節(jié)與ROS產(chǎn)生或消除相關(guān)的信號通路，抑制自由基過量生成，如Cyt C和Nrf2通路。

盡管針刺相對于單一靶點治療ICH具有顯著優(yōu)越性，但目前有關(guān)針刺抗氧化作用的主要原因還未確定。此外，針刺是一種復(fù)雜的治療方法，當前針刺研究中存在諸多變量，不同針刺參數(shù)(針刺時間、針刺類型和穴位選擇等)的抗氧化能力以及針刺改善ICH氧化應(yīng)激更多的調(diào)控通路機制都有待探究闡明。同時應(yīng)該加入更多的臨床數(shù)據(jù)來增加針刺對抗ICH氧化應(yīng)激的理論支持，將能為今后的臨床針刺治療ICH氧化應(yīng)激提供更多依據(jù)和針刺參數(shù)方案選擇，以幫助更多ICH患者提高生活質(zhì)量。