電針對退變腰椎間盤兔模型M-ENK、β-內(nèi)啡肽、Netrin-1表達的影響及相關(guān)性研究

劉逸陽，鄒 璟，黃國付

(1.湖北中醫(yī)藥大學，湖北 武漢 430065；2.武漢市武昌醫(yī)院，湖北 武漢 430063；3.武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，湖北 武漢 430022)

慢性腰痛是臨床常見病及多發(fā)病，是全球范圍內(nèi)最常見的致殘疾病之一[1]，已經(jīng)成為了一個全球性的公共衛(wèi)生問題。椎間盤退變是導致慢性腰痛的主要病因[2],健康的椎間盤是一種無神經(jīng)血管的結(jié)構(gòu)，椎間盤發(fā)生退變時，攜帶傷害性信息的神經(jīng)纖維向椎間盤的內(nèi)部生長，這可能是產(chǎn)生疼痛的原因[3]，這種因椎間盤本身退變造成的慢性腰痛稱為盤源性疼痛。軸突導向因子在神經(jīng)纖維內(nèi)向生長中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，它能夠調(diào)節(jié)軸突的再生，同時發(fā)揮排斥和吸引雙重信號作用，引導軸突到達正確的靶點[4]。在成人神經(jīng)系統(tǒng)中主要有4類軸突導向家族表達，參與神經(jīng)的再生和修復，分別是Netrins、Slits、Ephrins和Semaphorins，其中Netrin-1是Netrins家族中第一個被發(fā)現(xiàn)的具有雙功能軸突導向信號的分泌型蛋白質(zhì)[5]，可以通過與不同受體結(jié)合發(fā)揮吸引/排斥作用，促進/抑制神經(jīng)纖維的長芽和延伸。

當前臨床用以改善盤源性疼痛的方法以外科侵入式療法和藥物治療為主，但外科侵入式療法創(chuàng)傷大、費用高，其長期安全性和有效性還需要進一步的研究證據(jù)支撐[6]，而常見的用以治療慢性腰痛的藥物(如非甾體抗炎藥和阿片類藥物等)，雖然可以在一定程度上改善癥狀和延緩病情進展，但收益較為有限，長期服用存在較高的安全隱患和不良反應(yīng)[6]。一系列的臨床隨機對照試驗肯定了針灸療法對椎間盤退變疾病的療效[7-9]，同時基礎(chǔ)研究也表明電針可以延緩椎間盤退變，促進脊髓中甲硫腦啡肽(M-ENK)和β-內(nèi)啡肽(β-EP)的釋放發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[10-13]。在前期課題組研究發(fā)現(xiàn)，電針能夠上調(diào)背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中Netrin-1的表達來抑制退變椎間盤神經(jīng)纖維內(nèi)向生長。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上進一步研究電針對脊髓背角中M-ENK、β-EP表達的影響及其與Netrin-1之間的相關(guān)性，探討電針對改善慢性盤源性疼痛的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新西蘭大白兔20只，5～6月齡，體質(zhì)量3.0～4.0 kg，由武漢萬千佳興生物科技有限公司提供(動物合格證編號：No42000300005522)，于湖北中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗房分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：12 h明暗交替，溫度20～25℃，相對濕度(50±10)%，規(guī)律飲食。在本研究中，對動物的處置遵循中華人民共和國科學技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》。實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)3周后，根據(jù)隨機數(shù)字表法將實驗兔隨機分為以下5組：正常組、模型組、假模型組、電針組和假電針組。

1.2 實驗儀器與試劑

1.2.1 實驗儀器 椎間盤施壓器(東風制造廠)；電鉆(上海銳奇)；針灸針(華佗牌)；韓式穴位神經(jīng)刺激儀(南京濟生有限公司)；電泳槽(北京六一儀器廠)；電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠)；DG-3022A酶標儀(賽默飛世爾科技公司)；水平搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.2.2 實驗試劑 RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)；TBST(國藥集團化學試劑有限公司)；蛋白Marker(海利克思公司)；PVDF膜(Millipore公司)；兔多抗GAPDH(杭州賢至生物有限公司)；HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；ECL底物液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；X光膠片(銳珂(廈門)醫(yī)療器材有限公司)；顯影定影試劑盒(天津市漢中攝影材料廠)。

1.3 動物造模方法與分組

所有實驗兔適應(yīng)性飼養(yǎng)3周后隨機選取4只作為正常組，不予處理，正常飼養(yǎng)4周；其余實驗兔參考Kroeber M[14]、黃國付等[11]的椎間盤退變造模方法進行造模，固定器固定實驗兔，根據(jù)體質(zhì)量配制10%水合氯醛(1 mL/kg)沿耳緣靜脈注射麻醉,麻醉成功后俯臥位固定實驗兔，背部進行備皮，在實驗兔的L4、L5椎旁附近做直切口，止血鉗鈍性分離椎旁各肌肉組織，暴露椎體結(jié)構(gòu)后，將直徑約1.5 mm的克氏針分別從L4、L5兩椎體中間鉆入，待克氏針穿出對側(cè)皮膚后縫合切口。在克氏針的兩端安裝垂直的連接桿并在連接桿之間安裝彈簧裝置。見圖1～2。隨機取出4只實驗兔作為假模型組，不予軸向機械壓力；對剩余實驗兔的椎間盤施加軸向壓力200 N，共持續(xù)4周。術(shù)后給予4×106單位青霉素肌肉注射常規(guī)抗感染治療，1次/d，共治療7 d。造模周期結(jié)束后拆除機械加壓裝置及克氏針，對實驗兔的椎間盤進行MRI平掃，評估造模結(jié)果。最終造模成功的12只實驗兔隨機分為模型組、電針組及假電針組，每組各4只。

圖1 椎體加壓前模型兔

圖2 椎體加壓后模型兔

1.4 干預方法

電針組使用固定器固定模型兔后，取L4、L5雙側(cè)夾脊穴，腧穴定位參考《實驗針灸學》[15]。使用1寸(0.30 mm×25 mm)一次性針灸針直刺夾脊穴約12～20 mm，捻轉(zhuǎn)進針至出現(xiàn)針下沉澀感后，連接韓式電針治療儀，同側(cè)L4、L5夾脊穴連接同一輸出電極，對側(cè)夾脊穴連接另一輸出電極，疏密波，頻率2/15 Hz,強度1～2 mA，20 min/次， 1次/d，每周6次，連續(xù)6次為一療程，共治療4個療程。見圖3。假電針組取L4、L5雙側(cè)夾脊穴處針刺，并夾持電極，不予通電，余處理同電針組。

圖3 模型兔電針治療圖

1.5 觀察指標與檢測方法

Western blot檢測Netrin-1、M-ENK及β-內(nèi)啡肽蛋白含量：干預結(jié)束后處死各組實驗兔，取出實驗兔L2背根神經(jīng)節(jié)及脊髓背角組織，分裝后存于-70 ℃冰箱備用。取出少量樣本，提取組織中的蛋白，加200 μLRIPA裂解液裂勻漿，制備蛋白樣品，測定蛋白樣品濃度。將制備好的蛋白樣品和蛋白MAKER加入電泳液中進行電泳分離，取出目的條帶及凝膠，浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中，在轉(zhuǎn)模槽中將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用含5 %脫脂奶粉的TBST(封閉液)封閉PVDF膜，并將PVDF膜浸泡于稀釋(稀釋比例為1∶1 000)后的一抗(GAPDH)孵育液過夜后,使用TBST充分洗滌后，浸泡于稀釋(稀釋比例為1∶5 000)的二抗(HRP)孵育液中，室溫搖床孵育2 h。使用TBST洗去多余的二抗后，將混合好的ECL顯影液滴加于PVDF膜上，使用X光膠片進行顯影，定影處理。沖洗、晾干和掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 退變腰椎間盤造模成功的標志

正常組椎間盤MRI呈均勻明亮的高信號，且椎間盤間信號比較差異無統(tǒng)計學意義。見圖4。模型組退變椎間盤MRI呈不同程度的黑色低信號影，與正常椎間盤相比，信號差異比較有統(tǒng)計學意義。見圖5。提示椎間盤退變造模成功。

圖4 正常組椎間盤MRI

圖5 模型組椎間盤MRI

2.2 各組實驗兔DRG中Netrin-1蛋白表達比較

如表1所示，與正常組比較，假模型組DRG中Netrin-1的表達未見明顯變化(P>0.05)，而模型組退變椎間盤相應(yīng)DRG中Netrin-1蛋白表達明顯下降(P<0.05);與模型組比較，電針組DRG中Netrin-1蛋白表達明顯升高(P<0.05);與電針組比較，假電針組DRG中Netrin-1蛋白明顯降低(P<0.05)。見圖6。

表1 各組實驗兔DRG中的Netrin-1蛋白相對表達量

圖6 各組實驗兔DRG中的Netrin-1蛋白相對表達量western blot檢測比較

2.3 各組實驗兔脊髓背角M-ENK、β-內(nèi)啡肽蛋白相對表達量

如表2所示，與正常組比較，假模型組脊髓背角中M-ENK、β-EP蛋白表達未見明顯變化(P>0.05)，而模型組脊髓背角中M-ENK、β-EP蛋白表達明顯增加(P<0.05);與模型組比較，電針組脊髓背角中M-ENK、β-EP蛋白表達明顯增加(P<0.05);與電針組比較，假電針組脊髓背角中M-ENK、β-EP蛋白表達明顯減少(P<0.05)。見圖7。

表2 各組脊髓背角中M-ENK、β-內(nèi)啡肽蛋白相對表達量

2.4 Netrin-1與M-ENK、β-內(nèi)啡肽蛋白表達的相關(guān)性

采用直線相關(guān)分析法分析正常組、模型組與電針組中Netrin-1、M-ENK和β-EP蛋白含量之間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Netrin-1蛋白含量與脊髓背角M-ENK、β-EP之間均存在正相關(guān)性(R2=0.66、R2=0.51)。見圖8～9。

圖8 Netrin-1與M-ENK蛋白表達的相關(guān)性

圖9 Netrin-1與β-EP蛋白表達的相關(guān)性

3 討論

椎間盤作為脊柱運動的基本單元，承載著來自不同方向、不同程度的壓力負荷，是脊柱中最易發(fā)生病變的結(jié)構(gòu)[16]。健康椎間盤的髓核、纖維環(huán)深層以及軟骨終板中無血管和神經(jīng)纖維的分布，只在纖維環(huán)外1/3分布有來自背根神經(jīng)節(jié)投射的神經(jīng)纖維[17-18]，但椎間盤的神經(jīng)支配并不一定與脊神經(jīng)節(jié)段相一致，神經(jīng)示蹤法發(fā)現(xiàn)下位節(jié)段腰椎間盤由L2背根神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)元支配[19]。椎間盤退變時，神經(jīng)纖維能夠沿著裂縫向纖維環(huán)深層及髓核生長[3]，遭受退變椎間盤釋放的化學炎癥介質(zhì)刺激或者椎間盤因生物力學失衡產(chǎn)生的機械刺激，這可能是導致盤源性腰痛的病理機制。

神經(jīng)纖維向內(nèi)生長過程中，軸突導向因子發(fā)揮著重要的作用，其能夠調(diào)節(jié)軸突的再生，引導再生的軸突到達正確的靶點建立功能性神經(jīng)回路[4]。Netrin-1作為雙功能軸突導向因子，與不同受體結(jié)合能夠促進/抑制感覺神經(jīng)纖維的長芽和延伸。與結(jié)直腸癌(DCC)受體結(jié)合介導吸引軸突，與不協(xié)調(diào)受體(UNC5)結(jié)合介導排斥軸突。誘導Netrin-1發(fā)揮吸引/排斥作用主要依賴于細胞膜Ca2+通道以及胞漿內(nèi)Ca2+釋放來完成的[20]。當細胞膜上Ca2+通道的開放，胞漿內(nèi)Ca2+內(nèi)流，誘導Netrin-1發(fā)揮吸引作用，反之，則誘導Netrin-1發(fā)揮排斥作用。此外，離體實驗發(fā)現(xiàn)外源性的Netrin-1能夠降低環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量,抑制蛋白激酶A(PKA)信號傳導通路，抑制Ca2+通道的開放，降低細胞內(nèi)Ca2+水平，抑制成年大鼠DRG神經(jīng)元突起的生長[21]。

疼痛是外周感受器接受化學或機械刺激后將信號傳遞至初級感覺神經(jīng)元DRG，DRG接受刺激后產(chǎn)生動作電位，Ca2+通道的開放，促進Ca2+內(nèi)流，同時攜帶傷害性遞質(zhì)以胞吐形式釋放到突觸間隙，并將興奮傳遞至下一個神經(jīng)元[22]。傷害性信息在DRG及脊髓背角完成轉(zhuǎn)化和調(diào)制后傳遞至中樞產(chǎn)生痛覺。M-ENK、β-內(nèi)啡肽屬于內(nèi)源性阿片肽，廣泛分布于大腦、脊髓、外周感覺神經(jīng)元及免疫細胞中[23]，作用于痛覺傳導通路以達到鎮(zhèn)痛的效果。內(nèi)源性阿片肽與受體結(jié)合后，能夠減少cAMP合成，抑制PKA信號傳導通路，抑制Ca2+通道的開放，抑制Ca2+內(nèi)流，降低細胞興奮性[24-25]，抑制疼痛信息的傳遞。

電針能夠作用于痛覺神經(jīng)傳導通路，通過抑制疼痛遞質(zhì)的釋放來減少傷害性神經(jīng)元的活動，進而緩解神經(jīng)性疼痛[26]。同時，在CFA(完全弗氏佐劑)誘導的炎性疼痛大鼠模型的研究中，發(fā)現(xiàn)電針能夠誘導淋巴細胞、單核細胞等免疫細胞釋放內(nèi)源性阿片肽物質(zhì)進入炎癥部位，來抑制神經(jīng)末梢痛覺信號的傳遞[27]。另外，電針夾脊穴能夠改善局部肌肉痙攣狀態(tài)，恢復脊柱的正常生物力學結(jié)構(gòu)[28]，從而緩解對退變椎間盤的機械刺激。

本研究以腰椎間盤退變模型為載體，研究電針對退變椎間盤實驗兔Netrin-1、M-ENK以及β-內(nèi)啡肽含量的影響及兩者之間聯(lián)系。結(jié)果顯示正常實驗兔L2節(jié)段DRG中Netrin-1蛋白表達豐富，這是因為神經(jīng)系統(tǒng)在發(fā)育過程中，DRG需要將軸突延伸至脊髓背角特定靶點建立神經(jīng)通路，Netrin-1既要確定DRG軸突向脊髓背角延伸的時間，同時防止DRG軸突向脊髓背角異常投射[29]。由于在成年動物脊髓以及DRG中Netrin-1受體含量不同，抑制性受體UNC5的含量要遠高于DCC受體[30-31]，當腰椎間盤退變時，DRG中Netrin-1的表達減少，對有髓神經(jīng)纖維的內(nèi)向生長的抑制作用下降，導致有髓神經(jīng)纖維向椎間盤內(nèi)部生長。電針的干預上調(diào)Netrin-1蛋白含量，但假電針組Netrin-1的含量未見增加。這與課題組前期的實驗結(jié)果是一致的，電針能夠通過上調(diào)退變椎間盤DRG中Netrin-1蛋白的表達，使脊髓背角中的生長環(huán)境變?yōu)橐种?，抑制有髓神?jīng)纖維向椎間盤內(nèi)部生長。在正常實驗兔脊髓背角可見少量M-ENK、β-EP，這可能與內(nèi)源性阿片肽在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都有廣泛的表達有關(guān)。腰椎間盤退變后，實驗兔脊髓背角中M-ENK、β-EP蛋白含量增加，究其原因，由于軸向機械壓力誘導椎間盤退變，DRG相應(yīng)節(jié)段的脊髓背角發(fā)生了炎癥反應(yīng)，激活M-ENK、β-EP的釋放。電針干預能夠進一步促進脊髓背角M-ENK、β-EP的合成與分泌，增加脊髓背角內(nèi)源性阿片肽的含量，作用于疼痛傳導通路，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

Netrin-1與脊髓背角M-ENK、β-EP蛋白含量之間均呈正相關(guān)關(guān)系，提示脊髓背角M-ENK、β-EP可能參與電針誘導DRG中Netrin-1表達上調(diào)，從而抑制退變椎間盤有髓神經(jīng)纖維內(nèi)向生長，改善盤源性疼痛。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性阿片肽在電針上調(diào)Netrin-1表達的關(guān)鍵作用，這將有助于闡明電針治療退變腰椎間盤疾病的可能機制，為臨床應(yīng)用電針防治退變腰椎間盤疾病提供一定的科學依據(jù)，但內(nèi)源性阿片肽通過何種途徑參與電針上調(diào)Netrin-1表達，有待進一步研究探討。