β-D-葡萄糖苷酶對(duì)5種菊花總黃酮的影響

章 娟，趙宏蘇，陳慧芳，熊俊偉，徐少君，張 偉，3，吳德玲，3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，安徽 安慶 246052；3.中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

菊花為菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序[1]，主要含有黃酮類、揮發(fā)油、苯丙素類、萜類、氨基酸等成分，其中黃酮類和苯丙素類化合物為菊花的主要藥效成分[2-7]。菊花總黃酮作為藥用菊花的主要活性成分[8]，與菊花的傳統(tǒng)功效密切相關(guān)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[9-13]表明，菊花總黃酮具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗糖尿病等作用，此外對(duì)心血管也有一定的作用，其含量高低是評(píng)價(jià)中藥菊花質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要依據(jù)。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》[1]按產(chǎn)地和加工方法不同，將菊花分為“亳菊”“滁菊”“貢菊”“杭菊”“懷菊”等品種。9—11月花盛開(kāi)時(shí)分批采收，陰干或焙干，或熏、蒸后曬干，其炮制目的在于“殺酶保苷”。前期實(shí)驗(yàn)研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，β-D-葡萄糖苷酶可以水解亳菊中黃酮苷類成分，并且β-D-葡萄糖苷酶水解亳菊總黃酮是烘干過(guò)程中黃酮苷元含量升高的原因之一。而不同品種菊花中多種黃酮苷類成分均是β-D-葡萄糖-O-苷，考慮β-D-葡萄糖苷酶可用于水解結(jié)合于末端、非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時(shí)釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基。因此，本實(shí)驗(yàn)基于“殺酶保苷”的炮制目的，研究β-D-葡萄糖苷酶對(duì)5種菊花黃酮類成分的影響，探究β-D-葡萄糖苷酶在5種藥用菊花加工炮制中的作用，為不同品種藥用菊花的加工方法提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-2030C 3D液相色譜儀：美國(guó)ABSCIEX公司；BSA224S十萬(wàn)分之一電子分析天平：賽多利斯；F80型高速多功能粉碎機(jī)：玖藍(lán)五金制品有限公司；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；HH-S恒溫水浴鍋：江蘇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；PALL超純水機(jī)：美國(guó)Milipore公司。

1.2 試藥 乙腈為色譜純：歐普森；甲酸為分析純：上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；超純水：PALL超純水機(jī)；芹菜素(批號(hào) PS010177)、芹菜苷(批號(hào) PS011186)、木犀草素(批號(hào) PS010346)、木犀草苷(批號(hào) PS000708)、金合歡素(批號(hào) PS011043)、香葉木素(批號(hào) PS010395)、香葉木苷(批號(hào) PS011578)：均購(gòu)于成都普思生物科技股份有限公司，純度均大于98.0%；β-D葡萄糖苷酶(7.4 U/mg)：sigma公司；實(shí)驗(yàn)樣品為亳菊、滁菊、貢菊、杭菊、懷菊，分別采收于安徽亳州、安徽滁州、安徽黃山、浙江桐鄉(xiāng)、河南焦作，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)俞年軍教授鑒定為菊科植物亳菊Chrysanthemummorifolium(Ramat).Tzvel.‘boju’cv.nov.、滁菊Chrysanthemummorifolium(Ramat).Tzvel.‘chuju’cv.nov.、貢菊Chrysanthemummorifolium(Ramat).Tzvel.‘gongju’cv.nov.、杭菊Chrysanthemummorifolium(Ramat).Tzvel.‘hangju’cv.nov.、懷菊Chrysanthemummorifolium(Ramat).Tzvel.‘huaiju’cv.nov.的干燥頭狀花序。

2 方法

2.1 色譜條件 Agilent XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.2%醋酸水(B)；梯度洗脫(0～8 min，5%～10% A；8～15 min，10%～14% A；15～18 min，14%～17% A；18～22 min，17%～17.5% A；22～35 min，17.5%～18% A；35～40 min，18% A；40～50 min，18%～19% A；50～65 min，19%～30% A；65～80 min，30%～52% A)；檢測(cè)波長(zhǎng)：348 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃?；旌蠈?duì)照品溶液及供試品溶液高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

注：1.木犀草苷；2.芹菜苷；3.香葉木苷；4.木犀草素；5.芹菜素；6.香葉木素；7.金合歡素

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取木犀草苷、芹菜苷、香葉木苷、香葉木素、芹菜素、木犀草素、金合歡素對(duì)照品適量，用70%甲醇定容，制成每毫升含有木犀草苷0.195 mg、芹菜苷0.205 mg、香葉木苷0.210 mg、木犀草素0.125 mg、芹菜素0.238 mg、香葉木素0.188 mg、金合歡素0.188 mg的對(duì)照品溶液。

2.3 菊花提取物溶液的制備 取菊花樣品粉末(過(guò)一號(hào)篩)0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率300 W，頻率45 Hz)40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 供試品溶液的制備 分別將各菊花提取物，減壓蒸干，用100 mmol/L、pH 4.0的檸檬酸緩沖溶液定容，制成每毫升含6 mg菊花提取物的底物溶液。將底物溶液放在50 ℃水浴鍋中孵育，待其完全溶解，迅速精密吸取0.2 mL的底物溶液與等量的β-D-葡萄糖苷酶溶液于1.5 mL的離心管中混合，分別在4 ℃、50 ℃、100 ℃條件下水浴反應(yīng)1 h后，加入1 mL甲醇終止反應(yīng)?；靹蚝螅? 000 r/min離心15 min，取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 線性關(guān)系 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液，用70%甲醇逐級(jí)稀釋成2、4、8、16、32、64、128、256倍溶液，搖勻，配成混合對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣10 μL，注入高效液相色譜儀中，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積的積分為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。見(jiàn)表1。

表1 線性回歸方程

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定。測(cè)得木犀草苷、木犀草素、芹菜苷、芹菜素、香葉木苷、香葉木素和金合歡素的精密度的RSD值分別為1.06%、1.02%、1.08%、1.14%、1.01%、1.16%、1.08%，說(shuō)明儀器性能良好，精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合有關(guān)要求。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一樣品6份，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理，在上述色譜條件下測(cè)定，測(cè)定峰面積積分值，計(jì)算RSD。木犀草苷、木犀草素、芹菜苷、芹菜素、香葉木苷、香葉木素和金合歡素峰面積RSD(n=6)分別為0.78%、2.05%、0.57%、1.14%、0.53%、1.04%、0.57%。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液10 μL，分別于0、2、8、10、12、24 h進(jìn)樣，共6次，由峰面積值統(tǒng)計(jì)結(jié)果計(jì)算穩(wěn)定性的相對(duì)峰面積的RSD值分別為1.44%、0.22%、0.85%、0.28%、1.01%、0.79%、0.15%。結(jié)果表明該方法的穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的菊花樣品，精密稱取6份，每份0.125 g。分別精密加入高、中、低濃度的木犀草苷、木犀草素、芹菜苷、芹菜素、香葉木苷、香葉木素和金合歡素對(duì)照品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述高效液相色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，木犀草苷、木犀草素、芹菜苷、芹菜素、香葉木苷、香葉木素和金合歡素的平均回收率分別為97.14%、97.52%、98.72%、99.47%、98.24%、98.33%、99.41%，RSD(n=6)分別為1.30%、1.41%、2.65%、1.52%、1.95%、1.11%、1.06%。

2.5.6 5種藥用菊花含量測(cè)定 按“2.3”“2.4”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算5種菊花樣品提取物及經(jīng)不同加工處理后的成分含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 5種藥用菊花加工后多指標(biāo)成分含量(μg/mL，n=3)

3 結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5種菊花中木犀草苷、香葉木苷和芹菜苷的含量在40 ℃和100 ℃的條件較高，而木犀草素、香葉木素、芹菜素、金合歡素的含量在50 ℃的條件下較高，4 ℃和100 ℃的條件下含量較低，除了亳菊和滁菊中的芹菜素在4 ℃條件下含量最高外，總體上呈現(xiàn)一個(gè)共性規(guī)律，符合“殺酶保苷”的炮制目的。β-D-葡萄糖苷酶活性受溫度影響較大，低溫時(shí)酶活性較低，隨著溫度升高，酶活性增大，但溫度過(guò)高又可能使酶變性[15]。50 ℃酶活性較大，β-D-葡萄糖苷酶水解黃酮苷類成分，從而導(dǎo)致苷元類成分木犀草素、香葉木素、芹菜素、金合歡素含量升高，而4 ℃和100 ℃時(shí)酶活力較低，4 ℃時(shí)酶活性被抑制，100 ℃時(shí)酶被滅活，與激活酶組(50 ℃)相比，抑制酶(4 ℃)或滅活酶組(100 ℃)水解反應(yīng)被抑制，因此木犀草苷等黃酮苷類成分含量升高，與之對(duì)應(yīng)的苷元類成分含量降低。

由于菊花品種、生長(zhǎng)環(huán)境、氣候、土壤等不同，不同菊花之間總黃酮含量存在差異(見(jiàn)圖2)。不同菊花經(jīng)過(guò)不同加工方法處理，抑制、激活或滅活酶水解總黃酮后，得到的木犀草苷、木犀草素、芹菜苷、芹菜素、香葉木苷、香葉木素、金合歡素這7種黃酮類成分總量也存在差異(見(jiàn)圖3)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，在50 ℃條件下黃酮苷總量較低，但總黃酮含量較高(除金合歡素)。酶在被抑制狀態(tài)(4 ℃)和滅活狀態(tài)(50 ℃)菊花中黃酮苷含量較高，酶被激活狀態(tài)(50 ℃)時(shí)，菊花中黃酮苷被水解，黃酮苷含量降低，黃酮苷元含量升高。與4 ℃和100 ℃條件下比較，50 ℃條件下測(cè)得的黃酮類化合物總量較高，推測(cè)在50 ℃條件下導(dǎo)致其他苷轉(zhuǎn)化成木犀草素等苷元，從而使得所測(cè)得的黃酮類成分總量升高。與酶活性被抑制狀態(tài)(4 ℃)相比，除杭菊外，絕大多數(shù)菊花在滅活酶條件下(100 ℃)測(cè)得的黃酮苷類成分總含量較高。

圖2 5種藥用菊花不同溫度處理后的黃酮類成分含量變化圖

注：A.亳菊4 ℃；B.亳菊50 ℃；C.亳菊100 ℃；D.滁菊4 ℃；E.滁菊50 ℃；F.滁菊100 ℃；G.貢菊4 ℃；H.貢菊50 ℃；I.貢菊100 ℃；J.杭菊4 ℃；K.杭菊50 ℃；L.杭菊100 ℃；M.懷菊4 ℃；N.懷菊50 ℃；O.懷菊100 ℃

4 討論

研究表明，體外烘干過(guò)程中β-D葡萄糖苷酶可酶解亳菊中黃酮類成分，且在水浴50 ℃下反應(yīng)最完全[16]。而左亞峰等[14]也從亳菊中分離純化得到β-D-葡萄糖苷酶，并證明其在體內(nèi)水解與體外水解一致，推測(cè)出β-D-葡萄糖苷酶水解亳菊總黃酮是烘干過(guò)程中黃酮苷元含量升高的原因之一。且β-D-葡萄糖苷酶的活性受溫度影響較大[15]。

實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比了不同溫度條件時(shí)，5種菊花提取物在β-D-葡萄糖苷酶作用下的7種黃酮類化合物(木犀草苷及苷元、芹菜苷及苷元、香葉木苷及苷元、金合歡素)，發(fā)現(xiàn)不同藥用菊花在β-D-葡萄糖苷酶作用下均會(huì)發(fā)生黃酮苷水解，從而苷元含量升高，這與傳統(tǒng)加工過(guò)程中“殺酶保苷”的炮制目的一致。

2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》[1]中規(guī)定木犀草苷為質(zhì)量評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)之一。通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)比發(fā)現(xiàn)，高溫和低溫時(shí)(抑制或滅活酶)條件下，5種菊花中木犀草苷含量較高，因此控制藥材的加工溫度對(duì)藥材質(zhì)量要求有一定的意義。后期將以傳統(tǒng)菊花加工炮制過(guò)程中殺(抑)酶保苷的共性規(guī)律為切入點(diǎn)，系統(tǒng)研究5種菊花中自身酶在菊花炮制加工中的作用，為制定合理的菊花現(xiàn)代加工炮制工藝提供依據(jù)。