基于AngⅡ/TLR4/NF-κB通路探討滋陰潛陽(yáng)方改善自發(fā)性高血壓大鼠腎損害的機(jī)制

劉 陽(yáng)，董昌武，徐 慧，程 斌，王奇林，廖岳闖

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012)

中國(guó)有超過(guò)2億人口患有高血壓病[1]，長(zhǎng)期處于高血壓狀態(tài)會(huì)對(duì)患者心、腦、腎等靶器官的結(jié)構(gòu)與功能造成嚴(yán)重?fù)p害[2]。早期腎損害若未得到有效控制，最終有可能導(dǎo)致腎功能衰竭。因此，治療高血壓病，控制血壓是當(dāng)務(wù)之急，預(yù)防及改善腎損害是重中之重。近些年來(lái)，許多研究表明，炎癥反應(yīng)對(duì)高血壓病的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程有不可忽視的影響，并且與高血壓早期腎損害具有密切的聯(lián)系。因此，對(duì)于炎癥反應(yīng)在高血壓病對(duì)靶器官的損害方面的機(jī)制研究成為熱點(diǎn)[3]。本課題組前期研究[4-5]表明，滋陰潛陽(yáng)方可有效降低高血壓大鼠血壓并降低其腎組織中白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8等炎癥因子水平，從而改善高血壓大鼠腎損害。但其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討，基于上述研究，本實(shí)驗(yàn)將腎臟血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)/Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路作為高血壓腎損害炎癥反應(yīng)的特異性指標(biāo)，采用自發(fā)性高血壓(收縮壓>160 mmHg)大鼠模型[6]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，以滋陰潛陽(yáng)方進(jìn)行干預(yù)，并以依那普利為對(duì)照，觀察滋陰潛陽(yáng)方對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)腎臟保護(hù)的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12周齡雄性清潔級(jí)SHR 40只，體質(zhì)量(230±20)g，購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011]，收縮壓為160～190 mmHg。室溫下飼養(yǎng)，相對(duì)濕度為55%～60%，換氣次數(shù)為每小時(shí)10～15次，晝夜明暗交替時(shí)間為12/12 h，飼料和墊料經(jīng)高壓滅菌，飲水為純凈水，自由攝水納食。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 滋陰潛陽(yáng)方：制何首烏、鉤藤(后下)各20 g，熟地黃、生地黃、川芎各15 g，石決明(先煎)、煅牡蠣(先煎)各30 g。以上中藥飲片，均購(gòu)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。煎煮方法：將藥物以10倍量的水浸泡2 h，待藥物完全吸水，煮沸1 h，過(guò)濾，將藥渣再用8倍量水煮沸1 h，過(guò)濾，合并2次濾液，濾液置低溫恒溫反應(yīng)浴濃縮至含生藥質(zhì)量濃度為2 g/mL，藥液裝瓶，4 ℃存儲(chǔ)；依那普利(江蘇制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H32026567)購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院西藥房，每片10 mg。

1.3 主要儀器和試劑 大鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)(MS60)：上海玉研科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)檢測(cè)儀(EPoch)：美國(guó)伯滕儀器有限公司；低溫型研磨儀(kz-Ⅲ-FP)、RNA提取液(G3013)：武漢塞維爾生物科技有限公司；熒光定量PCR儀(CFX)：Bio-rad；對(duì)開(kāi)門(mén)雙門(mén)冰箱(BCD-518WEC)：合肥美菱股份有限公司；-80 ℃冰箱：合肥Royalstar；電子天平(ME203E/02)：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；AngⅡ、Ang(1-7)大鼠酶聯(lián)免疫試劑盒(E-EL-R1430c、E-EL-R1138c)：武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及干預(yù)措施 采用隨機(jī)數(shù)字表法將SHR分為模型組、依那普利組、滋陰潛陽(yáng)方低劑量組、滋陰潛陽(yáng)方高劑量組，每組10只。胃內(nèi)給藥，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)中常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的體表面積比例換算方法[7]，模型組每日給予0.9% NaCl溶液10 mL/kg灌胃，依那普利組每日給予依那普利1.05 mg/kg灌胃；滋陰潛陽(yáng)方低、高劑量組每日分別給予5.85、23.4 g/kg(分別相當(dāng)于成人臨床用藥等效劑量、4倍劑量)滋陰潛陽(yáng)方湯劑灌胃，連續(xù)胃內(nèi)給藥6周，每日2次。

2.2 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定

2.2.1 血壓測(cè)量 將大鼠放置于無(wú)創(chuàng)血壓采集系統(tǒng)配套的鼠籠中，設(shè)定溫度為37 ℃，進(jìn)行15～20 min預(yù)熱，使大鼠平靜且尾部血運(yùn)充盈，采用套尾法，確定環(huán)形尾套無(wú)漏氣后，啟動(dòng)加壓泵，在大鼠安靜且清醒狀態(tài)下，連續(xù)測(cè)量尾動(dòng)脈收縮壓3次，最后取平均值作為結(jié)果。分別于給藥前、給藥2周、給藥4周以及給藥6周測(cè)量并記錄大鼠尾動(dòng)脈收縮壓值。

2.2.2 腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察 藥物干預(yù)6周，第42天血壓測(cè)量完畢后，禁食不禁水12 h，大鼠予以20%烏拉坦(120 mg/kg)腹腔注射麻醉，于大鼠腹主動(dòng)脈取血，將4 mL血液標(biāo)本離心(3 000 r/min)10 min，收集上層清液，置于-80 ℃冰箱凍存待測(cè)。取大鼠左腎，用0.9% NaCl清洗并去除結(jié)締組織，用濾紙拭干水分，分為兩部分，一部分腎組織放入脫酶EP管中，于-80 ℃冰箱冷凍保存，用于檢測(cè)大鼠腎組織TLR4、NF-κB p65 mRNA含量，另一部分腎組織采用4%多聚甲醛固定液固定，經(jīng)過(guò)24 h后，進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色。

2.2.3 大鼠血清AngⅡ、Ang(1-7)含量測(cè)定 采用ELISA法檢測(cè)SHR血清中AngⅡ和Ang(1-7)的含量。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格遵守操作步驟，使用酶標(biāo)儀測(cè)得各孔在450 nm波長(zhǎng)下的光密度(optical density,OD)值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度以及OD值作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后再利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組SHR血清AngⅡ、Ang(1-7)的含量。

2.2.4 RT-qPCR法檢測(cè)大鼠腎組織TLR4、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平 模型組及各藥物干預(yù)組分別取腎臟組織100 mg加入到勻漿管中，研磨至無(wú)團(tuán)塊，按照實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA提取，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：預(yù)變性，95 ℃ 10 min；變性，95 ℃ 15 s；退火，60 ℃ 30 s，一共經(jīng)過(guò)40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計(jì)算出各組大鼠腎臟TLR4、NF-κB-p65 mRNA表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 各組SHR治療前后尾部收縮壓比較 藥物干預(yù)前，模型組及各藥物干預(yù)組大鼠的血壓值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組收縮壓隨著周齡增長(zhǎng)而升高；給藥2周后，與模型組比較，依那普利組與滋陰潛陽(yáng)方高劑量組大鼠血壓有不同程度的降低，依那普利組血壓降低更明顯(P<0.05)；自給藥4周后起，與模型組比較，依那普利組，滋陰潛陽(yáng)方高、低劑量組血壓均顯著降低(P<0.05)；組間比較發(fā)現(xiàn)，依那普利組較其他治療組降壓作用更明顯，滋陰潛陽(yáng)方高劑量組降壓作用優(yōu)于滋陰潛陽(yáng)方低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組SHR治療前后尾部收縮壓比較

3.2 各組SHR血清AngⅡ、Ang(1-7)含量比較 與模型組比較，各治療組大鼠血清AngⅡ含量都呈現(xiàn)出不同程度的降低，血清Ang(1-7)水平都有不同程度的升高(P<0.05)；其中依那普利組血清AngⅡ含量的降低、Ang(1-7)含量的升高較其他兩組更為顯著(P<0.05)，滋陰潛陽(yáng)方高劑量組血清AngⅡ含量的降低、Ang(1-7)含量的升高較滋陰潛陽(yáng)方低劑量組更為顯著(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：與模型組比較，*P<0.05；與依那普利組比較，#P<0.05；與滋陰潛陽(yáng)方高劑量組比較，△P<0.05

3.3 各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)觀察 模型組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)重度異常，部分腎小球周?chē)梢?jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(黑色箭頭所示)，腎小管刷狀緣脫落(黃色箭頭所示)。滋陰潛陽(yáng)方低劑量組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)明顯紊亂，腎小球周?chē)装Y細(xì)胞數(shù)量較模型組減少(黑色箭頭所示)，部分腎小管刷狀緣脫落(黃色箭頭所示)。滋陰潛陽(yáng)方高劑量組與低劑量組相比，損傷程度有很大改善，腎小球周?chē)装Y細(xì)胞數(shù)量明顯減少(黑色箭頭所示)；依那普利組與其他3組相比，腎組織結(jié)構(gòu)更為完整，腎間質(zhì)僅可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖2。

注：A.模型組；B.滋陰潛陽(yáng)方低劑量組；C.滋陰潛陽(yáng)方高劑量組；D.依那普利組

3.4 各組SHR腎臟組織TLR4、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平比較 與模型組比較，各治療組大鼠腎臟組織中TLR4、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。其中依那普利組TLR4、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平較其他兩組降低更為顯著(P<0.05)，滋陰潛陽(yáng)方高劑量組TLR4、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平較滋陰潛陽(yáng)方低劑量組降低更為顯著(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組SHR腎組織TLR4、NF-κB p65mRNA表達(dá)水平比較

4 討論

高血壓腎損害可歸屬于中醫(yī)學(xué)“腰痛”“腎勞”等范疇，是高血壓病嚴(yán)重并發(fā)癥之一。據(jù)研究[8]報(bào)道，高血壓病的發(fā)生過(guò)程中多器官伴隨著低水平炎癥反應(yīng)，而血壓過(guò)高又會(huì)加重炎癥反應(yīng)，炎癥過(guò)程中釋放的炎癥因子可促進(jìn)高血壓病的發(fā)展并對(duì)其靶器官造成損害。課題組前期通過(guò)臨床觀察發(fā)現(xiàn)，滋陰潛陽(yáng)方能夠通過(guò)補(bǔ)腎陰、益精血、活血祛瘀通絡(luò)改善高血壓早期腎損害患者的腎功能[9]，方中鉤藤具有良好的降壓作用，石決明、牡蠣潛陽(yáng)，熟地黃滋腎陰、生地黃清熱涼血養(yǎng)陰，川芎活血祛瘀通絡(luò)，諸藥合用，共奏潛陽(yáng)降壓、活絡(luò)通瘀護(hù)腎之功。課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，滋陰潛陽(yáng)方能夠?qū)Α皟赡I一夾”高血壓大鼠早期腎損害起到保護(hù)作用[10]。本實(shí)驗(yàn)采用穩(wěn)定的SHR進(jìn)行研究，盡可能避免因外界影響造成或加重大鼠炎癥水平。

高血壓腎損害與血液中AngⅡ表達(dá)增多具有密切關(guān)系[11-12]，AngⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的主要效應(yīng)物[13]，其作為一種強(qiáng)大的縮血管物質(zhì)，可令局部血管張力增高，加重高血壓病進(jìn)展，激發(fā)炎癥反應(yīng)[14]，在高血壓腎損害的過(guò)程中亦起著不容小覷的作用[15-16]。TLR4是Toll樣受體參與慢性炎癥作用中被研究較多的受體之一，AngⅡ可直接與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的TLR4結(jié)合，當(dāng)AngⅡ過(guò)度表達(dá)時(shí)，可激活TLR4所介導(dǎo)的信號(hào)通路，從而激活其下游NF-κB并使之磷酸化，激活多種炎癥因子，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，TLR4通過(guò)上調(diào)其下游因子NF-κB的表達(dá)調(diào)控多種炎癥因子的釋放，在高血壓腎損害的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[17]。有研究[18]發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)降低AngⅡ和TLR4、NF-κB p65的表達(dá)，抑制AngⅡ誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB炎癥通路激活，從而減輕高血壓腎損害。這與本實(shí)驗(yàn)中滋陰潛陽(yáng)方能夠有效降低SHR血壓、血清AngⅡ水平以及大鼠腎臟TLR4、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平的結(jié)果基本一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)6周的干預(yù)，與模型組比較，各藥物干預(yù)組大鼠腎臟中TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平明顯降低，其中滋陰潛陽(yáng)方高劑量組比滋陰潛陽(yáng)方低劑量組下降更為明顯(P<0.05)，表明滋陰潛陽(yáng)方能夠以降低血清AngⅡ水平、抑制TLR4/NF-κB通路激活的方式減輕腎臟損害。另外，腎臟形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)治療，滋陰潛陽(yáng)方高劑量組、依那普利組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)較為清晰，與模型組相比，炎癥細(xì)胞較少，說(shuō)明大鼠血壓升高的同時(shí)，對(duì)腎臟的損害開(kāi)始加重，而滋陰潛陽(yáng)方能夠有效減少和改善SHR腎臟炎癥浸潤(rùn)。

Ang(1-7)是重要的血管抑炎因子，其主要由血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-coverting enzyme 2，ACE2)水解AngⅡ產(chǎn)生，Ang(1-7)在體內(nèi)分布較廣，主要分布于血液及腎臟血管等處，能夠抗炎、舒張血管、穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞等[19-21]，進(jìn)而起到降壓、保護(hù)心臟、延緩動(dòng)脈粥樣硬化的作用，以減輕高血壓病對(duì)心、腦、腎等靶器官的損害等[22-24]。戴亞?wèn)|等[25]發(fā)現(xiàn)，Ang(1-7)可以顯著降低SHR血壓水平，并能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以保護(hù)心肌細(xì)胞，延緩左心室肥厚，表明利用ACE2/Ang1-7拮抗AngⅡ是一種有效且重要的降壓方式。本研究結(jié)果顯示，未施加干預(yù)因素的模型組大鼠，其血壓隨著時(shí)間的增加而增長(zhǎng)；藥物干預(yù)組從第4周開(kāi)始，血壓得到有效的控制，并呈現(xiàn)不同程度的降低，再次證明滋陰潛陽(yáng)方有較好的降壓效果。與模型組相比，滋陰潛陽(yáng)方高、低劑量組大鼠血清AngⅡ水平降低，血清Ang(1-7)水平升高，且滋陰潛陽(yáng)方高劑量組降壓效果優(yōu)于滋陰潛陽(yáng)方低劑量組(P<0.05)，即存在量效相關(guān)性。結(jié)果表明滋陰潛陽(yáng)方可以通過(guò)降低SHR血清AngⅡ水平擴(kuò)張血管而降壓，以及提高血管抑炎因子Ang(1-7)水平減輕血管炎癥、舒張血管而降壓，進(jìn)而緩解高血壓腎損害進(jìn)展。由于Ang(1-7)主要是由ACE2水解AngⅡ產(chǎn)生，推測(cè)滋陰潛陽(yáng)方可能有促進(jìn)ACE2水解AngⅡ?yàn)锳ng(1-7)的作用，并同時(shí)具有直接影響AngⅡ水平的作用，其內(nèi)在作用機(jī)制有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，滋陰潛陽(yáng)方能夠在減輕SHR腎臟組織損害的同時(shí)改善其腎臟組織形態(tài)，起到延緩高血壓腎損害的作用，其機(jī)制可能與調(diào)控AngⅡ/TLR4/NF-κB信號(hào)通路，降低炎癥因子過(guò)度表達(dá)有關(guān)。本研究在動(dòng)物周齡、藥物治療時(shí)長(zhǎng)的選擇等方面需要優(yōu)化，遠(yuǎn)期療效與相關(guān)因素的關(guān)系仍需進(jìn)一步探討。