基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究桃紅四物湯干預(yù)腰椎間盤突出癥的機(jī)制

喬明珠，呂 浩，江 渟

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷一科，安徽 合肥 230031)

腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation，LDH)是一種常見的骨關(guān)節(jié)病，也是誘發(fā)腰痛的主要原因之一。其基本病理變化為腰椎間盤退行性變，纖維環(huán)部分或全部破裂，隨即髄核(nules pulposus,NP)突出或脫出[1-2]。LDH可歸屬于中醫(yī)學(xué)“腰腿痛”或“痹病”范疇。臨床常用活血化瘀類藥物治療[3-4]。桃紅四物湯首見于《醫(yī)宗金鑒·婦科心法要訣》，由桃仁、紅花、當(dāng)歸、熟地黃、白芍和川芎組成，組方嚴(yán)謹(jǐn)。近代醫(yī)家在繼承傳統(tǒng)的基礎(chǔ)上將其廣泛應(yīng)用于內(nèi)科、皮膚科和骨傷科等疾病[5-7]。本研究采用生物信息學(xué)分析方法對(duì)桃紅四物湯干預(yù)LDH的主要活性成分、作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路進(jìn)行篩選，揭示其作用機(jī)制，為桃紅四物湯治療LDH提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 桃紅四物湯有效化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)的檢索 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)尋找桃仁、紅花、熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎6味中藥的有效化學(xué)成分，對(duì)口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18的活性成分進(jìn)行初步篩選，獲得活性化合物及其作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，并根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充與活性化合物相關(guān)的已知靶點(diǎn)。篩選完成后，在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中對(duì)化合物的作用靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范化。

1.2 LDH疾病相關(guān)靶點(diǎn)篩選 以“Lumbar disc herniation”為關(guān)鍵詞依次查詢GeneCards(https://www. genecards.org)、人類孟德爾遺傳在線(online mendelian inheritance in man,OMIM)、療效靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database,TTD)、DRUGBANK(https://www.drugbank.ca)數(shù)據(jù)庫，尋找治療LDH的潛在靶點(diǎn)，整合4個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫中靶點(diǎn)，得到治療LDH的靶點(diǎn)。

1.3 桃紅四物湯與LDH共有靶點(diǎn)的確定 將桃紅四物湯的藥物靶點(diǎn)和LDH的靶點(diǎn)進(jìn)行分析，匯總后取交集，確定藥物與疾病的共同靶點(diǎn)。借助Venny 2.1在線繪圖軟件制作共同靶點(diǎn)文氏圖。

1.4 桃紅四物湯與LDH可視化網(wǎng)絡(luò)的建立 使用STRING數(shù)據(jù)庫在線平臺(tái)(http://string-db.org)分析LDH與桃紅四物湯共有靶點(diǎn)，獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，以tsv格式導(dǎo)出。將文件代入到R軟件編寫程序中，以靶點(diǎn)蛋白之間的作用次數(shù)為參考，定義互作關(guān)系多的蛋白為核心蛋白，并制作條形圖。將蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)的網(wǎng)絡(luò)檢索結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，調(diào)整節(jié)點(diǎn)(node)和邊(edge)，形成可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.5 桃紅四物湯干預(yù)LDH的基因通路富集分析 將共有靶點(diǎn)代入R軟件編寫的基因通路富集分析程序，對(duì)桃紅四物湯干預(yù)LDH的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集和生物過程注釋，獲得顯著富集的信號(hào)通路(P<0.05)，運(yùn)用Cytoscape 3.8.2軟件獲得富集靶點(diǎn)的信息以及相關(guān)通路。根據(jù)分析結(jié)果，獲取前20條通路，選擇與研究的問題最相關(guān)的通路，結(jié)合基因表達(dá)水平變化的程度，對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 桃紅四物湯的化學(xué)成分篩選結(jié)果 根據(jù)OB≥30%且DL≥0.18，對(duì)檢索到的活性成分進(jìn)行篩選，共得到已驗(yàn)證的桃紅四物湯活性成分69個(gè)，其中桃仁、紅花、熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎的活性成分?jǐn)?shù)量分別為23、22、2、2、13、7個(gè)。根據(jù)OB值列出排在前10位的藥物活性成分，見表1。

表1 桃紅四物湯中OB值排在前10位的有效化學(xué)成分

2.2 桃紅四物湯干預(yù)LDH的靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果 共獲取藥物靶點(diǎn)446個(gè)，其中桃仁、紅花、熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎的作用靶點(diǎn)數(shù)量分別為47、205、30、50、86、28個(gè)，匯總并去掉重復(fù)的靶點(diǎn)后共獲得235個(gè)靶點(diǎn)。檢索4個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫后共獲得LDH的相關(guān)靶點(diǎn)1 990個(gè)，匯總并去掉重復(fù)的靶點(diǎn)后共獲得1 243個(gè)靶點(diǎn)。將235個(gè)藥物成分靶點(diǎn)與1 243個(gè)LDH靶點(diǎn)輸入Draw Venny Diagram在線軟件，繪制韋恩圖，取交集后獲得二者共有靶點(diǎn)82個(gè)。

2.3 桃紅四物湯干預(yù)LDH的活性成分-靶點(diǎn)模型構(gòu)建 借助Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建桃紅四物湯干預(yù)LDH的可視化“活性成分-靶點(diǎn)模型”。見圖1。

注：TR、HH、SD、DG、BS、CX分別代表桃仁、紅花、熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎，圓形結(jié)點(diǎn)代表不同藥物的活性成分，中間矩形代表LDH的靶點(diǎn)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及核心蛋白確定 將桃紅四物湯與LDH共有的82個(gè)交集靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫平臺(tái)，進(jìn)一步分析后得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

注：圖中線條代表蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，連接靶點(diǎn)的線條數(shù)量與該靶點(diǎn)作為潛在靶點(diǎn)的可能性呈正相關(guān)

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)中的連接結(jié)果，借助條形圖進(jìn)行可視化，可以得出腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、激活蛋白1(activator protein 1,JUN)、表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine-protein kinase 1, AKT1)與其他基因聯(lián)系最密切，為PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。見圖3。

圖3 桃紅四物湯干預(yù)LDH的關(guān)鍵靶點(diǎn)條形圖

2.5 采用基因本體論(gene ontology,GO)對(duì)桃紅四物湯干預(yù)LDH的靶點(diǎn)進(jìn)行功能富集分析 運(yùn)用R3.6.1軟件分析排在前10位的生物學(xué)過程(biological process,BP)、細(xì)胞組成(cellular component,CC)及分子功能(molecular function,MF)。生物學(xué)過程涉及對(duì)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)等；細(xì)胞組成涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、囊泡腔及分泌顆粒腔等；分子功能涉及DNA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、受體活性、細(xì)胞因子活性等。見圖4。

注：富集基因的數(shù)量由氣泡節(jié)點(diǎn)的大小表示，其紅色的程度代表顯著狀況

2.6 采用京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)對(duì)桃紅四物湯干預(yù)LDH的靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析 運(yùn)用R3.6.1軟件和Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行KEGG通路富集分析和治療靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，得出桃紅四物湯作用于LDH的靶點(diǎn)主要富集于絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路、晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end product，AGE)-AGE受體(receptor for AGE，RAGE)通路、TNF通路等。見圖5。

圖5 桃紅四物湯干預(yù)LDH的靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

3 討論

中藥復(fù)方具有藥味多、成分復(fù)雜、作用靶點(diǎn)多等特點(diǎn)，采用傳統(tǒng)方法探究中藥復(fù)方的作用機(jī)制尚有一定難度。生物信息學(xué)方法為從分子水平探討中藥復(fù)方的作用機(jī)制提供了機(jī)遇。腰痛是導(dǎo)致殘疾的主要原因，約70%的人一生中會(huì)經(jīng)歷腰痛[8]。椎間盤退行性變是導(dǎo)致LDH發(fā)病的基本原因，其誘發(fā)機(jī)制尚不清楚，但細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)降解、炎癥和細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致LDH的常見原因[2]。當(dāng)椎間盤開始退變時(shí)，細(xì)胞功能逐漸失衡，NP細(xì)胞含水量下降，NP細(xì)胞和纖維環(huán)內(nèi)的膠原蛋白含量降低，ECM降解。基質(zhì)金屬蛋白酶(matria metalloproteinases,MMP)含量增加，炎癥遞質(zhì)釋放，致使椎間盤生物力學(xué)性能降低，纖維環(huán)變?nèi)酰踔疗屏?。近年來針?duì)LDH的手術(shù)更多地由開放式向微創(chuàng)轉(zhuǎn)變，但手術(shù)可導(dǎo)致硬膜、神經(jīng)根、大血管損傷，全身麻醉可導(dǎo)致不良反應(yīng)，且術(shù)后恢復(fù)時(shí)間長、手術(shù)成本高，因此患者較難接受手術(shù)治療。保守治療仍是大多數(shù)LDH患者的首選治療方法[9]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，LDH的病機(jī)分為虛實(shí)兩端：腎虛可致腰府失養(yǎng)，從而引起腰痛不能轉(zhuǎn)側(cè)；風(fēng)寒濕邪外襲，經(jīng)脈困阻，氣血運(yùn)行不暢，不通則痛。臨床研究[10]表明，桃紅四物湯配合椎間盤鏡微創(chuàng)手術(shù)治療LDH后，患者的腰椎活動(dòng)度、直腿抬高角度、神經(jīng)功能改善情況明顯優(yōu)于單純手術(shù)治療。桃紅四物湯加減配合射頻消融髓核成形術(shù)可促使患者血常規(guī)指標(biāo)恢復(fù)，疼痛明顯緩解[11]。桃紅四物湯能夠顯著降低LDH患者炎癥因子水平，改善臨床癥狀體征[12-13]?？梢姡壹t四物湯具有活血化瘀、消腫散結(jié)、疏通經(jīng)絡(luò)的作用，治療LDH的臨床療效確切。

借助Cytoscape構(gòu)建藥物的活性成分與疾病的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示桃紅四物湯干預(yù)LDH具有多靶向的特點(diǎn)。在PPI網(wǎng)絡(luò)中構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)蛋白模型，對(duì)藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)之間的關(guān)系進(jìn)行可視化分析，得出TNF、JUN、EGF、EGFR、AKT1等為桃紅四物湯干預(yù)LDH的核心靶點(diǎn)。TNF作為人體免疫反應(yīng)的關(guān)鍵遞質(zhì)，可以調(diào)控免疫系統(tǒng)、細(xì)胞存活的信號(hào)通路，以及調(diào)節(jié)增殖代謝過程[14]。研究[15-16]表明，桃紅四物湯對(duì)炎癥因子、免疫活性因子具有調(diào)節(jié)作用。JUN作為AP-1轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，對(duì)細(xì)胞外的各種刺激具有功能作用，JUN可促進(jìn)NP細(xì)胞增殖，減少NP細(xì)胞凋亡，增加NP細(xì)胞的ECM合成，下調(diào)炎癥因子水平[17]。通過激活A(yù)KT通路可以抑制NP細(xì)胞凋亡[18-19]。

GO生物富集分析結(jié)果顯示，桃紅四物湯干預(yù)LDH主要通過DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及對(duì)營養(yǎng)水平的反應(yīng)。椎間盤開始退變時(shí)，細(xì)胞性能逐漸不穩(wěn)定、纖維環(huán)膠原蛋白在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上發(fā)生改變，促使NP細(xì)胞內(nèi)水分含量減少、蛋白多糖比例下降以及炎癥遞質(zhì)大量釋放。炎癥細(xì)胞因子是炎癥反應(yīng)的產(chǎn)物，也意味著炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活。隨著退行性變進(jìn)一步加深，NP細(xì)胞釋放的促炎細(xì)胞因子也越來越多，如TNF-α、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6[20]，這些細(xì)胞因子能夠促進(jìn)ECM降解[21-23]。

KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果顯示，與LDH密切相關(guān)的通路包括MAPK信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路和AGE-RAGE通路等。TNF信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生等眾多生物學(xué)活動(dòng)[24]。近年來，有大量證據(jù)表明，TNF-α可刺激多種MMP和具有血小板反應(yīng)素基序的溶栓素和金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs，ADAMTS)的表達(dá)，主要通過核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)/MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)這些酶的表達(dá)[25]。MAPK通路主要參與細(xì)胞生長、發(fā)育、增殖以及分化等多個(gè)生理、病理過程[26]。Huang等[20]通過檢測細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的表達(dá)，明確IL-33/ST2信號(hào)通路對(duì)LDH的鎮(zhèn)痛作用和對(duì)炎癥遞質(zhì)的調(diào)節(jié)作用是通過MAPK和NF-κB通路激活的。LDH患者的黃韌帶細(xì)胞經(jīng)受氧化應(yīng)激反應(yīng)后，可快速激活A(yù)KT、JNK和p38 MAPK通路，觸發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)后，增強(qiáng)了炎癥和纖維化標(biāo)志物的表達(dá)[27]。AGE通過與RAGE結(jié)合，產(chǎn)生炎癥前細(xì)胞因子、活性氧誘導(dǎo)炎癥和免疫抑制，活化半胱天冬蛋白酶3和MMP等的表達(dá)[28]。桃紅四物湯含藥血清可下調(diào)β3整合素、MMP和P38，激活FAK/MAPK信號(hào)表達(dá)[29]。王偉軍等[30]通過數(shù)據(jù)分析與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證桃紅四物湯可以通過參與炎癥相關(guān)的NF-κB通路和凋亡通路調(diào)控關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激作用。此外，LDH的發(fā)病及其相關(guān)信號(hào)通路主要涉及應(yīng)激條件下細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡過程[31]。以上相關(guān)研究結(jié)果與本次分析結(jié)果基本相同，提示桃紅四物湯對(duì)LDH具有確切療效。

本研究表明，桃紅四物湯中活性化合物可調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路和作用于不同靶點(diǎn)，從而發(fā)揮治療LDH的作用。由于本研究采用生物信息學(xué)分析方法，結(jié)果建立在模型預(yù)測基礎(chǔ)上，因此所篩選的關(guān)鍵靶點(diǎn)、信號(hào)通路還需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。