鮮天麻中酶對巴利森苷A的降解作用研究△

李佳陽，吳國真，王新茗，賈傳青，王曉，陳龍，董紅敬

1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；2.云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，云南 昆明 650000；3.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250355

天麻為蘭科植物天麻Gastrodia elataBL.的干燥塊莖，一般在立冬后至次年清明開始采挖，具有息風(fēng)止痙、平肝抑陽、祛風(fēng)通絡(luò)的傳統(tǒng)功效，用于小兒驚風(fēng)、癲癇抽搐、頭暈?zāi)垦?、手足不遂、風(fēng)濕痹痛等證[1]。天麻為中醫(yī)臨床上常用的名貴中藥材，富含天麻素和巴利森苷類成分[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，巴利森苷類成分對神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有較好的藥理活性，巴利森苷J(rèn) 對記憶力減退疾病具有一定的成效，巴利森苷A 和巴利森苷C 對短期記憶具有改善作用[3]。近年來，許多學(xué)者就不同初加工方法對天麻品質(zhì)的影響展開了深入研究，發(fā)現(xiàn)天麻炮制加工方法對巴利森苷類成分和天麻素有明顯的影響，蒸制后的天麻中天麻素和巴利森苷類成分含量相對較高，品質(zhì)也最好[4?5]。目前，蒸制提高天麻品質(zhì)的機制研究主要集中在“殺酶保苷”的層面上[5]，并未見天麻中酶對其苷類成分降解作用的相關(guān)研究報道。天麻中巴利森苷A的含量較高[6]，本實驗研究不同方法初加工后天麻樣品間的成分差異，并以巴利森苷A 為例，探討溫度和時間對降解酶活性的影響，采用葡聚糖凝膠G?200 柱色譜法對粗酶進(jìn)行了分離純化，以期為天麻產(chǎn)地加工提供參考。

1 材料

1.1 儀器

S6000 型高效液相色譜儀（華譜科儀北京科技有限公司）；SCIENTZ?10N 型冷凍干燥機、SB?5200DT型超聲波提取器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SQP型十萬分之一電子天平（塞多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；TGL?16A 型臺式高速冷凍離心機（湖南平凡科技有限公司）；JYL?C21T 型料理機（九陽股份有限公司）；UV?2700 型紫外?可見分光光度計（株式會社島津制作所）；H2O3?PRO 型金屬浴（卡尤迪生物科技宜興有限公司）；PowerPac型基礎(chǔ)電泳儀電源、Mini?Protean型小垂直板電泳槽（美國Bio?Rad公司）；CX?S300型脫色搖床（上海舍巖儀器有限公司）；ChemiScope 6200 Touch 型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）；BS?100N 型自動部分收集器（上海滬西分析儀器廠有限公司）；密理博Direct?Q 型超純水系統(tǒng)（美國默克公司）。

1.2 試藥

鮮天麻采自云南省昭通市彝良縣小草壩天麻種植基地，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)劉大會教授鑒定為蘭科植物烏天麻Gastrodia elataBL.f.glauca的塊莖。

對照品天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E（本實驗室自制，純度≥98%）；對照品對羥基苯甲醇（純度≥98%，批號：DSTDD012301，成都德思特生物技術(shù)有限公司）；色譜純乙腈（天津市康科德科技有限公司）；分析純丙酮（煙臺遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司）；分析純甲酸、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）和磷酸二氫鈉（NaH2PO4）均購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；葡聚糖凝膠G?200（上海源葉生物科技有限公司）；4×蛋白上樣緩沖液、聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）、透析袋（8000～14 000）、彩虹180 廣譜蛋白Marker 均購自北京索萊寶科技有限公司；十二烷基磺酸鈉?聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS?PAGE）試劑盒和電泳液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)R250（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；去離子水為本實驗室自制。

2 方法

2.1 對照品溶液的配制

精密稱取對照品天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 和對羥基苯甲醇各10 mg，置于50 mL量瓶中，加少量50%甲醇溶解后定容，得到質(zhì)量濃度為200 μg·mL-1的各對照品儲備溶液。分別取各對照品儲備溶液0.1 mL，置于1.0 mL 量瓶中，加50%甲醇定容，作為混合對照品溶液，進(jìn)行高效液相色譜法（HPLC）分析。

2.2 干燥天麻樣品制備

取1 塊鮮天麻，洗凈后豎向切制成4 等份，取3份分別編號后進(jìn)行加工處理，具體加工方法如下：1）天麻蒸透，取出，瀝干表面水分后，40 ℃烘干；2）將切制好的天麻塊放入預(yù)熱的40 ℃烘箱中烘干；3）放入-20 ℃冰箱中充分冷凍后，再放入冷凍干燥機進(jìn)行干燥。將以上干燥好的樣品分別粉碎后過40目篩，備用。

2.3 天麻粗酶液的制備

稱取去皮鮮天麻約500 g，切碎，用料理機均質(zhì)成勻漿。向勻漿中加入預(yù)冷的丙酮（-20 ℃）1000 mL，攪拌混勻后，在4 ℃冰箱中密封靜置2 h。將靜置后的溶液用布氏漏斗進(jìn)行抽濾，濾餅用預(yù)冷的丙酮8000 mL 反復(fù)溶解后進(jìn)行抽濾，得濾餅。將濾餅置于蒸發(fā)皿中，室溫下放置于通風(fēng)櫥中讓丙酮揮發(fā)，即得天麻丙酮干粉。向丙酮干粉中加入預(yù)冷的Na2HPO4?NaH2PO4（0.05 mol·L-1，pH 6.0，下同）緩沖液400 mL，并加入質(zhì)量為丙酮干粉質(zhì)量的5%的PVPP，充分研磨后在4 ℃冷藏柜中靜置2 h。紗布濾過，取濾液，冷凍離心10 min（10 000 r·min-1，4 ℃，離心半徑為9.1 cm），收集上清液，采用透析袋將上清液在緩沖溶液（4 ℃）中透析24 h（每4 h更換1次透析液），得天麻粗酶液。

2.4 天麻化學(xué)成分的提取

參考《中華人民共和國藥典》2020 年版的方法對天麻樣品進(jìn)行提取[1]。分別精密稱取不同干燥方法得到的天麻藥材粉末0.5 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，超聲處理30 min，放冷，補足減失的質(zhì)量后搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，過0.45 μm濾膜，進(jìn)行HPLC分析。

2.5 色譜條件

Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.05% 甲酸乙腈溶液（A）?0.05%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫（0～10 min，3%～10%A；10～15 min，10%～12%A；15～25 min，12%～18%A；25～40 min，18%A）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測波長：225 nm；進(jìn)樣體積：20 μL。

2.6 粗酶液與巴利森苷A的酶解反應(yīng)

采用2.1項下方法，以Na2HPO4?NaH2PO4緩沖液為溶劑，制備質(zhì)量濃度為200 μg·mL-1的巴利森苷A儲備溶液。

精密量取2.3 項下粗酶液2 份，每份2.7 mL，分別加入巴利森苷A 儲備溶液和Na2HPO4?NaH2PO4緩沖液0.3 mL，作為供試組和酶對照組。分別將2 組樣品在35 ℃水浴條件下磁力攪拌反應(yīng)2 h后，向每組中各加乙腈3 mL，渦旋混勻1 min，使酶蛋白沉淀，終止反應(yīng)。樣品離心10 min（8000 r·min-1，離心半徑為8.75 cm），取上清液4 mL，用氮吹儀吹干后，加去離子水2 mL 溶解，溶液過0.45 μm 濾膜后，進(jìn)行HPLC分析。

另精密量取Na2HPO4?NaH2PO4緩沖液2.7 mL，加入巴利森苷A 儲備溶液0.3 mL，作為巴利森苷A對照組。按照供試組及酶對照組的制備方法對樣品進(jìn)行處理。

2.7 孵育時間對巴利森苷A降解酶活性的影響

精密量取2.3項下粗酶液和Na2HPO4?NaH2PO4緩沖溶液各6.3 mL，分別放入20 mL 的圓底燒瓶中，向2組樣品中各加入2.6項下的巴利森苷A儲備溶液0.7 mL，作為供試組和巴利森苷A 對照組。2 組均在35 ℃水浴條件下進(jìn)行磁力攪拌反應(yīng)，分別在反應(yīng)10、20、30、60、120、180 min 后，取反應(yīng)液1 mL，按照2.6項下方法處理樣品，用于HPLC分析。

2.8 孵育溫度對巴利森苷A降解酶活性的影響

大多數(shù)生物酶在40～50 ℃時具有較高的活性，溫度過高或過低都會影響酶的活性[7]，因此本研究考察了35、45、55、65、75 ℃共5 個不同溫度對巴利森苷A降解酶活性的影響。

分別精密量取2.3 項下的粗酶液2.7 mL 和Na2HPO4?NaH2PO4緩沖液2.7 mL各5份，放入10 mL玻璃小瓶中稱定質(zhì)量，取以上樣品分別在35、45、55、65、75 ℃的水浴條件下孵育20 min，去離子水補足減失的質(zhì)量。在每份樣品中均加入2.6 項下的巴利森苷A 儲備溶液0.3 mL，稱定質(zhì)量，繼續(xù)孵育2 h 后，放涼至室溫，去離子水補足減失的質(zhì)量，作為供試組和巴利森苷A 對照組。按照2.6 項下方法處理樣品，用于HPLC分析。

2.9 葡聚糖凝膠G?200柱色譜分離及酶活檢測

葡聚糖凝膠G?200常規(guī)處理后采用自然沉降法裝柱（100 mm×16 cm），用預(yù)冷的Na2HPO4?NaH2PO4緩沖液在4 ℃冷藏柜中平衡過夜。將2.3 項下得到的粗酶液每4 mL 分裝1 管，冷凍干燥。取10 管凍干樣品溶于去離子水2 mL 中，在4 ℃下用Na2HPO4?NaH2PO4緩沖液透析平衡鹽離子濃度，過0.45 μm濾膜后上樣。采用自動部分接收器收集樣品，洗脫液為Na2HPO4?NaH2PO4緩沖液，流速為0.1 mL·min-1，每管收集2 mL。洗脫結(jié)束后采用紫外?可見分光光度計測定每份樣品在280 nm 處的吸光度，并繪制色譜圖，根據(jù)色譜圖合并各流分，進(jìn)一步采用超濾離心管對各色譜峰樣品進(jìn)行濃縮。采用2.6 項下方法測定各色譜峰組分對巴利森苷A的降解作用。

2.10 SDS?PAGE酶譜分析及相對分子質(zhì)量測定

取2.9項下所得的酶溶液經(jīng)SDS?PAGE進(jìn)行純度鑒定。電泳條件：濃縮膠為5%，電壓為80 V，電泳時間為25 min；分離膠為10%，電壓為120 V，電泳時間為110 min；上樣體積15 μL。電泳結(jié)束后，凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色。脫色后用化學(xué)發(fā)光成相系統(tǒng)拍照。

3 結(jié)果

3.1 不同加工方式對天麻化學(xué)成分的影響

不同加工方式制備的天麻供試品HPLC 圖見圖1，40 ℃低溫烘干組天麻樣品中對羥基苯甲醇（峰2）的峰面積顯著增加，而其他色譜峰均明顯減少或消失（圖1A）。蒸后40 ℃烘干組（圖1B）和冷凍干燥組（圖1C）樣品中出現(xiàn)6 個相同的色譜峰，經(jīng)過與對照品比對分析，確認(rèn)峰1～6 分別為天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C 和巴利森苷A，且蒸后40 ℃烘干組天麻中巴利森苷A 的峰面積明顯高于冷凍干燥組；而冷凍干燥組天麻樣品中對羥基苯甲醇的色譜峰面積高于蒸后40 ℃烘干組樣品。以上結(jié)果說明，鮮天麻中可能含有降解苷類成分的酶，推測不同加工方式獲得的天麻樣品中酶活性不同。蒸制產(chǎn)生的高溫使天麻中的酶迅速失活，阻止了酶對苷類成分的降解；冷凍干燥后的天麻仍具有一定的酶活性，在50%甲醇提取液中，部分苷類成分發(fā)生酶解反應(yīng)，因此巴利森苷A 的含量低于蒸后40 ℃烘干組天麻，對羥基苯甲醇的含量相對較高；鮮天麻在低溫烘干過程中具有較高的酶活性，其中的苷類成分逐漸降解為苷元。

圖1 不同加工方式的天麻樣品及對照品HPLC圖

3.2 巴利森苷A酶解產(chǎn)物分析

結(jié)果表明（圖2），在酶的作用下巴利森苷A 可降解出2 種產(chǎn)物，與對照品色譜圖相比，峰1 和峰2分別為對羥基苯甲醇和巴利森苷B，說明天麻中含有降解巴利森苷A 的酶。結(jié)合不同干燥方式天麻中化學(xué)成分變化情況，在酶的作用下天麻中天麻素及巴利森苷類成分的降解過程見圖3，其中，在自身酶的作用下，巴利森苷A 的降解產(chǎn)物主要為對羥基苯甲醇和巴利森苷B 已經(jīng)得到證實，而巴利森苷A在降解過程中是否也產(chǎn)生巴利森苷C、巴利森苷E及天麻素等產(chǎn)物還有待進(jìn)一步研究。

圖2 巴利森苷A酶解反應(yīng)產(chǎn)物及空白對照HPLC圖

圖3 天麻中天麻素及巴利森苷類成分降解途徑

3.3 孵育時間對巴利森苷A降解酶活性的影響

孵育溫度為35 ℃時，孵育時間對巴利森苷A 色譜峰面積的影響情況見圖4A，隨著孵育時間的延長，巴利森苷A 的色譜峰面積逐漸下降，180 min后巴利森苷A 的色譜峰面積由708 降低為88。說明隨著酶與巴利森苷A 作用時間的延長，巴利森苷A 的降解程度也愈發(fā)顯著。

3.4 孵育溫度對巴利森苷A降解酶活性的影響

孵育時間為2 h時，孵育溫度對巴利森苷A 色譜峰面積的影響情況見圖4B，在孵育時間相同的條件下，隨著孵育溫度的升高，巴利森苷A 的峰面積呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢。溫度達(dá)到45 ℃時，巴利森苷A 的峰面積最低，說明此時降解酶活性最高；隨著溫度的升高，巴利森苷A 的峰面積逐漸升高，說明降解酶活性在逐漸降低；至75 ℃時，與巴利森苷A對照組（峰面積為721）比較，供試組巴利森苷A 的峰面積略有降低，說明在75 ℃的時候，酶基本失活，而減少的峰面積可能是由于巴利森苷A 的熱不穩(wěn)定性導(dǎo)致的[8]。

圖4 孵育時間、溫度對天麻中巴利森苷A峰面積的影響

3.5 葡聚糖凝膠G?200柱色譜分離及酶活性檢測

由葡聚糖凝膠G?200 柱色譜收集到的酶流分在280 nm 下的吸光度變化情況見圖5。顯示酶流分的吸光度從第13 管開始上升，在第13～19 管出現(xiàn)第1個峰（峰a），從第20 管開始吸光度迅速上升，于第25 管達(dá)到最大值后下降，在第20～35 管出現(xiàn)第2 個峰（峰b），而后吸光度逐漸下降，趨近于0。

圖5 葡聚糖凝膠G-200柱色譜分離后天麻粗酶液各流分吸光度

通過比較峰a和峰b流分對巴利森苷A 的降解作用，發(fā)現(xiàn)峰a 流分對巴利森苷A 有較強的降解活性。峰a 流分對巴利森苷A 酶解反應(yīng)及巴利森苷A 對照的HPLC 圖（圖6）顯示，在峰a 流分的作用下巴利森苷A 發(fā)生降解反應(yīng)，與對照品色譜圖對比，確認(rèn)降解產(chǎn)物為對羥基苯甲醇。通過以上結(jié)果可以推測出天麻中含有降解巴利森苷A 的酶。在同樣的反應(yīng)條件下，比較粗酶液與峰a 流分對巴利森苷A 的降解作用，發(fā)現(xiàn)峰a 流分可使巴利森苷A 全部降解為對羥基苯甲醇，推測可能是由于經(jīng)過純化后其酶活性得到提高。進(jìn)一步采用外標(biāo)一點法對產(chǎn)物中羥基苯甲醇的含量進(jìn)行了計算，酶反應(yīng)后樣品中對羥基苯甲醇的濃度為0.06 mmol·L-1，因此巴利森苷A轉(zhuǎn)化為對羥基苯甲醇的摩爾轉(zhuǎn)化率為300%。

圖6 天麻粗酶液流分a對巴利森苷A的酶解反應(yīng)HPLC圖

3.6 SDS?PAGE酶譜分析和相對分子質(zhì)量測定

峰a 流分的SDS?PAGE 凝膠電泳結(jié)果見圖7，可以看出經(jīng)過葡聚糖凝膠G?200 柱色譜純化后除去了大部分的雜蛋白，在峰a的位置上得到了3條明顯且清晰的條帶，相對分子質(zhì)量分別約為75 000、60 000和48 000。

圖7 天麻粗酶液流分a的SDS-PAGE圖

4 討論

在提取粗酶時，本研究考察了檸檬酸?Na2HPO4、Na2HPO4?NaH2PO4等緩沖液對天麻粗酶的提取效果，發(fā)現(xiàn)直接采用緩沖溶液對酶進(jìn)行提取，隨著透析時間的延長，透析袋內(nèi)溶液逐漸渾濁，并且粗酶液的活性隨著沉淀的析出而逐漸降低。推測是由于鮮天麻中含有大量的脂類、多糖等生物大分子，在透析的過程中，降解酶可能會隨著這些成分一起沉淀下來，不利于天麻粗酶的存儲。通過優(yōu)化提取方法，發(fā)現(xiàn)采用丙酮沉淀法對粗酶液進(jìn)行提取后，酶液未出現(xiàn)沉淀，且具有較高的降解活性，為天麻中相關(guān)酶的發(fā)現(xiàn)提供了方法學(xué)參考。

本研究以巴利森苷A 為例，從鮮天麻中發(fā)現(xiàn)并提取了可降解苷類成分的酶，進(jìn)一步考察了溫度和時間對其活性的影響，發(fā)現(xiàn)在45 ℃時，酶的活性最高。通過凝膠柱色譜、超濾等分離方法，從天麻中發(fā)現(xiàn)了對巴利森苷A 有降解活性的酶，經(jīng)過SDS?PAGE 鑒定，其相對分子質(zhì)量為48 000～75 000。以上研究結(jié)果證明鮮天麻中的酶對巴利森苷A 的含量有重要影響，可一定程度上揭示天麻飲片質(zhì)量差異較大的原因，同時為天麻中苷類成分降解酶的特性研究、其他巴利森苷類成分的降解途徑、鮮天麻的儲存及產(chǎn)地加工方法的改進(jìn)提供參考。