2017年-2019年浙江臺州地區(qū)凡納濱對蝦4種病原PCR檢測

劉 順，翁歆之，鄭曉葉，黃 培，賀 潔，鄭青松*

(1.浙江省玉環(huán)市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江玉環(huán) 317600；2.浙江省臺州市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江臺州 318000； 3.浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江杭州 310023)

臺州地區(qū)是浙江省凡納濱對蝦的重要養(yǎng)殖區(qū)，近年來，對蝦養(yǎng)殖過程中各類病害頻發(fā)嚴(yán)重制約當(dāng)?shù)貙ξr養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中的病原有對蝦白斑病毒(White spot syndrome virus,WSSV)、傳染性皮下和造血器官壞死病病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)、高致病性副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus,VP)和蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)。對蝦白斑病毒和高致病性副溶血弧菌往往發(fā)病迅速并造成大量死亡，傳染性皮下和造血器官壞死病毒和蝦肝腸胞蟲則會引起對蝦生長緩慢、規(guī)格參差不齊，這4種病原引起的疫病暴發(fā)會造成對蝦養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失巨大。為了解凡納濱對蝦4種病原在臺州地區(qū)的感染情況，對2017年-2019年該地區(qū)收集的337個(gè)凡納濱對蝦樣品進(jìn)行4種病原的感染情況檢測，總結(jié)4種病原在該地區(qū)的感染和流行情況，以期為此類疫病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2017年-2019年每年5月～9月從浙江臺州地區(qū)海水養(yǎng)殖區(qū)和淡水養(yǎng)殖區(qū)采集凡納濱對蝦蝦苗及中成蝦，蝦苗規(guī)格0.8 cm～1.5 cm，采集樣品量不少于200尾；中成蝦規(guī)格5.0 cm～12.0 cm，取鰓、肝胰腺、腸道和尾部肌肉混合，樣品保存于950 mL/L乙醇中備用。不同養(yǎng)殖方式、不同規(guī)格對蝦分年份采集樣品組成見表1。

1.1.2 主要試劑與儀器 海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；Taq酶和DL 2 000 Marker，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR儀、凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 將保存于950 mL/L乙醇中的樣品取出，先用雙蒸水潤洗1次，再用無菌濾紙吸去多余水分，取適量樣品用于基因組DNA提取，按照海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，DNA樣品保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR檢測 WSSV、IHHNV檢測引物參照文獻(xiàn)[1]中規(guī)定的檢測引物，EHP檢測引物參考文獻(xiàn)[2]，AP檢測引物參考文獻(xiàn)[3](表2)。PCR反應(yīng)體系50 μL：10×PCR buffer(Mg2+plus) 5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 4 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，TakaraTaq酶(5 U/μL) 0.25 μL，模板DNA 2 μL，滅菌水34.75 μL，各組分充分混勻后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并拍照，對比陽性對照電泳條帶位置，擴(kuò)增片段與陽性對照片段位置一致則判定為陽性，并將陽性樣品PCR產(chǎn)物送到生工生物工程(上海)股份有限公司測序驗(yàn)證。

表1 對蝦樣品組成

表2 引物序列信息

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 排除病原混合攜帶情況，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)不考慮病原混合攜帶情況而單獨(dú)計(jì)數(shù)。用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)系數(shù)，以P<0.05表示相關(guān)性顯著，P<0.01表示相關(guān)性極顯著。氣象數(shù)據(jù)來自臺州市氣象局。

2 結(jié)果

2.1 養(yǎng)殖對蝦各病原攜帶情況

2017年-2019年4種病原總體攜帶率EHP>IHHNV>AP>WSSV(表3)。不同年份養(yǎng)殖對蝦WSSV、IHHNV、AP、EHP 4種病原的攜帶率分別為2017年1.98%、36.64%、7.92%、51.49%；2018年4.03%、23.39%、4.84%、45.97%；2019年0、29.46%、10.71%、27.68%。檢測的4種病原2017年和2018年攜帶率均為EHP>IHHNV>AP>WSSV，2019年為IHHNV>EHP>AP>WSSV。2017年-2019年臺州地區(qū)養(yǎng)殖凡納濱對蝦不同年份EHP的攜帶情況差異極顯著(P<0.01)，且不同年份EHP攜帶率呈逐年下降趨勢；不同年份WSSV、IHHNV和AP的攜帶情況均無顯著差異(P>0.05)，同時(shí)3種病原不同年份的攜帶情況變化趨勢亦均不明顯(圖1)。

圖1 2017年-2019年各病原攜帶趨勢變化

2.2 不同規(guī)格養(yǎng)殖對蝦病原攜帶情況

2017年-2019年IHHNV、AP和EHP在蝦苗和中成蝦中總體攜帶率較為一致，均為蝦苗>中成蝦，WSSV攜帶率則為中成蝦>蝦苗。不同年份EHP在蝦苗和中成蝦中攜帶率均為蝦苗>中成蝦，IHHNV和AP則在2017年和2018年為蝦苗>中成蝦，2019年為蝦苗<中成蝦。不同年份IHHNV在蝦苗和中成蝦中攜帶情況差異顯著(P<0.05)；不同年份EHP在蝦苗和中成蝦中攜帶情況差異極顯著(P<0.01)；而不同年份WSSV和AP分別在蝦苗和中成蝦中攜帶情況則均無顯著差異(P>0.05)(表4)。

表3 2017年-2019年4種病原檢測總體情況

表4 4種病原在蝦苗與中成蝦中檢測結(jié)果

2.3 不同養(yǎng)殖水體對蝦病原攜帶情況

2017年-2019年不同年份IHHNV和AP攜帶率均呈現(xiàn)出海水>淡水，但不同年份IHHNV在海水與淡水養(yǎng)殖對蝦的攜帶情況差異顯著(P<0.05)，AP的攜帶情況無顯著差異(P>0.05)；EHP攜帶率2017年海水養(yǎng)殖對蝦略高于淡水養(yǎng)殖對蝦，2018年和2019年則均為淡水養(yǎng)殖對蝦>海水養(yǎng)殖對蝦，但各年份海、淡水養(yǎng)殖對蝦無顯著差異(P>0.05)；WSSV總體攜帶率為淡水養(yǎng)殖對蝦>海水養(yǎng)殖對蝦，其中2017、2018年攜帶率均為淡水養(yǎng)殖對蝦>海水養(yǎng)殖對蝦，2019年則未檢出陽性樣品，各年份海、淡水養(yǎng)殖對蝦無顯著差異(P>0.05)(表5)。

2.4 不同病原混合攜帶情況

對2017年-2019年全部337份樣品檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，檢測到4種病原混合攜帶樣品共41例，其中二重病原攜帶檢出4個(gè)類型共38例，IHHNV+EHP攜帶率最高，陽性樣品數(shù)/攜帶率分別為29/8.61%；其次為AP+EHP，對應(yīng)的陽性樣品數(shù)/攜帶率分別為5/1.48%，WSSV+IHHNV和IHHNV+AP的攜帶率較低，對應(yīng)的陽性樣品數(shù)/攜帶率分別為2/0.59%、2/0.59%。三重病原攜帶檢出2個(gè)類型共3例，分別為WSSV+IHHNV+EHP、IHHNV+EHP+AP，對應(yīng)的陽性樣品數(shù)/攜帶率分別為1/0.30%、2/0.59%，未檢測到其他混合攜帶情況。

2.5 各病原攜帶與環(huán)境因子的關(guān)系

通過對2017年-2019年5月～9月的月平均降水量、月平均氣溫與各病原攜帶率的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，各病原攜帶率與月平均降水量無明顯相關(guān)性，月平均氣溫則與IHHNV和AP均呈顯著正相關(guān)(表6)，說明氣溫顯著影響IHHNV和AP的發(fā)生。

表5 海水、淡水不同養(yǎng)殖水體檢測結(jié)果

表6 環(huán)境因子與各病原攜帶率相關(guān)性

3 討論

2017年-2019臺州地區(qū)養(yǎng)殖對蝦WSSV、IHHNV、AP、EHP 4種病原中EHP的總體攜帶率最高，達(dá)到41.54%，其蝦苗攜帶率高達(dá)55.56%。IHHNV為第2高攜帶率的病原，與全省蝦苗IHHNV攜帶情況相比[4]，臺州地區(qū)蝦苗IHHNV攜帶率明顯高于全省整體水平，說明當(dāng)?shù)谽HP和IHHNV的流行較為嚴(yán)重，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)2種病原的動態(tài)監(jiān)測和防控工作。AP是2010年新確認(rèn)病原[5]，2013年-2016年浙江省養(yǎng)殖對蝦副溶血弧菌源AP毒力因子的攜帶率為10.34%[6]，遠(yuǎn)低于調(diào)查的8個(gè)省市的平均水平33.11%，說明該病原在浙江省內(nèi)的流行范圍有限。

4種病原中EHP、IHHNV和AP在蝦苗中的攜帶率高于中成蝦。成蝦比小規(guī)格蝦的EHP感染率更高[7]，本研究發(fā)現(xiàn)蝦苗EHP攜帶率更高。臺州地區(qū)對蝦苗種來源于福建、廣東、海南等地區(qū)，蝦苗在放養(yǎng)之前已攜帶病原的風(fēng)險(xiǎn)較高，此外，剛放養(yǎng)的蝦苗受水質(zhì)環(huán)境改變影響也更容易感染病原。WSSV在蝦苗和中成蝦中的攜帶率都較低。本次調(diào)查臺州地區(qū)養(yǎng)殖蝦苗和中成蝦的WSSV攜帶率均低于全省水平，說明近幾年WSSV攜帶率整體呈下降趨勢。

對蝦WSSV、IHHNV、EHP等病原分別與自然海區(qū)和養(yǎng)殖環(huán)境中的甲殼類[8]、貝類[9]、豐年蟲[10]以及藻類[11]之間等存在交叉感染，AP因在水體環(huán)境、沉積物中含量豐富，當(dāng)環(huán)境改變或被攝食也更容易成為條件致病菌感染養(yǎng)殖對蝦。相比較其他幾種病原，本研究發(fā)現(xiàn)IHHNV在海水養(yǎng)殖對蝦中攜帶率高于淡水養(yǎng)殖對蝦，說明鹽度對IHHNV感染對蝦具有一定影響，與文獻(xiàn)[12]結(jié)果相反。臺州溫嶺、玉環(huán)、三門等地作為蝦貝混養(yǎng)的重要地區(qū)，不同生物間病原存在交叉感染、垂直傳播風(fēng)險(xiǎn)，以及養(yǎng)殖過程中環(huán)境改變、餌料質(zhì)量、日常管理等問題也是對蝦IHHNV高攜帶率的重要原因。

本研究中的4種病原均有混合攜帶情況，包括4種二重病原攜帶類型和2種三重病原攜帶類型，在所有混合病原攜帶情況中IHHNV+EHP的混合攜帶率最高，三重病原攜帶類型相對較少。各病原混合攜帶樣品數(shù)在所有該病原陽性樣品中比例分別為WSSV 42.86%、IHHNV 36.36%、AP 34.62%、EHP 26.43%，可知WSSV陽性樣品中混合攜帶比例較高，而IHHNV則在6種混合攜帶類型中占5種，說明IHHNV混合攜帶情況更為普遍。目前研究報(bào)道對蝦病原混合攜帶的類型有WSSV+IHHNV[13]、IHHNV+EHP[14]、EHP+AP[15]。也檢測到目前尚未報(bào)道的類型，反映出臺州地區(qū)病原混合攜帶類型較復(fù)雜。

IHHNV的流行與溫度有中度相關(guān)性[16]，AP在低溫季節(jié)養(yǎng)殖對蝦患病機(jī)率低于高溫季節(jié)[17]，與本研究結(jié)論相一致。

臺州地區(qū)養(yǎng)殖凡納濱對蝦4種病原的攜帶存在不同程度的流行情況，各病原的攜帶主要與蝦苗水平傳播、養(yǎng)殖環(huán)境因子改變誘發(fā)等有關(guān)。在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中各病害的發(fā)生應(yīng)以預(yù)防為主，蝦苗應(yīng)選用SPF苗種、合理控制放養(yǎng)密度、適時(shí)調(diào)節(jié)水質(zhì)、科學(xué)合理投餌等手段預(yù)防疫病發(fā)生。對于WSSV、IHHNV等病毒性疾病目前尚無特效藥，應(yīng)從加強(qiáng)親本、苗種、幼蝦、成蝦全鏈條的檢疫檢測入手進(jìn)行有效防控，AP、EHP等疫病的防控應(yīng)注重養(yǎng)殖前期環(huán)境的管理，同時(shí)可合理使用漁用標(biāo)準(zhǔn)藥物防治。