mcr基因介導(dǎo)的多黏菌素耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

張琳慧，蘇夢茹，王 卓，王 娟

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊陵 712100)

抗生素廣泛使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥問題日趨嚴(yán)重，細(xì)菌耐藥性成為21世紀(jì)人類和養(yǎng)殖業(yè)的最大威脅之一[1]。如攜帶抗多黏菌素基因mcr(mcr1-9)的大腸埃希氏菌等不斷被報(bào)道，甚至在臨床培養(yǎng)的大腸埃希氏菌菌株上也分離出來mcr-1基因。細(xì)菌對(duì)于多黏菌素的耐藥性被認(rèn)為是與染色體突變有關(guān)，而由質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因mcr-1可在同一菌種或不同菌種間水平傳播。研究mcr-1基因的來源特征與抗多黏菌素耐藥機(jī)制之間的關(guān)系，對(duì)評(píng)估m(xù)cr-1基因的傳播和深入研究耐藥菌的耐藥機(jī)制和存活方式有參考價(jià)值。

1 mcr基因特征及其介導(dǎo)的耐藥機(jī)制

1.1 mcr-1基因的發(fā)現(xiàn)及分布

當(dāng)微生物長期暴露于不同抗生素下，細(xì)菌的基因容易發(fā)生突變，即產(chǎn)生抗菌抗性(AMR)。對(duì)腸埃希氏菌科細(xì)菌耐多黏菌素研究中，部分耐藥菌株卻未測得耐藥基因(pmrAB,phoPQ和mgrB)陽性，在進(jìn)一步接合轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移使受體菌獲得多黏菌素耐藥性，對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行全序列測序，并命名為mcr-1，它是一種質(zhì)粒介導(dǎo)腸桿菌科細(xì)菌免受黏菌素的侵害，改變細(xì)菌對(duì)抗生素敏感性的基因[2]。細(xì)菌的耐藥性產(chǎn)生是通過染色體突變的形式，由于染色體突變的隨機(jī)性，耐藥菌在理論上不會(huì)出現(xiàn)大規(guī)模的增殖和富集，而mcr-1基因被發(fā)現(xiàn)后，該基因是由質(zhì)粒介導(dǎo)在菌群間水平傳播，極大地增加了耐藥性傳播的風(fēng)險(xiǎn)性[3]。mcr-1的發(fā)現(xiàn)引起世界各國對(duì)該基因的重視，有38個(gè)國家/地區(qū)分離出mcr-1陽性樣品，有的國家/地區(qū)已發(fā)現(xiàn)mcr-1的變異體mcr-2；非洲有突尼斯、埃及、阿爾及利亞、尼日利亞和南非；北美洲的加拿大和美國，南美洲阿根廷、厄瓜多爾和巴西以及澳大利亞等國家也有mcr-1的報(bào)道[4]。

對(duì)豬場糞便樣品耐藥菌株檢測中發(fā)現(xiàn)122份樣品有86株耐藥菌株，經(jīng)PCR檢測出63株mcr-1陽性菌株(均為大腸埃希氏菌)[5]，耐藥發(fā)生率和mcr-1陽性率分別高達(dá)70%和51%。豬場中高耐藥發(fā)生率說明抗生素的濫用已經(jīng)引起了嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥問題，豬場檢測樣品mcr-1基因高陽性率表明豬場很可能是此耐藥基因的發(fā)源地，并且豬場生產(chǎn)過程中已經(jīng)有一定程度的流行，大腸埃希氏菌是其傳播的主要載體，可實(shí)現(xiàn)不同親緣關(guān)系菌株間的傳播。鑒于豬場的mcr-1基因的廣泛流行和傳播，進(jìn)一步對(duì)豬場相關(guān)產(chǎn)品的流向線索分析，監(jiān)測動(dòng)物產(chǎn)品，貫穿豬場的水源，污水廢水以及周圍土壤m(xù)cr-1基因的陽性率，結(jié)果顯示在豬場的各個(gè)環(huán)節(jié)中已經(jīng)有大量的mcr-1基因，且泥土中含量較大[6]。說明動(dòng)物體內(nèi)大腸埃希氏菌攜帶的mcr-1基因已經(jīng)向周圍環(huán)境擴(kuò)散，且可長時(shí)間積聚于環(huán)境中。由于豬場mcr-1基因的流行情況，在其他畜產(chǎn)品生產(chǎn)過程中也應(yīng)定期監(jiān)測mcr-1耐藥基因的陽性率，重點(diǎn)監(jiān)測流動(dòng)性較差的相關(guān)物品，分析比對(duì)數(shù)據(jù)，追溯耐藥性傳播的源頭，做好污水污物無害化處理，延緩耐藥性的傳播和發(fā)展。

1.2 mcr-1基因的序列多樣性及其變異體

mcr-1基因全長1 626 bp,G+C含量49%。預(yù)測該基因編碼mcr-1蛋白，由N-末端的5個(gè)跨膜域和催化域組成，跨膜區(qū)和底物結(jié)合位點(diǎn)作用從而改變菌株的耐藥特性[4]。在mcr-1基因的研究中發(fā)現(xiàn)了一種新的多黏菌素耐藥基因mcr-2，與mcr-1一致性為76.75%，其序列的基因環(huán)境也非常相似，同樣插有插入元件IS1595超家族和297 bp的開放閱讀框(ORFs)編碼以及與mcr-1基因編碼蛋白相似的蛋白[7]。mcr-3、mcr-1和mcr-2僅有45.0%和47.0%的核酸序列和氨基酸序列一致性。但在多黏菌素耐藥性表達(dá)上mcr-1變異體與mcr-1無明顯差別[8]。mcr-3發(fā)現(xiàn)不久，mcr-4也被發(fā)現(xiàn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10種mcr家族基因(mcr-1～mcr-10)[9]，作為mcr-1的變異體，其在細(xì)菌間水平傳播和引起多黏菌素耐藥性也應(yīng)引起注意。

1.3 mcr-1的傳播及耐藥機(jī)制

該基因突破了人們對(duì)細(xì)菌耐藥性主要由染色體突變引起的認(rèn)知，其在不同菌株之間基因轉(zhuǎn)移方式也不同，mcr-1由可攜帶基因質(zhì)粒所介導(dǎo)轉(zhuǎn)移或是僅其上游序列單獨(dú)轉(zhuǎn)移。mcr-1基因主要位于IncI2、IncI1、IncHI2、IncHI1、Incp、IncX4、IncFI、IncFII、IncN和IncK等不相容分型的細(xì)菌質(zhì)粒上，以IncI2和IncK最為常見[4]。mcr-1由宿主質(zhì)粒介導(dǎo)傳播，可通過接合試驗(yàn)或者轉(zhuǎn)化試驗(yàn)將大腸埃希氏菌中的mcr-1轉(zhuǎn)移到其他菌株，接合子的MIC值在某些菌株上可能也會(huì)出現(xiàn)變化，mcr-1基因既可在腸桿菌科中傳播，也可傳播到腸桿菌科外的細(xì)菌，基因水平上可以在大部分自然界微生物中移動(dòng)和通過生物鏈傳播，導(dǎo)致多黏菌素耐藥率增加。

多黏菌素是陽離子多肽，包括5種化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的復(fù)合物(多黏菌素A～E)[4]。其作用機(jī)制主要是與革蘭氏陰性菌外膜中帶有負(fù)電荷的脂多糖(LPS)相互作用破環(huán)細(xì)菌細(xì)胞，而多黏菌素耐藥大多數(shù)與LPS的修飾有關(guān)，以前認(rèn)為耐藥性是染色體突變引起，是由染色體介導(dǎo)的雙分組信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)失調(diào)(如PrmABh和phoPQ)及其特異性突變引起[10]。直到發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因mcr-1具有與細(xì)菌內(nèi)磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶家族相似活性，磷酸乙醇胺基團(tuán)(PEtN)可以在其轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)移到LPS的類脂A上，其編碼的mcr-1蛋白跨膜域能夠固定于細(xì)胞內(nèi)膜并且一定程度上改變細(xì)胞膜的構(gòu)象，在細(xì)胞周質(zhì)中也可以完成對(duì)LPS的共價(jià)修飾，導(dǎo)致LPS的凈負(fù)電荷降低使細(xì)菌與帶正電的多黏菌素靜電作用降低，引起耐藥性的發(fā)生[11]。

2 mcr-1基因的陽性率與動(dòng)物和環(huán)境的關(guān)系

mcr-1基因多由大腸埃希氏菌攜帶，在多個(gè)國家(地區(qū))多種樣品中檢測到mcr-1陽性，樣品來源包括人和其他動(dòng)物腸道、排泄物、動(dòng)物性食品(肉、牛奶及乳制品等)，動(dòng)物生產(chǎn)排放的污水、廢水、各地河流土壤、海洋、水產(chǎn)養(yǎng)殖、多種新鮮蔬菜及糧食生產(chǎn)的不同階段。mcr-1已廣泛存在于環(huán)境中。

2.1 動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品mcr-1基因的高發(fā)生率

在比利時(shí)的一項(xiàng)研究中分析了多種動(dòng)物源的大腸埃希氏菌耐藥分離株[12]，100%的分離株至少攜帶1個(gè)可移動(dòng)性mcr基因(mcr-1～mcr-9)，其中mcr-1基因最常見。在1個(gè)小牛犢分離株同時(shí)檢測到了3種mcr基因(mcr-1、mcr-3和mcr-5)，并且3種基因由3種不同的質(zhì)粒攜帶，該分離株對(duì)12種抗生素具有耐藥性。如果該菌株在醫(yī)學(xué)臨床引起致病性，將存在極大的潛在醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)。在對(duì)比來自于不同地域的4株分離株mcr-1圖譜時(shí)，mcr-1基因沒有表現(xiàn)顯著的克隆性，但對(duì)其相似的多黏菌素的抗藥性分析，可能是mcr-1基因部分序列控制對(duì)多黏菌素的耐藥性，在水平傳播中發(fā)生基因重組現(xiàn)象，也有可能出現(xiàn)基因突變產(chǎn)生基因差異。mcr-1基因突變讓人擔(dān)憂其他更嚴(yán)重的未知耐藥性的產(chǎn)生，在發(fā)現(xiàn)耐藥菌株時(shí)最好進(jìn)行全序列測序，監(jiān)測mcr-1基因的同時(shí)也應(yīng)關(guān)注mcr-1相似序列基因及其表達(dá)產(chǎn)物，是否對(duì)其他抗生素出現(xiàn)耐藥性?？捎捎H緣關(guān)系較遠(yuǎn)的大腸埃希氏菌中不同質(zhì)粒(對(duì)于mcr-1)所介導(dǎo)，也印證了mcr-1基因可在不同科屬間水平傳播，該基因如何在不同質(zhì)粒間轉(zhuǎn)移值得進(jìn)一步研究。

有報(bào)道從78%的生牛肉和53%的即食牛肉中分離出了大腸埃希氏菌，3.8%菌株帶有mcr-1基因[13]。mcr-1基因已經(jīng)存在動(dòng)物食品中，食品污染途徑主要有兩種，環(huán)境污染和本身攜帶有該種細(xì)菌。由于發(fā)展中國家抗生素監(jiān)管機(jī)制和屠宰環(huán)境衛(wèi)生保證較發(fā)達(dá)國家有待改善，更應(yīng)加強(qiáng)對(duì)mcr-1的檢測。全球一體化的發(fā)展和物流貿(mào)易，動(dòng)物產(chǎn)品大范圍流通使耐藥基因成了一個(gè)全球性問題。在中國一例腹瀉兒童中發(fā)現(xiàn)與其他區(qū)域高度同源的mcr-1基因[14]，這說明該基因已經(jīng)實(shí)現(xiàn)跨區(qū)域傳播，未來在進(jìn)出口貿(mào)易中應(yīng)更加深入監(jiān)測。

在檢查一批初產(chǎn)沒有乳腺炎病史的荷斯坦奶牛時(shí)[15]，取20頭奶牛的牛奶樣品并觀察乳頭皮膚微生物菌群，分離培養(yǎng)出大量的革蘭氏陰性菌。革蘭氏陰性菌是mcr-1基因的良好載體。乳頭皮膚分離培養(yǎng)出大量的革蘭氏陰性菌說明在牛乳制品中也存在同種細(xì)菌，全球每年都要消耗數(shù)以億噸的牛奶，如果牛奶作為耐藥基因從動(dòng)物傳播到人，其流行規(guī)模將難以控制。雖然目前尚未在牛乳制品中檢測到mcr-1，但分離出大量革蘭氏陰性菌，在之后的生產(chǎn)中還需要密切關(guān)注檢測牛乳制品的微生物含量。

在孟加拉國家禽腸道中也檢測到mcr-1基因[16]。在多個(gè)國家(地區(qū))無論是活體動(dòng)物、食用動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品中，都檢測出了mcr-1基因，表明其已經(jīng)在動(dòng)物及其相關(guān)產(chǎn)品中傳播，進(jìn)一步也會(huì)通過食物傳播給人類[17]，人們在食用了這種食品后如果引發(fā)耐藥菌株感染，多黏菌素也即將失效，將面臨無藥可用的地步。

2.2 mcr-1陽性基因在自然環(huán)境中的分布

mcr-1陽性基因在污水廢水中存在比較集中[18]。在中國臺(tái)灣對(duì)淡水系統(tǒng)mcr-1陽性大腸埃希氏菌分布的研究中[19]，分別在不同區(qū)域采樣發(fā)現(xiàn)mcr-1陽性大腸埃希氏菌占5.9%，約71%陽性樣品來自河的下游地區(qū)，陽性分布率與中國臺(tái)灣沿河地區(qū)的畜禽密度顯著有關(guān)。中國臺(tái)灣的自然環(huán)境已經(jīng)被mcr-1陽性細(xì)菌所污染，耐藥菌株的分布與家畜種群密度呈正相關(guān)，表明河流中mcr-1陽性大腸埃希氏菌的污染很有可能來源于人為活動(dòng)，是存在于畜群中的mcr-1基因向周圍環(huán)境傳播或者未經(jīng)無害化處理的養(yǎng)殖污水廢水導(dǎo)致了河流的污染。對(duì)河流分離細(xì)菌株進(jìn)一步分析，對(duì)攜帶河流菌株mcr-1基因的質(zhì)粒與畜禽養(yǎng)殖場中分離的mcr-1基因的質(zhì)粒進(jìn)行測序比較，4種細(xì)菌抗性是同一種質(zhì)粒編碼，2種不同來源的質(zhì)粒表現(xiàn)出了顯著的相似性，表明自然環(huán)境中的mcr-1基因是來源畜禽養(yǎng)殖。

2.3 mcr-1基因在食物鏈中的傳播

畜禽養(yǎng)殖場是mcr-1基因的發(fā)源地，養(yǎng)殖場產(chǎn)生的排泄物、廢水進(jìn)入土壤引起水源污染，該基因可通過水資源積聚于植物中，進(jìn)而擴(kuò)散到草食動(dòng)物和肉食動(dòng)物中，最終傳播到人類。若不加以控制，mcr-1基因可通過食物鏈的傳播，遍及植物、動(dòng)物和自然環(huán)境，導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)更大范圍內(nèi)細(xì)菌耐藥性。在中國的一項(xiàng)常規(guī)監(jiān)測中[20]，從豬肉產(chǎn)品中分離出了一種高度可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒介導(dǎo)的大腸埃希氏菌抗性基因mcr-1，與臨床住院的患者分離出的耐藥株進(jìn)行測序比較，發(fā)現(xiàn)其中有1%帶有這種新的耐藥基因。表明動(dòng)物源mcr-1基因已經(jīng)通過食物鏈的傳播導(dǎo)致了臨床病例耐藥性的發(fā)生。

3 mcr-1基因的傳播風(fēng)險(xiǎn)和遏制策略

3.1 mcr-1耐藥基因流行風(fēng)險(xiǎn)

mcr-1陽性基因已經(jīng)在我國養(yǎng)殖場中廣泛流行，其中以質(zhì)粒介導(dǎo)的水平傳播為主[21]。mcr-1基因以質(zhì)粒為載體實(shí)現(xiàn)基因水平上微生物內(nèi)的廣泛傳播，通過食物鏈可以在動(dòng)植物以及人類大范圍流行，具有比其他耐藥性更大的流行風(fēng)險(xiǎn)?？股卦?jīng)作為人類對(duì)抗細(xì)菌最有效的手段之一，而今耐藥基因嚴(yán)峻的流行情況，導(dǎo)致未來的抗生素可能無法再發(fā)揮其顯著的效果，在面臨耐藥菌株感染時(shí)將會(huì)出現(xiàn)無藥可用的地步。

3.2 應(yīng)對(duì)策略

3.2.1 控制獸醫(yī)臨床抗生素使用量 禁止黏菌素作為生長促進(jìn)劑使用后[22]，多黏菌素預(yù)混物使用量下降，豬和禽的養(yǎng)殖場中耐碳青霉烯大腸埃希菌病顯著下降，人類感染中分離的耐碳青霉烯大腸埃希菌也明顯降低。表明控制畜牧生產(chǎn)中抗生素的使用量十分有必要。因此，國家應(yīng)及時(shí)嚴(yán)格控制抗生素的使用量，降低耐藥菌株的產(chǎn)生。

3.2.2 加強(qiáng)對(duì)抗生素的區(qū)域使用監(jiān)測 掌握抗生素使用的合理數(shù)據(jù)十分有必要，以區(qū)域抗生素使用數(shù)據(jù)預(yù)估常見菌的耐藥趨勢，為降低耐藥性的發(fā)生采取適當(dāng)?shù)母深A(yù)措施。同時(shí)探索經(jīng)濟(jì)的抗生素殘留物處理措施加以推廣，可以有效的減少耐藥基因從動(dòng)物向環(huán)境的傳播，在一定程度上也阻斷了耐藥基因通過生物鏈傳播。

3.2.3 防止感染 對(duì)當(dāng)?shù)氐谋O(jiān)測數(shù)據(jù)進(jìn)行合理的臨床評(píng)估，制定合理的藥物使用方案，減少疾病的發(fā)生，防止人類和動(dòng)物的感染，從根源上減少抗生素的使用。

4 展望

隨著抗生素使用耐藥性問題日趨復(fù)雜，抗多重耐藥革蘭氏陰性菌的防線也即將“失守”。人們首次發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因mcr-1及其變異體，對(duì)其來源、結(jié)構(gòu)、傳播機(jī)制、耐藥機(jī)制以及對(duì)人類、動(dòng)物和環(huán)境的影響進(jìn)行了探究。本文就mcr基因的發(fā)現(xiàn)分布及其傳播和引起多黏菌素耐藥性的機(jī)制，與人、動(dòng)物環(huán)境的關(guān)系和傳播風(fēng)險(xiǎn)等研究進(jìn)展簡要綜述，以期對(duì)多黏菌素耐藥性的認(rèn)識(shí)和mcr基因的研究提供參考。