細(xì)菌生物被膜形成的調(diào)控機(jī)制與消除方法

宋雪艷，劉志歡，謝翠萍，劉營(yíng)營(yíng)，楊永亞，劉建華

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450002)

細(xì)菌生物被膜(biofilm，BF)是細(xì)菌黏附在惰性或活性物體表面自行繁殖，并包圍在多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)等分泌物中，形成具有特殊復(fù)雜結(jié)構(gòu)的高度組織化、系統(tǒng)化的膜樣聚合物[1]。BF是細(xì)菌在紫外線輻射、極端溫度或pH、高鹽、高壓、營(yíng)養(yǎng)不良、抗生素作用等狀態(tài)下，形成的自我保護(hù)機(jī)制[2]。90%以上的微生物可以形成BF，BF可出現(xiàn)于自然、人工及宿主體內(nèi)等任何生態(tài)系統(tǒng)中。在BF的保護(hù)下，細(xì)菌耐藥性、抗吞噬性、致病性及黏附性等均有所提高，導(dǎo)致感染性疾病反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，因此掌握其形成的調(diào)控機(jī)制，尋找快速有效的清除方法非常必要。本文概括了BF的形成過程及影響因素、結(jié)構(gòu)特性和調(diào)控機(jī)制，并對(duì)目前常用的BF消除方法進(jìn)行綜述。

1 生物被膜形成過程及影響因素

BF的形成是一種動(dòng)態(tài)過程，與胞外多糖的產(chǎn)生、細(xì)胞遷移、亞群分化和相互作用密切相關(guān)，有黏附、聚集、成熟、脫落四個(gè)步驟[3]。首先細(xì)菌黏附在物體表面，形成單菌落，并被自身分泌物不斷包裹形成微菌落。細(xì)菌在非生物表面的黏附主要通過氫鍵、范德華力、疏水作用力等相互作用；而在組織表面的黏附則主要通過黏附素等分子間的結(jié)合作用。細(xì)菌在黏附過程中是可逆的，此時(shí)BF尚不成熟，對(duì)抗生素的抵抗力不強(qiáng)，應(yīng)用抗生素治療會(huì)取得很好的效果[4]。多糖黏附素是在由ica操縱子功能基因編碼的酶催化合成，在不可逆的微菌落聚集過程中發(fā)揮主要作用[5-6]。隨后，多個(gè)微菌落融合并向上生長(zhǎng)，并不斷聚集，形成成熟的BF，其結(jié)構(gòu)類似蘑菇狀。BF成熟后期，隨著酚溶性調(diào)節(jié)肽等物質(zhì)的作用[7]，部分細(xì)菌從BF上脫落下來(lái)，進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)過程。細(xì)菌BF成熟后，由于胞外聚合物的屏障作用，膜內(nèi)菌株的新陳代謝速率會(huì)降低，進(jìn)而形成休眠體，此時(shí)菌株相關(guān)耐藥基因被激活，產(chǎn)生胞外酶[8]，導(dǎo)致了生物被膜菌的耐藥。BF形成過程中，細(xì)菌的鞭毛、菌毛及其分泌物也有很重要的作用[9]。有研究表明鞭毛介導(dǎo)的泳動(dòng)及Ⅳ型菌毛介導(dǎo)的蹭動(dòng)對(duì)早期細(xì)菌BF的形成意義重大[4,10]。

2 生物被膜結(jié)構(gòu)特性

在自然條件下，幾乎所有的細(xì)菌都能以BF的形式存在，BF具有獨(dú)特的宏觀及微觀結(jié)構(gòu)、不均一性、流體黏滯性和固體彈性等綜合性質(zhì)[11]，可調(diào)節(jié)其自身結(jié)構(gòu)以適應(yīng)內(nèi)部和外部變化，使細(xì)菌有很強(qiáng)的耐藥性和免疫逃避能力。研究表明，BF由內(nèi)至外分為基質(zhì)層、條件層、連接層、生物被膜層。成熟的細(xì)菌BF的微菌落間分布有水通道，主要用于運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和廢物。細(xì)菌BF的緊密程度、厚薄度及其形態(tài)因細(xì)菌種類、生長(zhǎng)環(huán)境、附著表面、營(yíng)養(yǎng)情況的不同而不同[12]。不同的細(xì)菌物種在相同的條件下會(huì)形成不同的BF，相同的細(xì)菌物種在不同的條件下也會(huì)形成不同的BF。如細(xì)菌根據(jù)環(huán)境的不同形成固體或液體等形式的BF[13]，表達(dá)不同的耐藥基因?qū)е录?xì)菌耐藥。BF的形成能力與溫度和接觸材料有一定的關(guān)系[14]，25℃相較于37℃、15℃等其他溫度，玻璃相較于聚苯乙烯、不銹鋼等其他材料，都更有利于形成BF。細(xì)菌在BF中占比很少，水分含量可高達(dá)97%，其余大多是胞外多糖、核酸、磷脂等成分。連接細(xì)菌的細(xì)胞外基質(zhì)組分之間的差異及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)多少的變化等都會(huì)導(dǎo)致不同結(jié)構(gòu)的微菌落或被膜結(jié)構(gòu)。浮游態(tài)和BF狀態(tài)是細(xì)菌的兩種不同的生命模式。位于BF不同位置的細(xì)菌在體積大小和代謝活性等方面均存在顯著差異。BF淺層細(xì)菌之間養(yǎng)料、氧氣、酶等都很充分，代謝活躍；而BF深層的細(xì)菌不易獲得養(yǎng)料和氧氣等物質(zhì)，代謝緩慢，細(xì)胞分裂很少，體積較小，大多處于休眠狀態(tài)，對(duì)抗菌藥物不敏感。位于BF深層的細(xì)菌抵抗抗生素的能力是浮游細(xì)菌的1 000倍[4]。

3 生物被膜形成的調(diào)控機(jī)制

細(xì)菌生長(zhǎng)過程中，會(huì)分泌一些物質(zhì)，而這些物質(zhì)可以作為生物信號(hào)分子，并通過一些信號(hào)調(diào)控途徑在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間傳遞信息，使細(xì)菌在多細(xì)胞水平上協(xié)調(diào)統(tǒng)一相互配合，以完成一些重要的生理學(xué)功能，其中包括BF的形成。這些信號(hào)調(diào)控途徑主要有群體感應(yīng)系統(tǒng)、環(huán)二鳥苷酸系統(tǒng)和多糖調(diào)控系統(tǒng)等。

群體感應(yīng)系統(tǒng)是細(xì)菌產(chǎn)生和檢測(cè)信號(hào)分子的過程，并以細(xì)胞密度依賴的方式來(lái)協(xié)調(diào)它們的行為，可調(diào)控BF的形成。其信號(hào)傳遞分子即自誘導(dǎo)因子，能感知周圍同類細(xì)菌的密度，并根據(jù)細(xì)菌密度的增加而增加。當(dāng)增加到一個(gè)臨界濃度時(shí)，群體感應(yīng)系統(tǒng)信號(hào)調(diào)控胞外多糖、黏附素、表面活性劑等物質(zhì)的產(chǎn)生，從而影響B(tài)F的形成[15-16]。

研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)二鳥苷酸系統(tǒng)在調(diào)控細(xì)菌BF形成過程中具有重要作用。BF的形成與環(huán)二鳥苷酸系統(tǒng)的濃度有關(guān)，當(dāng)環(huán)二鳥苷酸系統(tǒng)濃度低時(shí)，細(xì)菌的一些運(yùn)動(dòng)基因表達(dá)增加，不易形成BF；當(dāng)環(huán)二鳥苷酸系統(tǒng)濃度高時(shí)，細(xì)胞黏附因子的產(chǎn)生會(huì)增多，胞外基質(zhì)分泌也會(huì)增加，使細(xì)菌更易黏附在細(xì)胞或生物材料表面，有利于BF的形成[17]。

多糖是維持BF結(jié)構(gòu)的主要成分，有利于細(xì)菌與物體表面的黏附。因而多糖調(diào)控系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌BF的形成扮演著舉足輕重的角色。如銅綠假單胞菌，其胞外多糖Psl、Pel是Ⅳ型菌毛非依賴性小菌落所必需的，對(duì)銅綠假單胞菌BF形成后期的亞群相互作用和大菌落形成必不可少[18-19]。

4 生物被膜清除方法

BF的控制和清除可以從抑制細(xì)菌的初始黏附和破壞成熟的BF結(jié)構(gòu)入手，方法主要有物理清除方法、生物化學(xué)清除方法、中藥清除方法等。

4.1 物理清除方法

控制BF的物理方法有超聲波、低電流、紫外燈照射、噴射清洗、高溫清洗等。研究顯示低頻超聲單獨(dú)作用時(shí)不能影響B(tài)F，但與抗生素聯(lián)用后，能破壞BF結(jié)構(gòu)，使活菌數(shù)量顯著降低[20]；電流可以影響細(xì)菌BF結(jié)構(gòu)中菌體的數(shù)量，且能增強(qiáng)抗生素的殺菌效果。細(xì)菌黏附初期是可逆的，所以此時(shí)用紫外燈照射、清洗、加熱等物理方法，就能夠有效清除BF。因此，在生物被膜形成的適宜階段進(jìn)行物理清除可取得一定的效果。

4.2 生物化學(xué)清除方法

研究表明，金屬螯合劑、抗菌藥物、抗菌多肽、表面活性劑、過氧化氫、酒精等都可以破壞BF的形成。EDTA是最常見的金屬螯合劑，能降低混合細(xì)菌的黏附度，抑制BF的形成[21]。當(dāng)使用單一抗菌藥物時(shí)，一些細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生各自的耐藥機(jī)制，進(jìn)而對(duì)該抗菌藥物耐藥，并形成BF。而當(dāng)兩種或兩種以上抗菌藥物聯(lián)用時(shí)，能夠破壞BF，使BF狀態(tài)的菌株更容易被殺死?？咕嚯牡姆肿有　⒆饔脵C(jī)制獨(dú)特、不易產(chǎn)生耐藥性且生物功能廣泛，能夠降低BF相關(guān)基因的表達(dá)，阻止細(xì)胞外化合物的產(chǎn)生，抑制細(xì)菌BF的形成[22]。細(xì)菌所要黏附表面的形貌、電荷、官能團(tuán)類型、粗糙度等都會(huì)影響B(tài)F的形成?？赏ㄟ^使用防黏性涂層或含藥物涂層、具有抗生物被膜和抗菌性能的固有生物活性材料等去抑制BF的形成。

最新研究發(fā)現(xiàn)，酶制劑、噬菌體等可用于抑制BF的形成。如酶制劑能靶向作用于BF胞外基質(zhì)，降解BF中群體感應(yīng)系統(tǒng)信號(hào)分子，阻斷細(xì)胞間的交流，從根本上清除BF[23]。噬菌體能夠感染細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物，編碼胞外多糖解聚酶和裂解酶去破壞BF基質(zhì)，且自身可以進(jìn)入BF內(nèi)部裂解細(xì)菌，抑制BF的形成以及破壞已形成的BF[24-25]。所以可根據(jù)條件的不同，選擇合適的生物化學(xué)方法對(duì)生物被膜進(jìn)行清除。

4.3 中藥清除方法

中藥單一成分或其混合提取物，如黃芩苷、銀杏酚酸、魚腥草素鈉、苦參堿、桑螵蛸的脂質(zhì)提取物、大黃提取物等都有利于BF的清除。研究表明黃芩苷能夠改變細(xì)菌基因和蛋白質(zhì)表達(dá)[26]，抑制BF形成。黃芩苷單體可以抑制泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌BF的形成，當(dāng)其與美羅培南、亞胺培南等抗生素聯(lián)用后，效果更好[27]。桑螵蛸的脂質(zhì)提取物可以減少細(xì)菌黏附、破壞生物被膜結(jié)構(gòu)、裂解細(xì)菌[28]。此外，對(duì)生物被膜有抑制或清除作用的中藥還有很多。尋找合適的中藥及其提取物對(duì)生物被膜進(jìn)行清除有很重要的研究意義。

5 展望

當(dāng)在極端環(huán)境或抗生素作用下，細(xì)菌即通過群體感應(yīng)、環(huán)二鳥苷酸等系統(tǒng)的調(diào)控，進(jìn)行黏附聚集等過程，形成成熟BF以進(jìn)行自我保護(hù)，導(dǎo)致耐藥性明顯增強(qiáng)，且不易被清除，給養(yǎng)殖業(yè)、食品行業(yè)及人類健康造成威脅。目前對(duì)于調(diào)控細(xì)菌BF形成的機(jī)制、如何清除BF等方面尚需深入研究。為了更好地控制BF造成的感染，可以把研究深入到分子水平，尋找更多能夠作用BF的抑制劑，并對(duì)抑制機(jī)制進(jìn)行深入研究。聯(lián)合使用物理、生物化學(xué)、中藥等各種方法，從而徹底治療細(xì)菌BF感染性疾病，以及防止BF對(duì)食品加工行業(yè)造成污染事件的發(fā)生。