單核細胞增生李斯特菌檢測技術(shù)研究進展

史文靜，委慧玲，齊玉梅，孫亞楠，薛慧文，茍惠天

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

單核細胞增生李斯特菌(簡稱單增李斯特菌)(Listeriamonocytogenes,LM)是一種兼性厭氧的食源性病原菌，可以造成很多食品污染，包括酸奶、奶酪、肉類、火腿、煙熏肉、家禽、海鮮和蔬菜產(chǎn)品等[1]。該菌在食品生產(chǎn)和儲存過程中(如低pH、冷藏和高鹽濃度)都可以存活和繁殖，對即食食品構(gòu)成嚴(yán)重威脅。感染單增李斯特菌會出現(xiàn)肌肉酸痛、發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重者表現(xiàn)為敗血癥和腦膜炎，孕婦發(fā)生早產(chǎn)、死產(chǎn)或流產(chǎn)。目前已知單增李斯特菌主要有13種血清型，血清型1/2a、1/2b和4b是引起食源性感染的主要原因[2]。鑒于單增李斯特菌對公共安全造成的嚴(yán)重危害，很多國家對食品中單增李斯特菌的檢測限有明確規(guī)定。

單增李斯特菌的檢測方法有平板菌落計數(shù)法、生化試驗法、分子生物學(xué)檢測法和免疫分析法。這些方法靈敏度高，操作性較強，但耗時較長[3]，不適合現(xiàn)場直接檢測。檢測需經(jīng)歷富集、分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化鑒定、溶血試驗、協(xié)同溶血試驗等，最終才能分離鑒定出單增李斯特菌[4]。市場需要廉價、快速、可重復(fù)和易于使用的方法。因此，越來越多的研究集中在如何提高檢測靈敏度和縮短檢測時間上。

1 免疫學(xué)檢測法

1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是一種免疫學(xué)檢測技術(shù)，將抗原和抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用結(jié)合[5]。ELISA相對于傳統(tǒng)檢測方法耗時較短(30 h～50 h)，可用于診斷和檢測各種病原微生物引起的傳染病和寄生蟲病，檢測食品中有害成分的殘留以及在生物醫(yī)學(xué)等多種領(lǐng)域發(fā)揮作用。ELISA的不足之處是抗原抗體反應(yīng)具有專一性，必須為每個目標(biāo)物建立特殊的檢測試劑和檢測方法，檢測時需要足量的病原體才能提供有效的結(jié)果。

雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗對單增李斯特菌的最低檢測限可達1×105CFU/mL，且與常見食源性病原菌無交叉反應(yīng)[6]。該方法特異性較好，且批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%，具有良好的重復(fù)性。用單增李斯特菌單克隆抗體和多克隆抗體成功建立的雙抗體夾心ELISA，具有良好的靈敏度、特異性和重復(fù)性，可為單增李斯特菌的監(jiān)測提供技術(shù)支持。但是，如果在加工或預(yù)處理食品時，抗原受到破壞，測試結(jié)果的準(zhǔn)確性會受到一定影響，且制備單克隆抗體的成本較高。

1.2 熒光免疫分析法

酶聯(lián)熒光分析法是將抗原與單克隆抗體結(jié)合，再將結(jié)合有堿性磷酸酶的抗體與相應(yīng)的抗原結(jié)合發(fā)生顏色反應(yīng)[7]。通過檢測熒光強度(熒光強度與抗原含量成正比)，可以計算出樣品中抗原的數(shù)量。酶聯(lián)熒光分析法比酶聯(lián)免疫吸附法靈敏，省去顯色反應(yīng)并縮短反應(yīng)時間，但成本更高。目前主要應(yīng)用在自動酶聯(lián)熒光免疫檢測系統(tǒng)上。

有研究開發(fā)了一種基于新型殼聚糖-纖維素納米晶體數(shù)控(CNC)膜的熒光夾心免疫分析法，提高了細菌生長過程中捕獲抗原的能力[8]。與常規(guī)方法相比，將CNC膜捕獲p60蛋白特異性抗原與熒光檢測相結(jié)合，使分析時間從24 h降到12 h，檢測限低至1×102CFU/mL。此外，用單克隆抗肽類藥物共價固定在CNC膜上，保證了該方法的高特異性。且熒光檢測靈敏度高，允許在12 h內(nèi)進行單增李斯特菌的檢測，與其他5種常見的食源性病原菌(沙門氏菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌)無交叉反應(yīng)。熒光免疫分析法的主要不足是應(yīng)用范圍小，自身能夠發(fā)出熒光并形成熒光測量系統(tǒng)的物質(zhì)相對較少。

1.3 免疫磁性分離技術(shù)

當(dāng)食物樣本中目標(biāo)細菌的數(shù)量較少，且由于食品成分的背景干擾和非目標(biāo)菌群的負面影響，對食品樣品進行李斯特菌的檢測很難得到準(zhǔn)確的結(jié)果。因此，建立高效的前處理技術(shù)對食品微生物的檢測至關(guān)重要?；诿庖叽蓬w粒(IMPs)的免疫磁性分離(immunomagnetic seperation，IMS)技術(shù)具有特異性高、分離效率高的顯著優(yōu)勢，是一種分離富集靶菌的強大體系。

一種基于生物素暴露的IMS與核酸橫向流動生物傳感器相結(jié)合[9]，當(dāng)細菌數(shù)量低于1×104CFU/mL時，可捕獲到90%以上的單增李斯特菌，且抗體的使用劑量大大減少。用生物素接觸IMS結(jié)合十二烷基硫酸鈉(SDS)、疊氮溴化丙啶和多重實時PCR快速、靈敏地檢測牛奶中的鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的方法[10]。添加牛奶基質(zhì)樣品中的金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的檢測限為10 CFU/mL，整個檢測過程在9 h內(nèi)鑒定出活菌。IMS預(yù)處理可以提高靶菌濃度，與各種檢測方法(基于免疫學(xué)的方法、基于核酸的方法、熒光的方法、生物傳感器等)相結(jié)合，可有效縮短分析時間，提高檢測靈敏度，在食品細菌檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。在未來的研究中，除了抗體外，還需要尋找具有較強親和力和識別性的活性配體。消除食品成分對IMS的干擾，建立標(biāo)準(zhǔn)的操作程序，對提高某些食品中不同微生物的富集也至關(guān)重要。

2 分子生物學(xué)檢測方法

2.1 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)是一種有效的病原體特異性分子生物學(xué)檢測方法。LAMP反應(yīng)是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異性引物，在具有鏈置換活性的DNA聚合酶的作用下，恒溫條件進行擴增[11]。LAMP 是一種創(chuàng)新的基因擴增工具，簡單，無需復(fù)雜的設(shè)備進行熱循環(huán)，所有鏈置換反應(yīng)發(fā)生在等溫條件下，但其固有缺點是不能區(qū)分活菌和死菌。

磷脂酰膽堿-磷脂酶C基因的LAMP，通過形成DNA復(fù)合物和金納米顆粒/DNA探針復(fù)合物進行比色檢測[12]。整個檢測過程可在1 h內(nèi)完成，方法簡單、設(shè)備獨立，通過比色可視化快速定量，表明對即食食品現(xiàn)場檢測的可能性。用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(RT-LAMP)檢測肉類中的單增李斯特菌，證明RT-LAMP技術(shù)可以區(qū)分活菌和死菌[13]。在最佳條件下，RT-LAMP擴增產(chǎn)物在60 min內(nèi)可見白色沉淀。市場上的肉制品上有時會附著大量的死細菌，當(dāng)使用LAMP時，可能會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，RT-LAMP可以準(zhǔn)確的檢測出活菌，可以避免因食品中存在死菌而導(dǎo)致假陽性結(jié)果。隨著研究的深入，LAMP與其他方法聯(lián)合使用，使反應(yīng)條件和準(zhǔn)確性得到了優(yōu)化和提高，拓寬了LAMP技術(shù)在實際疾病臨床診斷中的應(yīng)用，促進了試劑盒的生產(chǎn)，對感染性疾病的監(jiān)測和控制具有重要意義。

2.2 表面增強拉曼散射

表面增強拉曼散射(surface enhanced raman spectroscopy,SERS)是一種新型的光譜快檢技術(shù)[14]，由于其快速、無損，不需要樣品制備等優(yōu)點，在生物和化學(xué)分析中具有廣闊的應(yīng)用前景。該方法分為直接SERS，間接SERS以及SERS與其他技術(shù)結(jié)合，目前使用最多的是SERS與其他技術(shù)結(jié)合以檢測食源性致病菌。

磁輔助SERS標(biāo)記免疫測定法，用游離抗體標(biāo)記和葡萄球菌蛋白A(PA)-SERS標(biāo)記定位識別的方法對細菌進行檢測[15]。該方法快速、可靠、操作方便，在食品安全監(jiān)測和傳染病診斷方面具有很大的潛力。SERS的側(cè)流生物傳感器，結(jié)合聚合酶擴增可檢測單增李斯特菌和腸道沙門氏菌[16]。核殼納米粒子被用于SERS-LF，通過測量SERS標(biāo)記的特征峰強度，實現(xiàn)了高靈敏度的定量檢測。在最佳條件下，單增李斯特菌的檢出限為27 CFU/mL，腸道沙門氏菌的檢出限為19 CFU/mL。因此，SERS與其他技術(shù)結(jié)合可以快速、定量檢測食品中多種細菌病原體，并可以提供單分子水平的無損檢測和超靈敏檢測，具有較高的特異性和適用性。

2.3 重組酶聚合酶擴增

重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification,RPA)因其具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)點，成為很有前景的檢測方法。與LAMP相比，它需要更低的反應(yīng)溫度和更少的底物。

基于RPA技術(shù)的單增李斯特菌快速檢測方法[17]，針對單增李斯特菌的基因組序列設(shè)計特異性引物，通過優(yōu)化反應(yīng)體系，實現(xiàn)了單增李斯特菌的快速檢測。 重組酶聚合酶等溫擴增結(jié)合側(cè)流試紙條(RPA-LFS)體系檢測單增李斯特菌[18]消除了引物二聚體中的假陽性信號，可在25 min內(nèi)完成檢測。RPA在37℃～42℃擴增目標(biāo)DNA，不需要熱循環(huán)，對單增李斯特菌有較高的特異性，其靈敏度高于LAMP檢測限，可與基于PCR或qPCR的方法相媲美。重組酶聚合酶等溫擴增與其他檢測技術(shù)聯(lián)合使用具有速度快、靈敏度高、對設(shè)備和培訓(xùn)人員的依賴性小等優(yōu)點。然而，其簡單性帶來了內(nèi)在的、不可忽視的風(fēng)險，即引物二聚體發(fā)出的假陽性信號，因此克服該缺點將會大大提高該方法的應(yīng)用。

3 生物傳感器

3.1 電化學(xué)生物傳感器

生物傳感器經(jīng)過多年的發(fā)展，憑借其靈敏度高，選擇性好，準(zhǔn)確度高且成本低，被廣泛應(yīng)用于食品中微生物的檢驗。一種基于plcA基因的電化學(xué)DNA生物傳感器，用循環(huán)伏安法和電化學(xué)阻抗法檢測單增李斯特菌[19]。采用固相萃取技術(shù)，將-NH2固定在ssDNA探針上，與目標(biāo)DNA進行雜交。該傳感器的LOD低至13.7 fg/μL。與已有的生物傳感器相比，具有較低的檢測限。一種新型電化學(xué)生物傳感器可同時檢測單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌[20]。該生物傳感器用兩種細菌產(chǎn)生的蛋白酶對特定肽的水解活性，不需要DNA提取或擴增技術(shù)，在1 min內(nèi)即可完成檢測。有研究構(gòu)建了一種快速檢測細菌的電化學(xué)生物傳感器，該傳感器基于電極間銀絲的簡易合成，選擇細菌的16SrRNA高變區(qū)作為標(biāo)記基因。引入電化學(xué)信號，提高電化學(xué)檢測的靈敏度。這種新型電化學(xué)生物傳感器具有結(jié)構(gòu)簡單、速度快、信噪比高等優(yōu)點，在食品安全監(jiān)測和臨床診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景。電化學(xué)生物傳感器可以利用不同類型和形式的納米材料或納米復(fù)合材料，通過不同的策略提高檢測機制的靈敏度，提供更好的檢測限。

3.2 其他傳感器

一種基于磁小體的生物傳感器用于從食物樣本中快速、靈敏、特異地檢測單增李斯特菌[21]。通過提取磁小體，直接與抗李斯特菌溶血素抗體結(jié)合，后經(jīng)光譜確證。該傳感器在水和牛奶樣品中的檢出限均為101CFU/mL，顯示了該傳感器的靈敏度。用一次性電極作為表面換能器，特異性識別單增李斯特菌p60蛋白和李斯特菌的單克隆抗體和多克隆抗體，該免疫傳感器已成功地應(yīng)用于加標(biāo)牛奶樣品，為食物中單增李斯特菌的實際檢測提供了一種可行的方法。用基于生物電識別分析的細胞生物傳感器技術(shù)和EMBIO公司開發(fā)的便攜式設(shè)備(生物電診斷設(shè)備) ，將單增李斯特菌同源抗體插入非洲綠猴腎細胞膜進行膜工程[22]。該生物傳感器能夠在濃度低至102CFU/mL的情況下3 min快速檢測病原體，比大多數(shù)現(xiàn)有的基于生物傳感器的方法具有更高的靈敏度。此外，與其他李斯特菌以及大腸埃希氏菌沒有交叉反應(yīng)，這表明生物傳感器對單增李斯特菌具有顯著的特異性。研究發(fā)現(xiàn)，生物傳感器方法的優(yōu)點包括功能多樣、成本低、識別率高、靈敏度高、智能化、微型化等，故成為食品安全快速檢測研究領(lǐng)域的重點研究對象。

4 結(jié)論

近年來，由單增李斯特菌引起的食源性疾病逐年增多，人們對該菌的檢測和防控愈發(fā)關(guān)注。傳統(tǒng)檢測方法準(zhǔn)確，但耗時較長，且在實際應(yīng)用中受制較多，因此人們致力于研制該菌的快速檢測技術(shù)。免疫學(xué)方法簡便快捷，對抗體制備具有較高要求，易受其他雜菌干擾。分子生物學(xué)法快速、準(zhǔn)確，但是生物標(biāo)記的成本較高。生物傳感器具有靈敏度高、選擇廣泛、速度快、實時檢測和無損傳感等優(yōu)點，但檢測成本也是居高不下。以上技術(shù)雖有諸多弊端，但是隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，它們將得到不斷完善。特別是隨著近年來不同學(xué)科之間融合加強，相信將有更多的快速檢測技術(shù)會被應(yīng)用到單增李斯特菌的檢測中來。