新疆鐵門關(guān)市部分地區(qū)散養(yǎng)奶牛嗜血支原體和泰勒蟲感染情況的調(diào)查

郎 平，陳宏偉，姜 云，羅慧麗，趙愛云，張秀萍*，齊 萌*

(1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300； 2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第二師畜牧獸醫(yī)工作站，新疆鐵門關(guān) 841023)

嗜血支原體病和泰勒蟲病均可引起牛高熱、貧血、黃疸和消瘦等臨床癥狀，導(dǎo)致牛生長發(fā)育遲緩、產(chǎn)奶量和生產(chǎn)性能降低，給養(yǎng)牛業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。已報(bào)道感染牛的嗜血支原體主要有溫氏支原體(Mycoplasmawenyonii)和牛嗜血支原體待定種(CandidatusMycoplasmahaemobos)[1]；泰勒蟲主要有環(huán)形泰勒蟲(Theileriaannulata)、瑟氏泰勒蟲(Theileriasergenti)和中華泰勒蟲(Theileriasinensis)[2]。在波斯尼亞和黑塞哥維那2例牛巴貝斯蟲病例中，1頭發(fā)病牛體表收集到8只蜱，用PCR法在其2份DNA樣本中均檢測出分歧巴貝斯蟲(Babesiadivergens)，8份DNA樣本中均檢測出M.wenyonii，發(fā)現(xiàn)蜱可攜帶M.wenyonii[3]。為了解鐵門關(guān)市散養(yǎng)奶牛嗜血支原體和泰勒蟲感染情況，用PCR檢測該市3個(gè)鎮(zhèn)散養(yǎng)奶牛血液DNA樣本并進(jìn)行種類鑒定，以期為新疆地區(qū)奶牛血液性疾病的防治提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血樣采集 2020年9月至12月，在鐵門關(guān)市雙豐鎮(zhèn)、天湖鎮(zhèn)和河畔鎮(zhèn)隨機(jī)選取1歲～2歲奶牛85頭，用EDTA抗凝管經(jīng)頸靜脈采集血樣3 mL～5 mL，依次編號后置放有冰袋的泡沫箱內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，4℃冷藏保存，72 h內(nèi)提取DNA。

1.1.2 主要試劑 血液基因組DNA提取試劑盒，上海萊楓生物科技有限公司產(chǎn)品；2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)、DNA Marker DL 2 000，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 Sorvall Legend Micro 17型微量離心機(jī)，Thermo Scientific公司產(chǎn)品；MC proS型梯度PCR儀，Eppendorf公司產(chǎn)品；DYY-7C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、JY系列電泳槽，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 提取血液樣本DNA 所有奶牛抗凝血液樣本使用移液器吸取200 μL，按試劑盒操作步驟提取100 μL血液DNA，置-20℃冰箱中保存待測。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)牛溫氏支原體特異性引物，兩輪PCR反應(yīng)程序均為94℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)(94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min)，72℃延伸10 min；參照文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)牛嗜血支原體未定種特異性引物，反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)(94℃ 30 s，58℃ 2 min，72℃ 1 min)，72℃延伸10 min；參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)環(huán)形泰勒蟲特異性引物，反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)(94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min)，72℃延伸10 min；參照文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)T.sergenti特異性引物，反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)(94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 1 min)，72℃延伸10 min(表1)。

PCR反應(yīng)體系均為25 μL：2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL，ddH2O 10.9 μL，上、下游引物各 0.3 μL，DNA 模板1 μL。每次PCR擴(kuò)增均設(shè)陽性對照和陰性對照，陽性對照樣本為M.wenyonii、CandidatusM.haemobos、T.annulata和T.sergenti，由塔里木大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室鑒定保存，陰性對照為雙蒸水(表1)。

表1 引物序列和目的片段

1.2.3 序列對比和系統(tǒng)發(fā)育分析 將PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物送至蘇州金唯智科技有限公司進(jìn)行雙向測序。在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast搜索，下載參考序列，用Clustalx 2.1軟件比對和校準(zhǔn)序列。用Mega 7.0軟件選擇鄰接算法中Kimura-2-parameter模型，構(gòu)建種系發(fā)育進(jìn)化樹，其可靠性用Bootstrap分析檢測，進(jìn)行1 000個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 嗜血支原體和泰勒蟲PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果

基于牛M.wenyonii的SSUrRNA基因位點(diǎn)，對85份血液樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的條帶大小為738 bp，13份與陽性樣本目的條帶相一致(圖1)?；谂andidatusM.haemobos的SSUrRNA基因位點(diǎn)，對85份血液樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的條帶大小為500 bp，11份與陽性樣本目的條帶相一致(圖2)?；赥.annulata的30ku基因位點(diǎn)，對85份血液樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的條帶大小為721 bp，7份樣本與陽性樣本目的條帶相一致(圖3)?；谏咸├障xMPSP基因位點(diǎn)，對85份血液樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，未檢測到目的條帶。

2.2 奶牛嗜血支原體和泰勒蟲PCR檢測結(jié)果

對85份奶牛血液樣本DNA進(jìn)行檢測，嗜血支原體和泰勒蟲的PCR總陽性率為23.5%(20/85)，M.wenyoniiPCR陽性率為10.6%(9/85)，CandidatusM.haemobosPCR陽性率為3.5%(3/85)，M.wenyonii和CandidatusM.haemobos混合感染PCR陽性率為1.2%(1/85)，牛CandidatusM.haemobos和T.annulata混合感染病原PCR陽性率為4.7%(4/85)，M.wenyonii、CandidatusM.haemobos和T.annulata混合感染PCR陽性率為3.5%(3/85)(表2)。天湖鎮(zhèn)和河畔鎮(zhèn)奶牛血液病原感染率分別為39.5%(15/38)和26.3%(5/19)，雙豐鎮(zhèn)奶牛未檢測出血液病原陽性。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～16.樣品編號；N.陰性對照；P.陽性對照 M.DNA Marker DL 2 000; 1-16.Sample numbers; N.Negative control; P.Positive control

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～15.樣品編號；N.陰性對照；P.陽性對照 M.DNA Marker DL 2 000; 1-15.Sample numbers; N.Negative control; P.Positive control

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～7.樣品編號；N.陰性對照；P.陽性對照

2.3 嗜血支原體和泰勒蟲基因堿基序列分析

13條M.wenyonii序列經(jīng)比對分析，鑒定出3種基因型，1種為已知基因型，命名為Mw-1228 (n=11)，與重慶牛源M.wenyonii分離株序列(GenBank登錄號：FJ375309)同源性為100%；2種為新基因型，分別命名為Mw-1281 (n=1)和Mw-1270 (n=1)，與重慶牛源M.wenyonii分離株序列(FJ375309)在不同的堿基位點(diǎn)有1個(gè)堿基差異，同源性為99.9%。11條CandidatusM.haemobos序列經(jīng)比對分析，鑒定出3種基因型，1種為已知基因型，命名為CMh-1240(n=6)，與古巴牛源CandidatusM.haemobos分離株序列(MG948630)同源性為100%；2種為新基因型，分別命名為CMh-1274(n=4)和CMh-1242 (n=1)，分別與古巴牛源Can-didatusM.haemobos分離株序列(MG948630)有1個(gè)和9個(gè)堿基差異，同源性分別為99.8%和98.2%；7條T.annulata序列經(jīng)比對分析，鑒定出3種新基因型，分別命名為TLA-1278 (n=3)、TLA-1274 (n=2)和TLA-1275 (n=2)，TLA-1278和TLA-1274分別與新疆牛源T.annulata分離株序列(MF116148)和(MF116146)有4個(gè)和12堿基差異，同源性分別為99.3%和98.2%，TLA-1275則與荷蘭牛源T.annulata分離株序列(AF214896)有11個(gè)堿基差異，同源性為98.3%。

2.4 嗜血支原體和泰勒蟲的種系發(fā)育分析

進(jìn)化樹顯示3種M.wenyonii基因型序列與羊嗜血支原體(M.ovis)、羊嗜血支原體未定種(CandidatusM.haemovis)、豬嗜血支原體(M.suis)、羊駝嗜血支原體未定種(CandidatusM.haemolamae)和貓嗜血支原體未定種(CandidatusM.haemominutum)處于一個(gè)進(jìn)化支上；3種牛嗜血支原體未定種基因型序列與人嗜血支原體未定種(CandidatusM.haemohominis)、鼠嗜血支原體(M.haemomuris和M.coccoides)、犬嗜血支原體未定種(CandidatusM.turicensis)和貓嗜血支原體(M.haemofelis)處于另一個(gè)進(jìn)化支上。T.annulata的TLA-1278序列與T.annulata參考序列形成一個(gè)亞群支，而T.annulata的TLA-1274和TLA-1275序列與T.annulata參考序列形成一個(gè)亞群支。

表2 鐵門關(guān)市散養(yǎng)奶牛嗜血支原體和泰勒蟲感染情況

空心和實(shí)心的圖標(biāo)(圓形和三角形)分別表示本研究獲得的已知基因型和新基因型序列 Hollow and solid ICON (triangles and circles) represent known genotypes and new genotypes obtained in this study,respectively

黑色菱形表示本研究獲得的新基因型序列 The black diamond represents the new genotype sequences obtained in this study

3 討論

在世界范圍內(nèi)，牛普遍感染嗜血支原體[8-10]。本研究中，嗜血支原體感染率為23.5% (20/85)，M.wenyonii和CandidatusM.haemobos感染率分別為15.3% (13/85)和12.9% (11/85)，不同地區(qū)牛感染嗜血支原體有差異性，可能與地理環(huán)境、養(yǎng)殖條件、媒介種類分布等因素存在密切關(guān)系。新疆南疆奶牛泰勒蟲感染率為22.5% (111/493)，T.annulata和T.sergenti感染率分別為22.5% (111/493)和0.6% (3/493)[11]。本次調(diào)查檢測出的7份泰勒蟲樣本均為T.annulata，未發(fā)現(xiàn)T.sergenti，說明T.annulata因蜱種類的分布而存在區(qū)域性遺傳進(jìn)化特征。

新疆南疆地區(qū)為典型的荒漠與半荒漠氣候，蟲媒分布范圍廣、種類多，如亞洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticum)是該地區(qū)T.annulata的主要傳播媒介之一。牛在散養(yǎng)條件下，更易遭受蟲媒的侵襲，應(yīng)進(jìn)一步開展鐵門關(guān)區(qū)域內(nèi)蟲媒傳播病原的動力學(xué)調(diào)查，同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)對牛源蟲媒的防治和滅殺。